מאמר שיטה

הדור של כימאריק אקאוללס עם הגפיים הספאוזהות באמצעות השתלה עובריים

DOI:

10.3791/60156

⸱

29 בינואר 2020

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרה זו של פרוטוקול זה היא לייצר כימאריק axo, עם פלואידי forelimbs נגזר מרקמת תורם Cas9-מוטוניים באמצעות שיטות השתלת רקמות עובריים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קבוצה ההולכת וגדלה של טכניקות גנטיות ומשאבים מאפשרים לחוקרים לחקור את המקורות המולקולריים של היכולת של מינים מסוימים של סלמנדרות, כגון axo ls, לחדש את הגפיים כולו כמבוגרים. כאן, אנו טכניקות המתאר המשמש כדי ליצור כימאריק axo, עם Cas9-מוטאואיד פלואידי שניתן להשתמש בהם לחקר תפקוד גנים ונאמנות של התחדשות הגפיים. אנו משלבים מספר טכניקות embryological וגנטיות, כולל הדור פלואידי באמצעות הפעלת חוץ גופית, crispr/Cas9 מוטארסיס, והשתלת רקמות לפרוטוקול אחד כדי לייצר מערכת ייחודית עבור ההקרנה גנטית הפלואיד באורגניזם מודל של התחדשות. אסטרטגיה זו מקטינה את מספר בעלי חיים, מרחב, וזמן הנדרש ניתוח פונקציונלי של גנים התחדשות גפיים. זה גם מאפשר את החקירה של פונקציות ספציפיות להתחדשות של גנים שעשויים להידרש לתהליכים חיוניים אחרים, כגון אורגאוגנזה, רקמה מורפולגנזה, ותהליכים עובריים חיוניים אחרים. השיטה המתוארת כאן היא פלטפורמה ייחודית לניהול ההקרנה הגנטית של הפלואיד במערכת מודל בעלי חוליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחינה היסטורית, השתלת רקמות עובריים בדו-חיים הייתה טכניקה חשובה לחקר מנגנונים בסיסיים של ביולוגיה והתחדשות התפתחותית. האקנוספל, זן של סלמנדרה, בעל יכולת מרשימה להתחדש רקמות ומבנים מורכבים כגון גפיים ואיברים לאחר פציעה או קטיעה. כמו כן, הם יכולים לקבל, ללא דחייה, שתלי רקמות מאנשים אחרים בשלבי עובריים, קטינים ובוגרים1,2,3. מחוזות עוברים המייצרים מבנים שלמים כגון גפיים, זנבות, עיניים וראשים, ורקמות ספציפיות יותר, כגון neuroectoderm ומסוענים, ניתן ליצור מושתל בין העוברים כדי לייצר בעלי חיים כימריים1,2,4,5,6. במשך כמעט מאה, מחקרים של בעלי חיים כאלה בצ סיפקו תובנות מכרעת להתחדשות, רקמת בידול, גודל בקרת, והפרנינג1,7,8.

במהלך העשור האחרון, מחקרים מאוד מעבר להתחדשות רקמות הפיקו תובנות לתוכניות גנטיות בבסיס סלמנדרה התחדשות9,10,11,12,13. מחקרים אלה הוסיפו לרשימה המתרחבת של גנים מועמדים אשר, עד כה, אינם מאופיינים במידה רבה בהקשר של התחדשות. טכניקות ממוקדות של מוטאוזיס, כגון crispr/Cas, עכשיו לאפשר את החקירה של גנים כאלה, וגישות גנטיות כאלה מאוד הקלה על ידי ברצף האחרונות והרכבה של הגנום axol גדול14,15,16.

ביקשו לפתח טכניקות שיחד עם הביולוגיה ההתפתחותית הקלאסית עם טכנולוגיה גנטית חדשה למטרת ניתוח מנגנוני ההתחדשות. שיטות ליצירת עוברי הפלואיד וסלמנדרות אחרים הוקמו במשךעשרותשנים. בעוד טכניקות אלה כבר זמן רב ציין להיות יתרונות של סלמנדרות כמו אורגניזמים מודל גנטי18, כמה מחקרים גנטיים עוקבות שילבו חיות פלואידי. אנו משתמשים בפעילות חוץ גופית באקסון כדי לייצר עוברי החדואיד המשמשים כתורמי רקמות להשתלת19. באמצעות עוברים הנושאים סמנים גנטיים פלורסנט, המציאו שיטות אמינות ליצירת איברים הנגזרים כמעט לחלוטין מרקמותהתורמים(איור 1א). על-ידי שילוב שתי הטכניקות הללו, נעלנו את הטבליות העובריים המאוחרת הקשורות להפלואידיות, ומאפשרת ייצור של איברים מפותחים לחלוטין, מושתלים הפלודואיד (איור 1ב', איור 1ב', איור 2).

על-ידי ביצוע CRISPR/Cas-תיווך מוטגנזה בעוברי הדואיד לפני השתלה כדי ליצור כימאריק axo, עם הגפיים מוטציה המטה, אנו עשויים לחקור את הפונקציה גנים במיוחד בהקשר של פיתוח גפיים והתחדשות. זה מאפשר הצלה של איברים של פנוטיפים מוטנטים קטלני להיות עובריים. בעוד crispr/Cas מיקרוהזרקה יכול ליצור בעלי חיים שהם מאוד מוטנטים, בעלי חיים כאלה הם בדרך כלל פסיפס מאוד, עם מידה מסוימת של החזקת אללים ומגוון של מוטציות נפרדות באתרים ייעודיים14,20. Crispr מבוססי מוטגנזה בתאי פלואידי מגביר את החדירה של אלל אובדן מוטציות בודדות של הפונקציה, כפי שהם לא יכולים להיות רעולי פנים על ידי שמור אלל קלד אלטלס. מסיבה זו, הקרנת מבוסס crispr בקווי התא הפלואיד משמש יותר ויותר לחקור את הבסיס הגנטי של תהליכים סלולריים רבים21,22,23. על ידי שילוב crispr מבוסס שושלת היוחסין עם האיבר הגוף שלנו ניצן השתלת פרוטוקולים, הגישה המתוארת כאן יכול לשמש פלטפורמה עבור מסכי גנטיות פלואידי בחיות חיים20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליכים ניסיוניים המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת ייל (IACUC, 2017 – 10557) והיו בהתאם לכל המדיניות וההנחיות הפדרליות השולטות בשימוש בבעלי חוליות. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על גבי אמסטומה מקסינום במתקני אוניברסיטת ייל.

1. הדור העובר של דיפלואיד

  1. השג העוברים GFP + דיפלואידי לשמש מארחי השתל באמצעות ההזדווגות הטבעית באמצעות אחד או שני הורים GFP של24.
  2. לאסוף ביצים טריים הונחו ביצה ומניחים אותם בתוך מסננת מתכת.
  3. לשטוף את הביצים ביסודיות עם 40% הפתרון של Holtfreter (20 מ"מ היאl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM נחקו3, 0.2 Mm cacl2, 4 מ"מ mgso4, pH כדי 7.4).
  4. הניחו את הביצים בתמיסת הולטסטר ה40 טרייה והחנות ב-12 ° c.
    הערה: העוברים Diploid צריך תמיד להיות מושגת לפני המעבר לדור העובר ההפלואיד.

2. דור העובר של הפלואיד

  1. הכנה לתורמים מגיים נשית
    1. 48 h לפני ניצוח על הפעלת חוץ גופית, מורדם בוגרת מינית לבן או לבן/RFP נקבה האקסון על ידי הטבילה ב 1 g/L HEPES-באגירה MS-222 ב 40% הולטסטר פתרון25.
    2. ודא כי בעל החיים מורדם לחלוטין לאחר כ 30 דקות של טבילה על ידי צובט בחוזקה זנבו בין האגודל לאצבע. בעלי חיים מורדם לחלוטין. לא יגיבו פיזית לצביטה
    3. הכינו פתרון של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) המכיל 10,000 U/mL ב תמיסת מלח סטרילית.
    4. באמצעות 30 גרם אינסולין מזרק, להזריק 0.15 CC של HCG (1,500 יחידות) לתוך השרירים האחוריים של הגוף המורדם בזווית 45 ° על קו האמצע כדי למנוע מגע עם חוט השדרה.
    5. החזר את הנקבה לרענן 40% את הפתרון של הולטסטר ומקום במקרר של 8 עד 12 ° c.
    6. לאחר 48 h, החזר את הנקבה לטמפרטורת החדר. מניחים כמה אבנים או מפעלי פלסטיק במיכל שלה כמשטחים עבור הנחת ביצים.
      הערה: הנקבות הזריקו עם HCG לעתים קרובות הפקדות מקרים ג'לי ריקים במשך מספר שעות לפני הנחת הביצים.
    7. להסיר את האבנים או צמחי פלסטיק לאחר הנקבה החלה בעקביות הנחת ביצים.
    8. לאפשר לנקבה לשבת במיכל הריק במשך 30 דקות עד 1 h.
      הערה: הסתרת חומרים בעלי החיים להטיל ביצים תאפשר השליטה הדוקה יותר של אוסף oocyte.
  2. אוסף מגיים לגברים
    1. בעוד הביצית של הנקבה מונח נתקע, מורדם בוגרת מינית GFP + הגברי לשמש כתורם זרע, כמו בשלב 2.1.1.
    2. על גבו מגבות נייר לח. מתחת למיקרוסקופ מבתר
    3. אם הניסויים מrighthanded, הצב את קצהו של הפיפטה הP1000 בבסיס הסוגר בידו הימנית.
    4. הנח את האצבע השמאלית ואת האגודל של יד שמאל 2-3 ס מ rostral לאגן. לסחוט בעדינות את החיה תוך הזזת האצבעות לעבר הרגליים האחוריות כדי לשטוף דגימות שתן ספרמיק.
    5. לאסוף כל אחד שנשטף מתוך קלואקה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בודדים. חזור על תהליך זה כדי לאסוף 6 כדי 10 דגימות.
    6. פיפטה 5.0 μL מכל מדגם על צלחת פטרי כדי לבדוק את איכות הזרע באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
      הערה: דגימות זרע מרוכז הם צבע לבן חלבי, בדרך כלל נע בין 5 עד 20 μL, ומאוחזרים בדרך כלל לאחר כמה, דגימות השתן של נפח גדול יותר של מיקרופון מופק. זרע יאסוף בתחתית הצינורות בדגימות נפח גבוה יותר כאשר הוא נותר ללא הפרעה. דגימות מרוכז של זרע בריא הם מאוד נעים ולאבד פעילות כמו הריכוז שלהם פוחתת. זכרים בריאים יכולים לייצר עד 50 μL של זרע מרוכז.
  3. אוסף מגיים נשי
    1. לאחר השגת ומאשרת דגימת זרע בריא, מורדם את האקסון הנשי HCG-מוזרק כמו בשלב 2.1.1.
    2. הניחו את הנקבה המומנת במלואה על מגבות נייר לח על גבה.
    3. לחלץ ביצים מופרות מן הנקבה באמצעות תנועה ביד דומה לזה בשלב 2.2.4.
    4. לאסוף את הביצים באמצעות מלקחיים רטוב ולהעביר אותם 10 ס מ צלחת פטרי. מתייחסים לביצים עם זרע שוקרן לקרינה בתוך 15 דקות של אוסף.
  4. הכנה למשחק גברי והפעלת חוץ גופית
    1. השתמשו בP10 או בפיפטה P20 לצינורות הזרע למעלה ולמטה, ולפרק את הגושים כדי ליצור השעיה הומוגנית.
    2. משוער את אחוז הזרע נעים על ידי הצבת מ0.5 μl שחרור של השעיית זרע לא מדולל על מכסה צלחת פטרי או שקופית זכוכית ובדיקה עם מיקרוסקופ הפוך.
    3. הוסף 9.5 μL של הפתרון של הצלצול המתוקן של 0.1 x של מארק (MMR; רשימת חומרים) לדוגמה הזאת כדי ליצור דילול זרע של 20x. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב.
    4. עם מיקרוסקופ הפוך, לספור את הזרע בשלושה 1.0 μL טיפות של 20x מדולל מדלל על כיסוי צלחת פטרי או הומוציטומטר כדי לאמוד את ריכוז הזרע של ההשעיה ללא מדולל.
    5. הכינו את הזרע להקרנה על ידי דילול של מדגם הזרע המקורי על 80,000 מואריח תאים/mL בסטרילי 0.1 x MMR.
    6. לספור את מספר הביצים שהתקבלו בתוך 15 דקות האחרונות. הוסף 0.5 μL של הזרע הטרי מדולל משלב 2.4.5 לכל ביצה לצלחת פטרי. השתמש בעצת הפיפטה כדי לפזר השעיה זו לשכבה עבה 1 מ"מ.
    7. באמצעות מתיחת פלסטיק, למקם את המדגם 4 ס מ מתוך נורות של 254 ננומטר החוצה. מבחינה גנטית להפעיל את הזרע על ידי הקרנת המדגם עם 800,000 uJ/mm2.
    8. שימוש בפיפטה P10, מצנף את התליה על הביצים הבלתי מופרות, ציפוי כל ביצה באמצעות 0.25-0.5 ליטר של זרע לקרינה. הניחו לביצים לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    9. לאחר 30 דקות, להציף את הביצים עם 0.1 x MMR. מיד הניחו את הביצים בחממה של 8 עד 10 ° c לזריקות למחרת או ב -18 ° c לזריקות בתוך 7 שעות הפעלת ההודעה (hpa).
    10. שימוש במלקחיים חדים 30 דקות לאחר הידרציה. מיד הניחו את הביצים בחממה של 8 עד 10 ° c לזריקות למחרת או ב -18 ° c לזריקות באותו היום.

3. הפלואיד מוטגנזה ואחזקה

  1. הזרקת מיקרו/Cas9
    1. עיצוב sgrnas באמצעות קריספרסריקה וסינתזה26,27.
    2. למגה-פלקס, הכינו מלאי של 5 sgRNAs (10 ng/μL עבור כל Sgrnas) ו Cas9 חלבון (1 μg/μL). להכין דילול 100-קיפול של מלאי זה (0.1 ng/μL עבור sgRNA, 10 ng/μL Cas9) עבור הזרקה. עבור גן יחיד, מוטזיס תדר מוטציה גבוהה, בצע את הפרוטוקול המתואר בעבר28.
    3. הכנס את העוברים בשלב תא בודד 7 hpa אם הוא מאוחסן ב 18 ° c או להזריק עוברים למחרת בשלב 2-8 תא אם הם מאוחסנים ב 8:10 ° c.
    4. העבר את העוברים ל-1.0 x MMR עם 20% פוליסוכרוז 400.
    5. אם תא בודד, להזריק כל העובר עם ירידה 5 nL של פתרון ההזרקה (כ 1/4 רדיוס של הביצה) המכיל מסה כוללת של 0.5 pg/sgRNA ו 50 pg Cas9 חלבון. אם רב-תאיים, הפץ מסה זו על-ידי הזרקת אמצעי אחסון קטנים יותר לתאים מרובים.
    6. לאפשר לעוברים להחלים ב polyסוכות 400 לפחות 4 h ומקסימום 18 h ב 18 ° c.
  2. הפלואיד מגורים העובר
    1. להעביר את העוברים ל 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה-antimycotic.
    2. הבית כל עובר בבאר הפרט של הצלחת 24-באר, כמו כמה ימותו או להתפתח באופן חריג. שמרו על 16/18 ° c. טמפרטורות נמוכות יותר יכולות לשמש כדי להאריך את ההתפתחות, במידת הצורך.
    3. החלף את המדיה עם חדש 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה-antimycotic בכל יום אחר.

4. הכנה לעובר מארח diploid

  1. שמרו על עוברים בציפוי ג'לי ב-12 עד 16 ° צ' עד שיגיעו לשלב 22 עד 26.
  2. לאסוף את העוברים המוכנים השתלה, למקם אותם בתוך מסננת (4 מ"מ גודל הרשת), ולשטוף בעדינות אותם עם 40% הפתרון של הולטסקטר.
  3. העבר את העוברים לתוך מסנן מסוננים 0.1 x MMR המכיל 1.5% אקונומיקה עבור עד 2 דקות. לחלוטין להטביע את העוברים בתמיסה אקונומיקה ומערבולת אותם בעדינות כדי להבטיח את ציפוי ג'לי עושה מגע מלא עם פתרון אקונומיקה להרוג את החיידקים נוכח העוברים.
  4. לאחר 2 דקות, לדלל את פתרון אקונומיקה המכיל את העוברים עם נפח שווה של מסנן-מעוקר 0.1 x MMR.
  5. בעדינות לשפוך את העוברים לתוך מסננת מחוטא (4 מ"מ גודל הרשת) ולשטוף את העוברים חמש פעמים עם מסנן-מעוקר 0.1 x MMR.
  6. מקום העוברים לתוך סטרילי 10 ס מ מנות פטרי עם 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה עבור דיכאליינג (פניצילין 100 יחידות/mL, סטרפטומיצין 100 μg/μL, 0.25 μg/mL, gentamicin 25 μg/mL).
  7. תחת stereomicroscope פלורסנט, להסיר את מעילים ג'לי וממברנות vitelline מ-GFP + עוברים באמצעות מלקחיים חדים (טיפ מידות 0.05 x 0.01 מ"מ2).
  8. העבר את עוברי ה-GFP לצלחת פטרי חדשה. מזער את כמות הנוזל המועבר מצלחת פטרי שבה הם היו מדוכא.
  9. לשטוף את העוברים המארחים GFP עם סטרילי 0.1 x MMR עם אנטיביוטיקה ארבע עד שש פעמים על מנת להסיר מזהמים.
  10. מניחים את העוברים הנקיים ב -4 ° c בלילה לפני השתלה.
    הערה: קירור העוברים הופך אותם הפרדה נוקשה ונקייה יותר של מזועור מאשר בר העור אפשרי.

5. הפלואיד-דיפלואיד כמירה

  1. הכנה לכלי כירורגי ומדיה
    1. להכין מנות הפעלה סטרילי כירורגי על ידי שפיכת בלוק 2% העלה ב 0.1 x mmr לתוך סטרילי 35 מ"מ מנות פטרי קל לאחוז. מלאו את מנות הפטרי באמצע הדרך עם הצמח.
    2. לאחר שהאגדה מתקררת, השתמש באזמל סטרילי כדי לקצץ באורך של 25 מ"מ, שוקת משופע בתוך הצמח כדי להחזיק את העוברים במקומם.
    3. למלא את הצלחת עם מדיה כירורגית סטרילי (0.1 x MMR עם anti-mycoplasma 2.5 μg/mL, אמפוריטיצין B 0.25 μg/mL, ו ציפרופלוקסאצין 10.0 μg/mL) ולהכניס למקרר ב 4 ° c.
  2. השתלת עובר
    1. מקום אחד בריא תורם הדואיד עם אחד או שניים בהתאמה בשלב מארח gfp + דיפלואידי העוברים בתוך שוקת של צלחת ההפעלה מקורר המכיל מדיה כירורגית (איור 3).
      הערה: בצע את ההליך בשלב קירור (10 ° צ' או נמוך) אם אפשר.
    2. השתמש שני עדינים במיוחד, מלקחייםאוטוקלתיים(טיפ ישר, טיפ מידות 0.05 x 0.02 mm 2) כדי להסיר את השכבות אאקטודרם מזועור מהמארח עם ניצן הגפיים ליד המרכז (איור 4).
      הערה: האזור השתלת רקמה מלבנית כוללת את ניצן הגפיים ולהאריך מן somite התשיעי אל החצי האחורי של הבליטה הזימים, על 2 מ"מ, לאורך הציר האחורי הקדמי. לאורך הציר הגסודורי, האזור הושתל משתרע על כ-1.5 מ"מ, כולל הסומטים אל מעבר לקצה הגחוני של בליטה הזימים. האזור מושתל כולל את כל לוחית לרוחב מזועור ואת החצאים לרוחב של הסומטים, ללא מפריע מתחת לעור. ראה איור 4 והווידאו הנלווה לקבלת פרטים.
    3. להניח בצד את הרקמה המארחת ולהסיר גיליון רקמה אופן בגודל מתוך תורם פלואידי באמצעות אותן שיטות.
    4. מניחים את גיליון רקמת התורמים של הפלואיד על האזור המקביל של העובר התורם.
    5. לאבטח את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם אוטוקלבד, זכוכית מלבנית השבר מזכוכית מכסה כתוש מיקרוסקופ ולחיצה עדינה לתוך גוף העובר מארח.
    6. הפוך את העובר תורם פלואידי על הצד השני שלה כדי לקצור את ניצן הגפיים עבור העובר הפונדקאי השני. חזור על שלבים ה5.2.2 באמצעות 5.2.5.
    7. הסר בזהירות את הרקמות המארחות הנותרות והעובר תורם ממנה.
    8. השאר את השתלים עם מעגן זכוכית במקום עבור 60-75 דקות, בדיקת כל 20 דקות כדי להבטיח כי הזכוכית לא חמק.
    9. לאחר שתלי רקמות לדבוק במלואו, להשתמש מלקחיים כדי לקלף לאט להסיר את העוגנים זכוכית השבר.
  3. תחזוקת כמירה
    1. העבירו את העוברים המנופה לתקשורת כירורגית טרייה ושמרו אותם ב -8 עד 12 ° צ' למשך הלילה כדי להחלים. בית בנפרד חרט עוברים מנופה בתוך 12 או 24 צלחות.
    2. אחרי 36-48 שעות, העבירו את העוברים המנופה לantimycotic סטרילי 0.1 x MMR לאנטיביוטיקה. האנטיביוטיקה החזקה בתקשורת הכירורגית גורמת לרעילות בעוברים מנופה לאחר 3 ימים.
    3. החלף את המדיה באמצעות מרענן 0.1 x ואנטיביוטיקה כל 2 עד 3 ימים.
    4. שמרו על העוברים המנופה ב -18 ° c עד שיוכלו להזין28.
    5. לאחר 1 כדי 2 חודשים של פיתוח וטיפול, הגפיים החדואיד ניתן להבקיע עבור טוהר השתל באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה פלורסנט.
      הערה: הנוכחות של שאינם עצביים או שאינם דם שמקורם מארח GFP-רקמה בגפיים הוא מחוון של השתלה טמאה והוא קשור לעיתים קרובות עם התפתחות הגפיים נורמלי. החיות האלה צריכות להיות. מושמצות מניתוח נוסף

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח עוברי פלואידי יכול להיות נבדל מן העוברים דיפלואידי על ידי התסמונת החפלואיד שלהם פנוטיפ29. בשלב ההשתלה, עוברי הפלואיד מציגים עקמומיות מופחתת לאורך הציר האחורי הקדמי והמארז השלם של תקע החלמון (איור 3א). מיקרוסקופ פלורסנט יכול לשמש כדי להבטיח כי עוברי הפנים הם חופשיים של ביטוי GFP הנגזר בלבד (איור 3ב).

כאשר הש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול שלנו ליצירת הפלואיד-diploid שטכנאי ההפעלה צריך לשקול תוצאות השתלה עקבית.

הסיבה הסבירה ביותר עבור דור הפלואיד להיכשל היא עקב העניים בתנאי ההפעלה החוץ גופית. יש להשתמש בכמויות המתאימות של זרע המרצפת כדי להפעיל ביצים. כדי להאריך את התנועתיות, יש לשמור על דגימות זרע ב -4 ° c. לפני החלת דגימת זרע על ביצים, לבדוק את הכדאיות של הזרע באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אין להשתמש בזרע לחלוטין ללא משבצת, והריכוז צריך להיות מותאם ל 80,000 נעים תאים/mL. יותר מדי זרע בשלב ההפעלה יכול גם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היינו רוצים להודות לקתרין רוברטס. על שטיפלה במושבה האקסון מימון עבור עבודה זו סופק על ידי הקרן החידוש של מקונטיקט חדשנות מחקר הרפואה (15RMA-ייל-09 ו 15-RMB-ייל-01) ו-יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד ופיתוח האדם (הפרט פוסט-דוקטורט מלגת F32HD086942).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#55 DumontForceps Fine Science Tools11295-1השתמש רק בחומר Dumostar (ניתן לחיטוי)
Amphotericin BSigma AldrichA2942-20ML20 מ"ל
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacinSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (פוליסוכרוז 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinSigma AldrichG1914-250MG
חממת חימום/קירורRevSciRS-IF-233
גונדוטרופין כוריוני אנושיMerkChorulon
Megascript T7 ערכת תמלולתרמו פישרAM133440 תגובות
מירוסקופ קירור שלבברוק תעשיותמותאם אישית
NLS Cas9 חלבוןPNAbioCP01-2004 בקבוקונים של 50 ומיקרו; גרם חלבון כל
פלסמוציןInvivogenant-mpt-1רמת טיפול
<חזק>מתכונים
1.0x תמיסת רינגר שונה של מארק (MMR)0.1 M NaCl, 2 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgSO<תת>4, 2 מ"מ CaCl2, 0.1 מ"מ EDTA, 5 מ"מ HEPES (pH 7.8), pH 7.4
הולטפרטר 40%20 מ"מ NaCl, 0.2 מ"מ KCl, 0.8 מ"מ NaHCO<תת>3, 0.2 מ"מ CaCl2, 4 מ"מ MgSO4, pH עד 7.4
תמיסת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352(2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548(2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas9GFP

מאמרים קשורים