הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים

3.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60170

⸱

11 בנובמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 2Experimental Therapeutics Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 3Department of Medicine, University of Louisville, 4Department of Surgery, University of Louisville, 5Immuno-Oncology Program, Brown Cancer Center, University of Louisville, 6Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר שיטה לבודד שלשולים חוץ-תאיים מועשרים אקסוזום הנושאים גורמים מעוררי גרנולוציטים מקרופטים למושבה מגרה את המעי הגס מתאי גזע עובריים.

תקציר

תאי גזע עובריים (ESCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים המסוגלים להתחדשות עצמית ובידול לכל סוגי התאים העובריים. כמו סוגי תאים רבים אחרים, ESCs משחררים שלטי ממברנה קטנים, כגון אקסוזומים, לסביבה חוץ-תאית. אקסוזומים משמשים כמתווכים חיוניים של תקשורת בין-תאית וממלאים תפקיד בסיסי בתהליכים פיזיולוגיים רבים (פתולוגיים). גורם גרנולוצייט-מקרופאג' מגרה מושבה (GM-CSF) מתפקד כציטוקין כדי לווסת את התגובה החיסונית. לנוכחות של GM-CSF באקסוזומים יש פוטנציאל להגביר את תפקוד מערכת החיסון-רגולציה שלהם. כאן, GM-CSF היה ביציבות יתר על המידה בקו תא ESC מורין ES-D3. פותח פרוטוקול לבידוד שלשלשות חוץ-תאיות (EV) מועשרות אקסוזום באיכות גבוהה מתאי ES-D3 המבישים יתר על המידה GM-CSF. רכבים אלקטרוניים מבודדים מועשרים אקסוזום התאפיינו במגוון גישות ניסיוניות. חשוב לציין, כמויות משמעותיות של GM-CSF נמצאו נוכחים ב- EVs מועשר אקסוזום. באופן כללי, EVs מועשר אקסוזום נושא GM-CSF מ- ESCs עשוי לתפקד כשלישיות ללא תאים כדי להפעיל את פעילותם החיסון-רגולטורית.

מבוא

ESCs נגזרים מהשלב הפיצוץ של עובר ההשתלה מראש1. כתאי גזע פלוריפוטנטים, ל- ESCs יש את היכולת לחדש את עצמם ולהבדיל לכל סוג של תא עוברי. בשל הפוטנציאל ההתפתחותי המדהים שלהם ויכולת שגשוג לטווח ארוך, ESCs הם בעלי ערך רב למחקר ביו-רפואי1. מאמצי המחקר הנוכחי התמקדו במידה רבה בפוטנציאל הטיפולי של ESCs למגוון הפרעות פתולוגיות עיקריות, כולל סוכרת, מחלות לב ומחלות ניווניות2,3,4.

תאי יונקים, כולל ESCs, ידועים לשחרר שלל עם גדלים משתנים לסביבה חוץ תאית, ורכבים אלקטרוניים אלה יש פונקציות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות בשל תפקידם בתקשורת בין תאית5. בין תת-סוגים שונים של רכבים חללית, אקסוזומים הם שלל ממברנה קטן המשתחרר מסוגי תאים שונים לחלל החוץ-תאי עם היתוך של תאים אנדוציטיים ביניים, גופים רב-לשוניים (MVB), עם קרום הפלזמה6. Exosomes דווחו לתווך תקשורת בין תאית והם מעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים רבים (פאתוס)7,8. אקסוזומים יורשים כמה פונקציות ביולוגיות מתאי ההורים שלהם, כי אקסוזומים מכילים חומרים ביולוגיים שנרכשו מהציטוסול, כולל חלבונים וחומצות גרעין. לכן, האנטיגנים הקשורים או גורמים הממריצים את התגובה החיסונית הספציפית למחלה נתונה הם עטופים exosomes מסוגים מסוימים של תאים9. זה סלל את הדרך לניסויים קליניים לחקור אקסוזומים שמקורם בגידולים כחיסון נגד סרטן10.

GM-CSF הוא ציטוקינים המופרשים על ידי סוגים שונים של תאי מערכת החיסון11. ראיות המתעוררות ממחישות כי GM-CSF מפעיל ומווסת את המערכת החיסונית וממלא תפקיד חיוני בתהליך האנטיגן-הצגה12. לדוגמה, דו"ח קליני מציע כי GM-CSF מגרה את התגובה החיסונית לגידולים כאדג'ובנטחיסון 13. מספר אסטרטגיות אימונותרפיה לסרטן מבוסס GM-CSF כדי לנצל את הפעילות החיסונית החזקה של GM-CSF נחקרו בניסויים קליניים14. בין אלה, חיסון לסרטן המורכב מתאי גידול מפרישים GM-CSF מוקרן הראה הבטחה מסוימת בחולי מלנומה מתקדמים על ידי גרימת תגובות אנטיטומור תאיות והומוריסטיות ונמק לאחר מכן בגידולים גרורתיים15.

מכיוון שהאקסוזומים הנגזרים מ- ESCs הם בעלי פעילויות ביולוגיות דומות לזו של ESCs המקוריים, אולי אקסוזומים נושאי GM-CSF מ- ESCs יכולים לתפקד כשלשלות ללא תאים כדי לווסת את התגובה החיסונית. במאמר זה, מתוארת שיטה מפורטת לייצור EVs מועשר אקסוזום באיכות גבוהה מ- ESCs המבטאים GM-CSF. ל-EVs המועשרים באקסוזום יש פוטנציאל לשמש כשלפוחיות רגולטוריות של מערכת החיסון כדי לווסת את התגובה החיסונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פולחן תאי ES-D3

  1. כדי ליצור סרום בקר עוברי נטול אקסוזומים (FBS), טען FBS לתוך אולטרה צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 16 שעות ב 4 °C (7 ).C. לאחר צנטריפוגה, לאסוף סרום supernatant כמו FBS ללא exosome ללא exosome עבור culturing קו תא ESC מורין ES-D3 ורכישת EVs מועשר exosome.
  2. לפני ציפוי תאי ES-D3, יש לצפות 15 ס"מ בתרבית הרקמות באמצעות ג'לטין (0.1%) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. בעקבות פרוטוקול16שתואר בעבר , תרבית תאי ES-D3 ללא תאי שכבת מאכילים במנות תרבית רקמות מצופות ג'לטין 15 ס"מ. המדיום תרבית התא ES-D3 מורכב DMEM, FBS ללא אקסוזום (15%), חומצות אמינו לא חיוניות (0.1 מ"מ), L-גלוטמין (2 מ"מ), β-mercaptoethanol (0.1 mM), פניצילין (50 יחידות/ מ"ל), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם /מ"ל) ומקדם מעכב לוקמיה (LIF; 100 יחידות /מ"ל). תאי ES-D3 תרבית ב 37 °C בחממה לחה5% CO 2.
  4. ברגע שתאי ES-D3 מגיעים למפגש של כ-90% במנות תרבית רקמות של 15 ס"מ, הסירו את המדיום בשאיפה. לשטוף את התאים באמצעות טריפסין (5 מ"ל; 0.05%). מוסיפים טריפסין (5 מ"ל) לכלים ודגרה ב 37 °C (5 דקות). לאסוף את התאים מן הכלים.
  5. הוסף בינוני תרבית טרי (5 מ"ל) לתאים שנאספו כדי לנטרל את הטריפסין. צנטריפוגות התאים ב 390 x g במשך 5 דקות. resuspend התאים במדיום טרי ולקבוע את מספר התא באמצעות hemocytometer.
  6. עבור תאים עוברים, צלחת את תאי ES-D3 (5 x 106) בציפוי ג'לטין (0.1%) 15 ס"מ צלחת תרבית רקמות עם בינוני טרי (15 מ"ל) ותרבית במשך 3 ימים לפני תת התרבות של התאים.
  7. כדי לאסוף את תרבית התאים supernatant לבידוד של EVs מועשר exosome, צלחת את תאי ES-D3 (1 x 107) בציפוי ג'לטין (0.1%) 15 ס"מ צלחת תרבית רקמות עם בינוני טרי (15 מ"ל) במשך 3 ימים לפני איסוף גזע תאי.

2. יצירת ביטוי GM-CSF פלסמיד

הערה: צור את הפלסמיד pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP כדי להדגיש יתר על המידה GM-CSF בתאי ES-D3. ב plasmid זה, ביטוי של ממורמור GM-CSF cDNA יחד עם חלבון הסמן אנושי רנילאם GFP (hrGFP) מונע על ידי גורם התארכות שרשרת הפוליפפטיד האנושי 1α (EF1α) מקדם17,18.

  1. צור את עמוד השדרה הווקטורי.
    1. לעכל את plasmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 מיקרוגרם של DNA) באמצעות אנזים ההגבלה EcoRI (100 יחידות) ב 37 °C עבור 2 שעות כדי ליצור שני שברי DNA: עמוד השדרה הווקטורי (6.0 kb) ו FD3ER להוסיף (2.5 kb).
    2. העבר 50% של DNA plasmid מעוכל (10 מיקרוגרם) לתוך צינור microcentrifuge אחד 1.5 מ"ל ולטפל עם פוספטאז אלקליין (20 יחידות) ב 37 °C (1 שעה). פתור הן DNA לא מטופל והן dephosphorylated באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (2%).
    3. לטהר את שברי DNA עמוד השדרה וקטור (6.0 kb) באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA . בעוד עמוד השדרה הווקטורי שלא טופל ישמש כווקטור הריק (pEF1α-IRES-hrGFP), עמוד השדרה הווקטורי של dephosphorylated ישמש ליצירת פלסמיד ביטוי GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).
  2. צור את הוספת CDNA של GM-CSF.
    1. לעכל את pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 מיקרוגרם) באמצעות אנזים ההגבלה EcoRI (100 יחידות) ב 37 °C עבור 2 °C כדי לייצר שני שברי DNA: עמוד השדרה הווקטורי (6.5 kb) ואת ההוספה GM-CSF cDNA ממורמור (474 bp).
    2. פתור את הדנ"א המעוכל באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (2%). טהרו את שבר ה-CDNA של ה-GM-CSF (474 bp) באמצעות ערכת מיצוי ג'ל דנ"א.
  3. צור את הביטוי plasmids.
    1. הגדר 2 תגובות קשירה (נפח כולל של 10 μL) באמצעות ערכת קשירת DNA.
      1. כדי ליצור את הווקטור הריק pEF1α-IRES-hrGFP, ליהט את עמוד השדרה הווקטורי הלא מטופל בשלב 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).
      2. כדי ליצור pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ליתג את שברי הדנ"א הבאים: (1) עמוד השדרה הווקטורי dephosphorylated ממשלב 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) ו - (2) שבר mGM-CSF cDNA שנוצר בשלב 2.2.2 (474 bp; 200 ng).
    2. ליגייט ב 25 °C (5 דקות). להפוך DNA קשירה לתאי E. coli מוכשרים DH5α. צלחת תאי E. coli המרה על לוחות LB-אגר המכיל קרבניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
    3. לטהר plasmids ממושבות אי קולי יחיד באמצעות ערכת בידוד DNA. לאמת את הזהויות של plasmids על ידי ריצוף DNA.

3. יצירת תאי ES-D3 המבטאים יתר על המידה GM-CSF

הערה: להעביר את תאי ES-D3 עם pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP כדי להדגיש יתר על המידה GM-CS. Cotransfect את pBabe-Neo plasmid לתוך תאי ES-D3 כדי להקל על הבחירה של תאים שהודבקו ביציבות18,20.

  1. מעבירים את הפלסמידים לתאי ES-D3.
    1. צלחת תאי ES-D3 (1.4 x 106) בציפוי ג'לטין (0.1%) 10 ס"מ תרבות רקמות צלחת עם בינוני תרבית (10 מ"ל) עבור transfection. תאי ES-D3 מצופים תרבות ב 37 °C (7 °F) עבור 24 שעות.
    2. הכן שתי תערובות plasmid ב 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 מיקרוגרם, בקרה וקטורית) עם pBabe-Neo (4 מיקרוגרם) ו -(2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 מיקרוגרם, מבטא GM-CSF) עם pBabe-Neo (4 מיקרוגרם). בצע טרנספקטציה באמצעות ערכת טרנספקטו בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. הוסף בינוני transfection (1 מ"ל) ריאגנט transfection (64 μL) לכל צינור המכיל את תערובות plasmid ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. מוסיפים את תערובות טרנספקטיון למנות 10 ס"מ בהתאמה של תאי ES-D3. דגירה ב 37 °C (5 °F) במשך 5 שעות.
    5. החליפו את המדיום במנות 10 ס"מ עם בינוני תרבות טרי (10 מ"ל). דגירה ב 37 °C (55 °F) עבור 24 שעות.
  2. ליצור אוכלוסיות בתפזורת של תאי ES-D3 שהודבקו ביציבות.
    1. הסר את המדיום מתאי ES-D3 שהודבקו. לשטוף את התאים עם טריפסין (2 מ"ל; 0.05%). מוסיפים טריפסין (2 מ"ל) ודגרה ב 37 °C (5 דקות). להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום תרבות טרי לנטרל טריפסין. צנטריפוגה ב 390 x g במשך 5 דקות.
    2. resuspend התאים transfected במדיום תרבית טרי (10 מ"ל). להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP בתאי ES-D3 שהודבקו באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS), בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. מעבירים את התאים המודבקים לשתי מנות 10 ס"מ המכילות מדיום תרבות טרי (10 מ"ל). הוסף neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל) כדי לחסל תאים לא נגועים.
    4. המשך פולחן התאים transfected במדיום תרבית המכיל neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל). כאשר ES-D3 transfected להגיע 90% השפעה, להעביר תאים 15 ס"מ תרבית רקמות מנות שוב. חזור על ההליך במשך שבועיים.
  3. צור שיבוטים של תאי ES-D3 שהודבקו ביציבות.
    1. לאחר נוצרים אוכלוסיות בתפזורת של תאי ES-D3 שהודבקו ביציבות, אסוף את התאים כבעבר. לקבוע את מספרי התאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגות התאים ב 390 x g במשך 5 דקות. resuspend התאים (1 x 107 תאים / מ"ל) במדיום תרבית טרי.
    2. לסנן את התאים באמצעות מסננת תאים סטרילית 40 מיקרומטר. טהר תאי ES-D3 חיוביים GFP באמצעות FACS, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. צלחת תא ES-D3 ממוין יחיד לתוך באר אחת של מצופה ג'לטין (0.1%) 96-well צלחת תרבית רקמות המכיל תאי ES-D3 הורים (1 x 103) במדיום ללא neomycin (200 μL). שיתוף פולחן תאי ES-D3 transfected עם עמיתיהם ההורים untransfected מבטיח כי תאי ES-D3 בודדים ייצוב לשרוד ולהתרבות כשיבוט יחיד.
    4. תרבית התאים עבור 48 שעות, ולאחר מכן להוסיף neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל) כדי 96-טוב לוחות כדי לחסל תאי ES-D3 הורים לא נגועים.
    5. המשך פולחן תאי ES-D3 חיובי GFP בלוחות תרבית רקמות 96-well עם ניומיצין המכיל בינוני (0.5 מ"ג / מ"ל) במשך שבוע אחד. העבר קווי תאי ES-D3 ציפורן לציפוי ג'לטין (0.1%) 6 ס"מ תרבית רקמות מנות עם בינוני תרבות (5 מ"ל) המכיל neomycin (0.5 מ"ג / מ"ל) במשך שבוע אחד.
    6. קבע את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP בכל אחד משיבוטי תאי ES-D3 שהודבקו באמצעות FACS, בהתאם לפרוטוקול היצרן. בחר את שיבוטי ES-D3 המבטאים GM-CSF או את הווקטור הריק עם רמות גבוהות של פלואורסצנטיות ירוקה.
    7. קבע את כמויות GM-CSF המופרשות על-ידי תאי ES-D3 באמצעות ערכת GM-CSF ELISA מורינה, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

4. בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום

  1. תרבית תאי ES-D3 (1 x 107) ב 15 ס"מ תרבית רקמות מנות עבור 72 שעות ב 37 °C (50 °F). לאסוף את תרבות התא supernatant. חנות נאספה supernatant ב 4 °C (5 °F) עד שבוע אחד כדי לשמור על שלמות exosomal.
  2. צנטריפוגה את תרבית התא supernatant ב 5,000 x g במשך 60 דקות ב 4 °C (70 °F) באמצעות צנטריפוגה כדי משקעים שברי תאים גדולים.
  3. לאסוף את supernatant וצנטריפוגה ב 100,000 x g במשך 90 דקות ב 4 °C (60 °F) באמצעות אולטרה צנטריפוגה.
  4. הסר את סופר-טבעי. יש לשטוף בעדינות כל גלולה פעמיים עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS; 1 מ"ל) כדי להסיר את שאריות התרבות העל-טבעית.
  5. יש לתתכוד מחדש כל גלולה ב-PBS. לכמת EVs מועשר אקסוזום על ידי תכולת החלבון שלהם5.
    1. מדדו את ריכוז החלבון של EVs מועשר אקסוזום עם חומצה בינצ'ונינית (BCA). התשואה הצפויה של EVs מועשר אקסוזום מתאי ES-D3 הוא כ 4 מיקרוגרם חלבון / מ"ל של גזע תאי. יש להזרים מחדש את ה-EVs המועשרים ב-PBS (ריכוז חלבונים: ~6 מיקרוגרם/מיקרו-אל). יש לאחסן את ה-EVs המועשרים ב-80 מעלות צלזיוס.

5. אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

הערה: לחקור את ההרכב ואת המבנה של EVs מועשר exosome מבודדים ESCs באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)5.

  1. תקן את EVs מועשר exosome (3-5 מיקרוגרם / μL) עם ריכוז סופי של 2% פרפורמלדהיד כיתה EM בטמפרטורת החדר עבור 2 שעות.
  2. טען דגימות קבועות (10 μL) על רשתות נחושת עם סרט תמיכה בפחמן. לדגור את הדגימות עם רשתות נחושת במשך 1 דקות, ולאחר מכן לנקז את הרשתות עם נייר מסנן.
  3. הכתימו את הרשתות בפתרון מכתים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  4. העבר את הרשתות לפיסת נייר סינון באמצעות פינצטה. אפשר לרשתות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  5. לרכוש תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (הגדלה של פי 50,000), בהתאם לפרוטוקול היצרן.

6. הערכה של שלפוחיות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום על ידי ניתוח כתם מערבי

  1. הכן תמציות תאים שלמים.
    1. הסר את המדיום מתאי ES-D3 בתרבית מנות 15 ס"מ. לשטוף את התאים עם טריפסין (5 מ"ל; 0.05%). הוסף טריפסין (5 מ"ל) לתאים. דגירה ב 37 °C (5 דקות). לאסוף את התאים ולהוסיף מדיום תרבית טרי (5 מ"ל) כדי לנטרל טריפסין. צנטריפוגות התאים ב 390 x g במשך 5 דקות. תקיף מחדש את התאים ב-PBS.
    2. לקבוע מספרי תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגות התאים שוב ב 390 x גרם במשך 5 דקות. תגדיל מחדש את התאים במאגר הטעינה SDS-PAGE המכיל 0.5% SDS (5,000 תאים/μL).
    3. Sonicate הדגימות עבור 10 s באמצעות sonicator עם 10% משרעת (וואט: 500 W; תדר קולי: 20 kHz). מחממים את הדגימות ב 100 °C (5 דקות).
  2. הכן את הריסטים של EVs מועשר אקסוזום.
    1. תמזגו מחדש את ה-EVs המועשרים ב-SDS-PAGE המכילים 0.5% SDS בריכוז של 1.2 מיקרוגרם/מיקרו-לן.
    2. Sonicate הדגימות עבור 10 s באמצעות sonicator עם 10% משרעת (וואט: 500 W; תדר קולי: 20 kHz). מחממים את הדגימות ב 100 °C (5 דקות).
  3. לזהות חלבונים על ידי כתם מערבי.
    1. טען תמציות תאים שלמים (10 μL; 5,000 תאים / μL) ו LYSates EV מועשר אקסוזום (10 μL; 1.2 מיקרוגרם / μL) לתוך כל באר של ג'ל ביס-טריס PAGE (4-20%). העבר חלבונים על ממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF).
    2. ממברנות דגירה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים מתאימים. לדלל נוגדנים (בריכוזים המצוינים להלן) במאגר סופג המכיל PBS, Tween-20 (0.2%), וחלב יבש דל שומן (10% w/v).
      1. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: אנטי-נספח V (200 ננוגרם/מ"ל), אנטי-CD81 (50 ננוגרם/מ"ל), אנטי-פלוטילין-1 (200 ננוגרם/מ"ל), אנטי-ציטוכרום c (100 ננוגרם/מ"ל), איזומראז אנטי-חלבון (200 ננוגרם/מ"ל), אנטי-GAPDH (33 ננוגרם/מ"ל) ונגד אוקספוס COX IV-subunit IV (600 ננוגרם/מ"ל).
      2. השתמש בנוגדנים המשניים הבאים: עיזים נגד ארנבות (20 ננוגרם/מ"ל) ו-Peroxidase-מצומדים נגד עכבר IgG (20 ננוגרם/מ"ל).
    3. זהה חלבונים באמצעות ערכת זיהוי כימותרפיה משופרת.

7. קביעת ריכוזי GM-CSF בשלל חוץ-תאי מועשר אקסוזום על ידי ELISA

הערה: להעריך את כמויות GM-CSF ברכבים חשמליים מועשרים exosome על ידי ELISA באמצעות ערכה עבור GM-CSF murine, בעקבות פרוטוקול היצרן עם כמה שינויים.

  1. מצפים את צלחת ELISA בנוגדן לכידה. טפלו בריו-מים אלקטרוניים מועשרים אקסוזום (0.6 מיקרוגרם) ב-PBS בלבד או PBS + 0.05% טווין-20 (100 μL) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מוסיפים דגימות מטופלות לצלחת ELISA מצופה ודגר בטמפרטורת החדר למשך שעה. לשטוף את הצלחת עם PBS לבד או PBS + 0.05% Tween-20.
  2. הוסף נוגדן זיהוי לדגימות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לשטוף את הצלחת עם PBS לבד או PBS + 0.05% Tween-20. הוסף אבידין-HRP לדגימות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לשטוף את הצלחת עם PBS לבד או PBS + 0.05% Tween-20.
  3. קבע את הריכוזים של GM-CSF ברכבים הפעלה אלקטרוניים מועשרים אקסוזום על ידי מדידת הספיגה ב 450 ננומטר על קורא מיקרו-לוחית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

GM-CSF הוא יתר על המידה ב ESCs מורין.
כדי להמחיש יתר על המידה GM-CSF בתאי ES-D3, ממורין GM-CSF cDNA שוכפל לווקטור טרנספקטציה כדי ליצור את וקטור הביטוי pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (איור 1A). GM-CSF התבטא יתר על המידה בתאי ES-D3 על ידי טרנספקטציה, וכ -20% מתאי ES-D3 שהודבקו באופן חולף היו חיוביים ל- GFP. שיבוטי תאים המדחיקים יתר על המידה GM-CSF או הפקד הווקטורי הריק נרכשו על ידי FACS. כפי שמוצג באיור 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מראה שיטה יעילה ביותר לייצור EVs מועשר אקסוזום הנושא את חלבון גירוי מערכת החיסון GM-CSF, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את ההשפעות המווסתות של מערכות הפעלה חשמליות מועשרות אקסוזום. מספר מחקרים מראים כי exosomes להפגין פונקציות חיסונית-רגולטורית ואנטי הגידול22. לפיכך, אקסוזומים מ- ESCs המבטאים GM-CSF עשויים גם הם להיות בעלי פעילויות ביולוגיות המווסתות את התגובה החיסונית. בפרוטוקול זה, מורק exogenous GM-CSF היה ביציבות overexexed בתאי ES-D3 מורין על ידי transfection (איור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

Kavitha Yaddanapudi, צ'י לי, וג'ון ו. איטון הגישו בקשת פטנט בארה"ב "קומפוזיציות הכוללות אקסוזומים ושיטות שימוש בתאי גזע עובריות מהונדסות ושיטות שימוש בהן".

תודות

אנו מודים למר ארקדיוש סלוסרצ'יק ורשת תשתיות המחקר הביו-רפואי של קנטאקי (KBRIN, P20GM103436) על רכישת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מ NIH AA018016-01 (J.W.E.), חבר העמים של קנטאקי מחקר אתגר אמון אמון (J.W.E.), NIH CA106599 ו CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), וחופשי לנשום מענק מחקר (K.Y.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פוספט אלקליין, מעיעגל ניו אינגלנד BiolabsM0290SDephosphorylating DNA פלסמיד
אנטי-אנקסין V mAbסנטה קרוז שיבוט ביוטכנולוגיהH-3, sc-74438כתם מערבי, RRID:AB_1118989
אנטי-CD81 mAbסנטה קרוז שיבוט ביוטכנולוגיהB-11, sc-166029כתם מערבי, RRID:AB_2275892
אנטי ציטוכרום c mAbסנטה קרוז שיבוט ביוטכנולוגיהA-8, sc-13156כתם מערבי, RRID:AB_627385
אנטי-פלוטילין-1 mAbסנטה קרוז שיבוט ביוטכנולוגיהC-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
IgG נגד עכברים, עז, מצומד פרוקסידאזThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAbThermo Fisherשיבוט 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
אנטי-חלבון דיסולפיד איזומראז (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
אנטי ארנב IgG, עז, מצומד פרוקסידאזThermo Fisher31460כתם מערבי, RRID:AB_228341
BCA (חומצה ביסינצ'ונינית) מבחןתרמו פישר23223קביעת ריכוזי חלבון
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015כתם מערבי
קרבניצילין, מלח דיסודיוםתרמו פישר10177012בחירת E. coli מושבות
צנטריפוגה, Avanti J-26 XPIבקמן קולטרצנטריפוגה במהירות נמוכה
, JA-10בקמן קולטר09U1597צנטריפוגה צנטריפוגה במהירות נמוכה
, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKצנטריפוגה במהירות נמוכה
עם סרט תמיכה בפחמןמדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתFF200-Cuרכישת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים
EcoRIניו אינגלנד BiolabsR0101עיכול פלסמיד DNA
כימילומינסנציה משופרת מערכת זיהויThermo Fisher32106כתם מערבי
FACSציטומטר זרימה של קליברבקטון דיקינסוןבחינת רמות GFP של תאי ES-D3
סרום בקר עובריATCCSCRR-30-2020מדיום לתאי ES-D3
מסנני תאים סטריליים של פישרברנד; גודל רשת: 40μ mThermo Fisher22-363-547סינון תאי ES-D3 למיון FACS
ג'לטין (0.1%)Thermo FisherES006Bתרבית תאי ES-D3
ערכת GM-CSF ELISAתרמו פישר88733422קביעת ריכוזי GM-CSF
נוקאאוט Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוניתרמו פישר10-829-018בינוני לתאי ES-D3
לוקמיה גורם מעכבתרמו פישרESG1106בינוני לתאי ES-D3
L-גלוטמיןVWR VWRL0131-0100בינוני לתאי ES-D3
ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציהתרמו פישר11668019העברת תאי ES-D3
קורא מיקרופלייט, PowerWave XSBioTekקביעת ריכוזי GM-CSF
MoFlo XDP סדרן תאים במהירות גבוההבקמן קולטרבידוד שיבוטי תאים בודדים ES-D3
NEB 5-alpha מוכשר E. coliניו אינגלנד BiolabsC2988Jייצור ביטוי GM-CSF פלסמיד
NeomycinThermo Fisher10-131-035בחירת שיבוטי ES-D3
חומצותאמינו לא חיוניותתרמו פישרSH3023801בינוני לתאי ES-D3
חלב יבש ללא שומןתרמו פישרNC9022655כתם מערבי
Opti-MEM I סרום מופחת בינוניתרמו פישר31985062העברת תאי ES-D3
Paraformaldehydeמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי15710רכישת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים
פניצילין/סטרפטומיציןVWRsc45000-652מדיום לתאי ES-D3
פלסמיד pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270ייצור ביטוי GM-CSF פלסמיד
PVDF ממברנותMillipore EMDIPVH00010Western Blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106יצירת ביטוי GM-CSF פלסמיד
QIAquick ערכת מיצוי ג'ל (50)QIAGEN28704יצירת ערכת קשירה מהירה של פלסמיד ביטוי GM-CSF
ניו אינגלנד BiolabsM2200Sיצירת ביטוי GM-CSF פלסמיד
שידור מיקרוסקופ אלקטרוניםהיטאצ'יHT7700רכישת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים
TrypsinVWR45000-660תרבית תאי ES-D3
אולטרה-צנטריפוגה, OptimaTM L-100 XPבקמן קולטרגבוה צנטריפוגה מהירה
רוטור אולטרה-צנטריפוגה, 45Tiבקמן קולטר09U4454צנטריפוגה במהירות גבוהה
בקבוק פוליקרבונט אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר355622צנטריפוגה במהירות גבוהה
UranyLess תמיסת צביעהמיקרוסקופ אלקטרונים22409רכישת תמונות מיקרוסקופיה אלקטרונית
רוטור בקבוק רשתות מדעי

מקורות

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt? Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible? PLoS One. 7 (7), e42289(2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי יתר של GM-CSFפרוטוקול אולטרה-צנטריפוגציהמיקרוסקופיה אלקטרונית חודרתאנליזת Western Blotערכה לזיהוי ELISAשיטה לבידוד אקסוזומיםעל-נוזל תרבית תאיםמרקרים אקסוזומליים
בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.