טכנולוגיית תאים באנקפסולציה להעברת מוצרים ביולוגיים לעין העכבר

סיכום

מוצג כאן הוא פרוטוקול לשימוש קילוף פלסטיצידיות כמו פולימר במיקרועטיפת של תאים מונצח למסירה לטווח ארוך של מוצרים ביולוגיים לעיניים מכרסמים.

תקציר

Therapeutics הנוכחי רבים תחת פיתוח עבור מחלות של הקוטב האחורי של העין הם מוצרים ביולוגיים. תרופות אלה צריך להיות מנוהל לעתים קרובות, בדרך כלל באמצעות זריקות אמיתי. תאים בעלי כימוס המבטאים את הביוג'יק של הבחירה הופכים לכלי לייצור חלבון מקומי ושחרור (למשל, באמצעות אספקת סמים לטווח ארוך). בנוסף, מערכות כימוס לנצל חומרים חדירות המאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים, פסולת, וגורמים טיפוליים לתוך ומחוץ לתאים. הדבר מתרחש בזמן שהוא מסווה את התאים מהתגובה החיסונית של המחשב המארח, תוך הימנעות מצורך בדיכוי מערכת החיסון המארחת. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באלגיאט כפולימר במיקרומניפולציה בשילוב עם שיטת ההתזה כטכניקת מיקרו-כימוס. ARPE-19 תאים, הנובעים באופן ספונטני קו התאים RPE האנושי, כבר בשימוש ניסויים תא לטווח ארוך בגלל הפונקציונליות שלה במשך החיים, והוא משמש כאן לעטיפת משלוח של קפסולות לעיני העכבר. כתב היד מסכם את הצעדים למיקרועטיפת תאים, לבקרת איכות ולמסירה בעינית.

מבוא

טיפולים מבוססי תא מייצגים טכניקות ביולוגיות מהפכנית שהוחלו רבות ברפואה. לאחרונה, הם הוחלו בהצלחה בטיפול במחלות ניווניות, מחלות עיניים, סרטן. תרפיות בתאים מכסות מגוון רחב של שדות מהחלפת תאים לאספקת סמים, ופרוטוקול זה מתמקד במקרה האחרון. מיקרו כמוסות מתכלות (MC) הראו יעילות כמערכת משלוחים, והם נעשים בשימוש נרחב בתחום הביו-רפואי. Alginate שימש במיקרוכימוס בשל תהליך הג הפשוט שלה, biodegradability, biocompatibility מעולה, ויציבות תחת vivo תנאים^1,2,3,4.

שיטת ההתזה, כטכניקת מיקרועטיפת מיקרו, הייתה מנוצל בהצלחה לכשלי פפטידים וחלבונים באמצעות קילוף פלסטיצידיות (פולימר בסיס) ו פולי-l-האורלך (משני פולימר ציפוי). שני הפולימרים מצויים באופן טבעי ומשמשים בביותאימות שלהם^5,6,7. עם זאת, האתגר העיקרי בטיפולים מבוססי התא הוא דיכוי של מערכת החיסון המארחת כדי למנוע תופעות לוואי הנגרמות על ידי תרופות מדכאים חיסוני. החדירות של קילוף פלסטיצידיות microcapsules נחשב תכונה מתאימה עבור עטיפת התאים, אשר מאפשר דיפוזיה של חומרים מזינים, פסולת, וגורמים טיפוליים לתוך ומחוץ לתאים תוך הסוואה אותם תגובה חיסונית מארח^8,9,10.

בעין, תאים כימוס שימשו ניסויים קליניים למסירה מתמדת של מוצרים ביולוגיים (כלומר, גורמי גדילה^11,12 ו פקטור גדילה האנטוניסטים¹³) לטיפול רטיניטיס פיגמנטוזה או ניוון מקולרי הקשורות לגיל. מטרות אחרות כגון מעכבי המשלים¹⁴ הם גם בחקר כרגע הגדרות טרום קלינית.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בעלי חיים במחקר אופטלמולוגי וחזון ואושרו על ידי האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה טיפול בעלי חיים ועדת השימוש תחת מזהה פרוטוקול 00399.

1. תרבית תאים

1. ליצור תאים האפיתל האדם פיגמנט הרשתית (arpe-19) קו התא באופן בלתי נשכח את הגן של הבחירה על פי פרוטוקולים שפורסמו^14,15.
2. לשמור על התאים ב-בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העוברי (FBS).
3. מודאת התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
4. החליפו את המדיום כל 2 – 3 ימים.
5. מעבר לתאים לאחר שהגיע 70% – 80% זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים התרבות רקמה.

2. עטיפת תא

1. מערבבים נתרן קילוף פלסטיצידיות עם (DI) מים לריכוז הסופי של 2% w/v ולטהר על ידי סינון עם מסנן מזרק סטרילי 0.2 יקרומטר.
2. הכן את התאים להיות מעורבים עם הפתרון קילוף פלסטיצידיות על ידי טריזיציזציה, תפרידו, ושטיפת אותם עם 10 מ"מ hepes מלוחים באגירה פתרון (pH = 7.4). באמצעות התקן האטה, לספור את התאים ולהתאים את הריכוז התא הסופי כדי 1 x 10⁶ בפתרון קילוף פלסטיצידיות.
   הערה: תהליך עטיפת הכיסוי צריך להיות מופעל בתוך מכסה מחוטא.
3. טען ~ 300 μl ליטר של קילוף פלסטיצידיות ושילוב תאים לתוך מזרק של 3 מ ל ולצרף אותו משאבת מזרק. הפתרון יישאב באמצעות מחט של 30 גרם בוטה לאמבט המים סטרילי ממוקם בגביע 50 mL סטרילי מתחת לקצה המזרק ב 7 מ"מ עבור מחט למרחק ריסוס אמבט.
4. האמבטיה מכיל נפח של 40 mL של מלוחים 10 מ"מ HEPES באגירה המכיל 100 מ"מ סידן כלוריד (CaCl₂) ו 0.5% w/v פולי-l-האורלך (אש ף). אש ף היא ציפוי פולימרי משני שניתן להשמט או לשנותו בהתאם לצורכי החוקר.
5. להתאים את קצב מתח וזרימה ולשמור אותם קבוע במהלך תהליך אנקפסולציה ב 60 mm/h שיעור זרימה ו 6.0 kV מתח ראשוני כדי לייצר בגודל מיקרוקפסולות של ~ 150 μm.
6. חבר את הקליפ של חוט אנאודה (אדום) של מחולל מתח גבוה מחט המחט ולחבר את התמונה הקרקע (שחור) לחוט הנחושת כי הוא שקוע באמצע אמבט המים. קבוצה אחת של קילוף פלסטיצידיות + התערובת התא (1 mL) לוקח כ 30 דקות כדי להכין את התאים כמוסות (כ 25,000 microcapsules).
7. לשטוף את מיקרוקפסולות שנוצרו המכילים תאים עם פתרון כביסה (10 מ"מ HEPES מלוחים באגירה המכילה 1.5 mM CaCl₂, pH = 7.4) פעמיים. אין להשתמש ב-PBS לכביסה.
8. מודטה את התאים שעברו אנקפסולציה עם 10% FBS שנוספו מדיה DMEM בתוך מחולל לחות ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
   הערה: מכשירים לעיבוד כימוס מתוארים באיור 1.

3. אישור שאנקפסולציה אינה משפיעה על הכדאיות בתאים

1. לאחר הדגירה של תאים שעברו אנקפסולציה עבור 24 שעות במדיה, להכין מדגם קטן של 500 μL (~ 30 microcapsules) עבור כתמים.
2. שטוף את מיקרוקפסולות 2x באמצעות פתרון כביסה (10 מ"מ HEPES מלוחים באגירה המכילה 1.5 mM CaCl₂) ולהכתים אותם עבור הכדאיות חי מת באמצעות ערכת שיטת חיים/מת.
3. הכינו תערובת מכתיבת של calcein AM (acetoxyמתיל) ואתידיום הומודימר -1 בריכוזים סופיים של 2 μM ו-4 μM, בהתאמה.
4. הוסף 2 מ ל של תערובת מכתים את התאים שעברו כימוס עבור 30 – 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (RT).
5. עם שאיפה זהירה, מכתים את הפתרון כתמים ולשטוף את microcapsules 2x עם פתרון כביסה. השתמש במערכת מיקרוסקופ פלורסנט כדי להתבונן ולצלם את התאים שעברו אנקפסולציה.
   הערה: תיעוד האנקפסולציה מתואר באיור 2.

4. אישור כי קפסולות הם הגודל המתאים עבור משלוח ומשלוח של הביוג'יק

1. זריקות מיוחדות בעין העכבר מבוצעות בדרך כלל עם המחט 27 G בוטה-עצה (הקוטר הפנימי של 210 μm) מצורף מזרק 2.5 μL המילטון.
2. צור קפסולות החל מ 100 כדי 200 μm, לדלל אותם במדיה ללא סרום, ובזהירות למשוך אותם לתוך מזרק המילטון. Pbs אינו רכב מתאים, כמו קפסולות קילוף פלסטיצידיות להתמוסס ב-PBS.
3. לאט להוציא 1 μL טיפות המכיל קפסולות על שקופית מיקרוסקופ ולקבוע את השלמות שלהם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף.
4. כוונן את גודל הקפסולה (ראה שלב 2.3) על-ידי התאמת קצב מתח וזרימה בהתאם. מיקרוקפסולות קטנות יותר מיוצרות בצורה לא לינארית על ידי הגדלת מתח ושיעור הזרימה היורדת מעט⁸. בידינו, קפסולות של 150 יקרומטר בקוטר הוכח להיות מתאים ביותר. התאמה של גודל קפסולה תלויה גם לשמור על קבוע ריכוז קילוף פלסטיצידיות תוך שינוי הפרמטרים האחרים.
5. שמור על קבוצה נפרדת של תאים בכמוסות של הגודל המתאים במדיום ללא סרום, כדי לקבוע את כמות ההפרשה הביולוגית הרצויה. השתמש באליאס רגיש או בכתמים מערביים כדי לקבוע את ריכוז התכשירים הרפואיים ב-supernatant.
6. לקבוע את הכמות הנדרשת של קפסולות כי צריך להיות מוזרק מבוסס על PK/PD הידוע (פרמקוקינטיקה/פרמקודינמיקה) של הריפוי. בידיים שלנו, 10 קפסולות לכל עין העכבר הוכיחו להיות יעיל ביותר.

5. משלוח כמוסה לתוך ויטאוס העכבר

1. לבצע זריקות אמיתיות. בעזרת מיקרוסקופ מבתר ראה איור 3 להגדרה כירורגית וחומרים המשמשים במהלך הפרוצדורה. פרוטוקול מפורט לזריקות מיוחדות ניתן למצוא במקום אחר¹⁶.
2. עכברים מורדם על ידי הזרקה תוך הצפק של xylazine וקטמין (20 מ"ג/ק"ג ו 80 מ"ג/ק"ג) או הרדמה מועדפת אחרים שאושרו על ידי הוועדה הספציפית לטיפול בבעלי חיים ושימוש. ודא את עומק ההרדמה המתאים באמצעות צביטה בבוהן¹⁷.
3. להתרחב תלמידים העכבר עם phenylephrine HCL (2.5%) ו אטרופין גופרתי (1%) כדי לאפשר ניראות טובה של החדר האינדקטור ולמרוח ג'ל עין סיכה על העיניים כדי לשמור אותם מנוזלים במהלך ההליך.
4. לנקב את sclera ב לימבוס עם מחט של 26 G כמו חור המדריך, וודא כי 1) המחט היא בזווית 45 ° עם העין והשולחן 2) קצה משופע מכוון כלפי מעלה כדי למנוע חדירה של העדשה.
5. בזהירות להזריק את כמוסות באמצעות המחט 27 G בוטה-עצה מוצמד מזרק המילטון בזווית 45 ° תחת בדיקה חזותית, והקפד להימנע מלגעת העדשה עם המחט. פציעה של העדשה תוביל להיווצרות קטרקט. הקפסולות צריך להיות גלוי בתוך המיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ מבתר (איור 4A).
6. לאחר הנסיגה של המחט, לטפל באתר ההזרקה עם משחות אנטיביוטיות neomycin ו polymyxin B סולפטים בנוסף למשחה אנטיביוטית בטיפול אופטלמולוגי.
7. החלת להוריד פתרון אופטלמולוגי (2.5%) לשתי העיניים כדי למנוע מהקרניות להתייבש בתקופת ההחלמה.
8. הניחו את העכבר על משטח חימום שנערך ב-37 ° c והצג עד הערה מלאה.
9. הזרקה מוצלחת של כפולת arpe-19 תאים צריך לחשוף את הנוכחות של כמוסות שלמות בחדר אינדקטור של העכבר עם כמויות זעירות בלבד של פסולת בעת הדמיה של העין על ידי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית או שיטות אחרות (איור 4b).
10. עין העכבר מוזרק, לאחר כמה ימים של התאוששות עקב הניתוח, הוא כעת מוכן הפרדיגמה הניסיונית בהישג יד.
    הערה: הגדרת כירורגית ותיעוד של כמוסות בעין מתוארות באיור 3 ובאיור 4, בהתאמה.

תוצאות

ARPE-19 תאים הם הונצח באופן ספונטני RPE תא האדם כי כבר הוכח להיות קלה כימוס והישרדות לטווח ארוך עם השרשה של קפסולות לתוך העין. כלים לעטיפת מסגרות האלגינג מוצגים באיור 1. במחקר זה, הוכח כי על כימוס ב קילוף פלסטיצידיות, התאים בקפסולות קילוף פלסטיצידיות אושרו על ידי דימות שדה בהיר (איור 2a). חי-מת בחני בוצעו על התאים בתוך הקפסולות, הוכחת 90% הכדאיות שלאחר כימוס (איור 2b). כדי להבטיח הכדאיות ארוכת טווח של התאים בתוך קפסולות, קפסולות היו...

דיון

שיטת עטיפת התאים הזאת מהירה וקלה יחסית לביצוע; עם זאת, יש לזכור נקודות מסוימות כדי להשיג תוצאות מדויקות של הזרם. יש לשמור על התאים בתרבות בצלחת פטרי לפני כימוס ומוחזק בשטף מתאים. כימוס יש לבצע במכסה אוורור נאות עם זרימת אוויר מוסדר, אם אפשר. חזק מדי של זרם אוויר יכול להשפיע על היווצרות כמוסה, במיוחד בניסויים ארוכי טווח. כלים ופתרונות סטריליים הם קריטיים לתחזוקה ארוכת טווח של תאים בתוך הקפסולה.

כיום, חי מת מכתים משמש ככלי confirmatory כדי לקבוע את הכדאיות של תאים בתוך הקפסולות. מספר התאים לכל כ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק 3 מ"ל	BD	309656
30 גרם 1 אינץ' מחט קהה	SAI טכנולוגיית עירוי	B30-100
חומצה אלגינית מלח נתרן, מאצות חומות	Sigma	A0682
Atropine Sulfate תמיסת עיניים (1%)	Akorn	NDC 17478-215-15	להרחבת אישונים
BD 1 מ"ל מזרק 26 גרם x 3/8 (0.45 מ"מ x 10 מ"מ)	בקטון, דיקינסון ו החברה	DG518105 500029609 REF 309625	ליצירת חור ההנחיה
סידן כלורי, נטול מים, גרגירי	Sigma	C1016
GenTeal Tears	Alcon	NDC 0078-0429-47	לשימון העיניים בזמן הרדמה
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (סטרילי)	Altaire Pharmaceuticals Inc.	NDC 59390-182-13	לשימון העיניים בזמן הרדמה
קצה מחט/מזרק המילטון: 27 גרם, רכזת קטנה RN NDL, אורך קוסטום (12 מ"מ), סגנון נקודה 3, 6/PK	Hamilton	7803-01	לאספקה תוך זגוגית של כמוסות
מזרק המילטון: 2.5 ומיקרו; L, דגם 62 RN SYR, NDL נמכר בנפרד	המילטון	7632-01	לאספקה תוך-זגוגית של כמוסות
מאגר HEPES, 1 M	פישר ביוריאגנטים	BP299100
מחולל מתח גבוה	ESD EMC Technology	ES813-D20
חי/מת כדאיות/ציטוטוקסיות	Thermofisher Scientific	L3224
L-Ornithine hydrochloride, 99%	Alfa Aesar	A12111
Neomycin ו-Polymyxin B Sulfates ומשחת עיניים דקסמתזון	SANDOZ	NDC 61314-631-36	אנטיביוטיקה למניעת זיהום לאחר הזרקה תוך זגוגית
תמיסת עיניים פנולפרין הידרוכלוריד (2.5%)	Akorn	NDC 17478-201-15	להרחבת אישונים
נתרן כלוריד	Sigma	S-5886
מזרק סטרילי מסננים, 0.2 μ m	VWR	28143-312
משאבת מזרק	GRASEBY	MS16A

ערכת