מאמר שיטה

המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב

12.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60225

⸱

14 בספטמבר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

במאמר זה

סיכום

האסטרולוגים הם תאים מורכבים מורפולוגית, לידי ביטוי על ידי התהליכים המרובים שלהם בשטחים סבוך. כדי לנתח את המבנה המשוכלל שלהם, אנו מציגים פרוטוקול אמין כדי לבצע לוציפר תאיים ביוטופהורזיס צהוב בעדינות רקמה קבועה.

תקציר

אסטרוציטים הם מרכיבים חיוניים של מעגלים עצביים. הם לקלף את כל מערכת העצבים המרכזית (CN) והם מעורבים במגוון של פונקציות, אשר כוללות סיווג נוירוטרנסמיטר, רגולציה יון, אפנון סינפטית, תמיכה מטבולית לנוירונים, ובקרת זרימת הדם. Astrocytes הם תאים מורכבים בעלי סומה, כמה ענפים גדולים, ותהליכים משובחים רבים ליצור קשר עם אלמנטים סלולריים מגוונים בתוך נוירופיל. על מנת להעריך את המבנה של האסטרוציטים, יש צורך בשיטה אמינה ומועלת כדי להמחיש את המבנה שלהם. אנו מדווחים על פרוטוקול אמין לבצע iontophoresis של האסטרוציטים באמצעות פלורסנט לוציפר צהוב (LY) לצבוע בקלות רקמת מוח קבוע מעכברים למבוגרים. שיטה זו כוללת מספר תכונות שימושיות לאפיון מורפולוגיה אסטרוציט. זה מאפשר שחזור תלת מימדי של אסטרוציטים בודדים, אשר שימושי לבצע ניתוחים מורפולוגיים על היבטים שונים של המבנה שלהם. אימונוהיסטוכימיה יחד עם באופן LY יכול להיות מנוצל כדי להבין את האינטראקציה של אסטרוציטים עם רכיבים שונים של מערכת העצבים להעריך את הביטוי של חלבונים בתוך האסטרוציטים המסומנת. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם במגוון של מודלים העכבר של הפרעות מערכת העיכול כדי לבחון בקפדנות מורפולוגיה אסטרוציט עם מיקרוסקופ אור. מספק גישה ניסיונית להערכת מבנה אסטרוציט, במיוחד בהקשר של פציעה או מחלה שבה תאים אלה מוצעים לעבור שינויים מורפולוגיים משמעותיים.

מבוא

Astrocytes הם התאים הנפוצים ביותר גליה במערכת העצבים המרכזית (cn). הם משחקים תפקידים הומאוסטזיס יון, בקרת זרימת הדם, היווצרות סינפסה, כמו גם חיסול, ו הנוירוטרנסמיטור קליטת1. מגוון רחב של פונקציות אסטרוציט משתקף במבנה מורפולוגית המורכבת שלהם2,3. Astrocytes מכילים מספר ענפים עיקריים ומשניים אשר מתחלקים לאלפי ברשופטים עדין ועלונים כי אינטראקציה ישירה עם הסינפסות, דנדריטים, אקסונים, כלי דם, ותאים גליה אחרים. מורפולוגיה astrocyte משתנה בין אזורי מוח שונים, אשר עשוי לרמוז על יכולתם לבצע את תפקידם באופן מכריע במעגלים עצביים4. יתר על כן, האסטרוציטים ידועים לשנות את המבנה שלהם במהלך הפיתוח, במהלך התנאים הפיזיולוגיים, ובמדינות מחלות מרובות3,5,6.

שיטה עקבית ומדומה נחוצה כדי לפתור במדויק את המורכבות של המבנה האסטרוציט. באופן מסורתי, אימונוהיסטוכימיה נעשה שימוש כדי להמחיש אסטרוציטים עם שימוש ספציפי אסטרוציט מועשר חלבון סמנים. עם זאת, שיטות אלה לחשוף את התבנית של ביטוי חלבון ולא את המבנה של astrocyte. סמנים בשימוש נפוץ, כגון חלבון מסוג גליה fibrillary (gfap) ו S100 סידן כריכת חלבון β (S100β), לא לבטא את עוצמת הקול כולו, ובכך לא לפתור מורפולוגיה מלאה7. גישות גנטיות לבטא חלבונים פלואורסצנטי באופן מהיר ב אסטרוציטים (זריקות נגיפי או שורות כתב העכבר הטרנסגניים) יכול לזהות את הענפים עדין והשטח הכולל. עם זאת, קשה להבדיל אסטרוציטים בודדים, וניתוחים עשויים להיות מוטה על ידי אוכלוסיית אסטרוציט ממוקדות על ידי יזם מסוים8. מיקרוסקופ מקטע סדרתי משמש כדי לחשוף תמונה מפורטת של האינטראקציות של תהליכים אסטרוציט עם הסינפסות. בשל אלפי תהליכים אסטרוציט יצירת קשר עם הסינפסות, כרגע זה לא אפשרי לשחזר תא שלם עם טכניקה זו9, למרות זאת צפוי להשתנות עם השימוש בגישות למידה מחשב עבור ניתוח נתונים.

בדו ח זה, אנו מתמקדים בהליך לאפיין את האסטרוציטים העכבר באמצעות ביוטוהורזיס תאיים עם לוציפר צהוב (LY) צבע, באמצעות CA1 שכבה רדיואטום כדוגמה. השיטה מתבססת על עבודת העבר החלוצית של אריק בושונג ומארק אליסמן10,11. האסטרוציטים מפרוסות המוח קבוע בקלות מזוהים על ידי הצורה הייחודית שלהם וממולא LY. לאחר מכן התאים מתתמונות עם המיקרוסקופיה הקונפוקלית. אנו מדגימים כיצד משמש באופן LY iontophoresis לשחזר אסטרוציטים הפרט ולבצע ניתוחים מורפולוגיים מפורטים של התהליכים שלהם טריטוריה. גם, שיטה זו יכולה להיות מיושם בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה כדי לזהות יחסים מרחביים ואינטראקציות בין אסטרוציטים ונוירונים, תאים גליאל אחרים, והמוח המערכת. אנו מחשיבים באופן ככלי מתאים מאוד לניתוח מורפולוגיה באזורי מוח שונים ומודלים של עכברים בתנאים בריאים או מהמחלה7,12,13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים במחקר זה נערכו בהתאם למכון הלאומי למדריך בריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה ואושרו על ידי ועדת המחקר בעלי חיים של הקנצלר באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס. עכברים מבוגרים (6 שבועות בני 8) של מין מעורב שימשו בכל הניסויים.

1. הכנה לפתרון

  1. נוזל שדרתי מלאכותי (ACSF) פתרון
    1. להכין פתרון ACSF טרי (135 mM היאl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl2, 14.7 Mm נחקו3, 11 מ"מ D-גלוקוז, 1.25 mm Na2Hpo4, ו 2mm cacl2) לפני כל ניסוי. הוסף את MgCl2 ו-cacl2 בשלב הסופי. מפזר את הרכיבים במים באיכות גבוהה.
    2. מודטה את הפתרון ACSF ב 35 ° c באמבט מים בועה עם 95% O2/5% CO2 עבור לפחות 30 דקות לפני הניסוי.
    3. הוסף 2% לידוקאין הידרוכלוריד כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.02% ב ACSF (ב 100 mL).
  2. פתרון מתקבע
    1. השתמש ב-10% שימוש במאגר פוספט.
  3. לצבוע את התמיסה
    1. להכין 1.5% ly פתרון לצבוע על ידי המסת ly ch מכרות דיליתיום יתיום מלח או ממלח ly ch מכרות דיליתיום ב 5 מ"מ kcl.. מערבולת ביסודיות נפח של 1 מ ל מספיק עבור ניסויים מספר.
    2. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 16,800 x g. אז, לסנן את supernatant עם מסנן 0.2 יקרומטר מזרק לתוך צינור חדש. המלון יכול להישמר ב -4 ° c עד 3 חודשים.
      הערה: זה קריטי לצנטריפוגה ולסנן את פתרון הצבע כדי למנוע צבירה של חלקיקי הצבע, אשר עשוי לסתום את האלקטרודה.

2. העכבר הטרנס והפרזיה וניתוח המוח

  1. הכנת ציוד ועכבר עבור הפרזיה
    הערה:     ניתן להשתמש בעכברים C57/BL6 של שני סוגי המין. מדובר באופן אמפירי על כך שכדי שהשיטה תפעל בצורה מהימנה, חשוב שהעכברים לא יהיו בוגרים מ-3 חודשים (6 שבועות וחצי). פרוטוקול זלוף מתואר להלן. הפניה נוספת מסופקת לפרטים נוספים14.
    1. ברור אבובים זלוף עם פתרון acsf להסיר בועות אוויר בקו. כוונן כלי ניתוח לפי סדר השימוש (פינצטה, מספריים מעוקלים, בוטים, איריס מספריים).
    2. עכבר מורדם למדי על ידי הכנסתו לתוך חדר האינדוקציה isofלוריאן, לאחר הוספת 2 ל-3 מ ' של isofלפני החדר. הרשו 1 עד 2 דקות עבור הרדמה לפעול. . תוודא שהנשמה לא מפסיקה
    3. . מבחן רפלקס הבוהן המשך כאשר העכבר אינו מגיב לגירוי הכאב והרפלקס נעדר. לאבטח את החיה בתנוחה פרקדן עם הראש ממוקם קונוס הנשימה עם אספקה של 5% isofלוריאן בחמצן והגפיים והזנב מודבק בתוך כיסוי כימי.
  2. הרסקרדיאל פרזיה
    1. , משתמש בפינצטה. מרים את העור מתחת לצלעות הפוך לחתך של 5-6 ס מ עם מספריים מעוקלים וקהה דרך העור כדי לחשוף את חלל הבטן. חותכים כלפי מעלה דרך קיר הבטן עד הכבד והסרעפת גלויים.
    2. הזז בעדינות את הכבד הרחק מהדיאגרמה. עם איריס מספריים, לעשות חתך לרוחב 3-4 ס מ בסרעפת.
    3. חותכים את כלוב הצלעות לאורך שני צידי הגוף כדי לחשוף את חלל החזה. להיזהר לא לפגוע בלב ולהימנע הריאות. הרם את עצם החזה. כדי לחשוף את הלב
    4. לאחר הלב הוא נראה, להזריק 0.05 mL של תמיסת הפארין נתרן (1,000 USP לכל mL) לתוך החדר השמאלי כמו נוגד קרישה. לאחר מכן, הוסף מחט היתוך בזהירות לתוך החדר השמאלי. ודא כי המחט נשאר בחדר ואינו לחדור אל תאי לב אחרים. לעשות חתך קטן באטריום הימני עם מספריים איריס.
    5. מבשם עם פתרון ACSF בקצב של כ 10 מ"ל/min עד הנוזל הקיים הגוף מנוקה מדם (1-2 דקות).
    6. מעבר מפתרון acsf לפתרון קבע מבלי להציג בועות אוויר. מבשם עם פתרון מייצב עבור 10 דקות בשעה 10 עד 20 מ ל/דקה.
      זהירות: שמור על עצמך ללא פתרון הקבע מרוקן מהאף. הדבר מעיד על כך שהמחט הגיעה לחדר הימני והקיבעון נע אל הריאות ולא דרך מעגל מערכתי לשאר חלקי הגוף.
  3. חיתוך המוח
    1. להסיר את הראש של העכבר עם מספריים ולנתח בזהירות את המוח העכבר מהגולגולת. מקום בתמיסה הקבע עבור 1.5 h בטמפרטורת החדר לתקופה קצרה שלאחר הקיבוע.
      הערה: הפרזיה טובה היא הכרחית להצלחה מוצלחת של iontophoresis. המוח צריך להיות בצבע לבן ולהעדר דם בתוך המוח. הגוף והגפיים צריכים להיראות נוקשים.

3. הכנת פרוסה

  1. הכנת פרוסות היפוקמאל
    1. לשטוף את המוח עם 0.1 M פוספט באגירה מלוחים (PBS) בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. לאחר מכן, לייבש את המוח עם נייר סינון ולהסיר את נורת הריח ואת המוח המוחי עם להב תער חדה.
    2. הר את המוח על מגש הרטט באמצעות דבק ציאנואקרילי ולמלא את המגש עם PBS בטמפרטורת החדר. גזור סעיפים היפוקמאל ילתית של 110 יקרומטר עובי.
      הערה: התאימו את ההגדרה של הרטט כדי לוודא שפרוסות בעלות עובי זהה ואפילו משטח. עבור ניסוי זה, שימשו הגדרת מהירות של 4.5 והגדרת תדירות של 8, שהן הגדרות שרירותיות על המכשיר (טבלת חומרים). ייתכן שהמשתמשים יצטרכו להתנסות עם ההגדרות בהתקנים אחרים.
    3. לאסוף את הסעיפים מן המגש ומניחים בקערה של PBS על הקרח.

4. הכנה לאלקטרודה

  1. הכינו אלקטרודה חדה עם התנגדות מתאימה.
    1. השתמש בכלי זכוכית בורוסיליקט לחבית בודדת עם נימה (מנת יתר 1.0 מ"מ, זיהוי 0.58 מ"מ). משוך אלקטרודה על פולר מיקרופיפטה (טבלת חומרים). כימיקלים אידיאליים מלא 1.5% LY ב 5 מ"מ KCl צריך התנגדות של 200 MΩ כאשר ממוקם לתוך אמבטיה של PBS.
      הערה: ההגדרה פולר משתנה בהתאם למנגנון (סוג המכונה בשימוש, ולאחר הלהט הפולר). הגדרת חום גבוהה יותר מעניקה בדרך כלל עצות יותר ויותר. עבור הפולר מיקרופיפטה המשמש בניסוי זה, ההגדרות היו: חום: 317, למשוך: 90, מהירות: 70, ו עיכוב: 70. נעשה שימוש בנימה של סוג שוקת.
    2. אחסן אלקטרודות במיכל סגור כדי למנוע מאבק להיכנס לקצה. שמור על האלקטרודות הגבוהות מהחלק התחתון של התיבה כדי למנוע את שבירת הקצה.
  2. למלא את האלקטרודה עם פתרון לצבוע LY.
    1. הצב אלקטרודה במיקום אנכי כאשר הקצה פונה כלפי מטה. הפיפטה 1-2-3 μL של פתרון LY לתוך החלק האחורי של האלקטרודה ולחכות 5-10 דקות עבור הפתרון כדי לעבור את העצה באמצעות הפעולה נימי.
    2. אבטח בעדינות את האלקטרודה המלאה במחזיק האלקטרודות המחובר למניפולטור.
      הערה: חוט כסף של בעל האלקטרודה צריך להיות במגע עם LY בתוך האלקטרודה. כוונן את עוצמת הקול של הפתרון LY במידת הצורך, בהתאם לאורך הכבל.

5. מילוי אסטרוציטים עם יוטופהורזיס

  1. . תבדוק את האלקטרודות
    1. מניחים נתח מוח בעדינות לתוך הצלחת התחתונה זכוכית מלא 0.1 M PBS בטמפרטורת החדר. החזיקו את הפרוסה במקום עם נבל פלטינה עם מחרוזות ניילון.
    2. ודא כי האלקטרודה מחוברת למקור מתח ומניחים את הקרקע בתוך האמבט המכיל את פרוסת המוח.
    3. הזיזו את המטרה לאזור העניינים של המוח.
    4. הנמך את האלקטרודה לתוך הפתרון. תחת השדה הבהיר, להעביר אותו למרכז שדה התצוגה ולבחון אותו בזהירות עם העדשה 40 x טבילה המים כדי להבטיח כי הוא מופיע ברור וללא פסולת או בועות. אם יש משהו שסותם את. קצה האלקטרודה, החלף אותו באחד חדש
      הערה: סתימת הוא דאגה. לMΩ האלקטרודה ה200 עם צנטריפוגה וסינון של פתרון הצבע לפני כל ניסוי, זו לא צריכה להיות בעיה תכופה. עם זאת, בגלל קצה האלקטרודה הוא קטן, הרקמה עשויה לפעמים להיתקע בפתח. המחברים לא מצאו דרך למנוע זאת, אך ניתן לטפל בו בקלות על-ידי שימוש פשוט באלקטרודה חדשה.
    5. שימו לב לקצה האלקטרודה מתחת למיקרוסקופ סריקת לייזר ממוקד עם 488 ננומטר לייזר. לאחר מכן, בדיקת הפליטה של הצבע על-ידי הפעלת הגירוי ב-12 וולט הערה ענן של צבע פלורסנט גדול סביב קצה האלקטרודה בזמן שהגירוי מופעל. אם לא או צבע קטן נפלט על גירוי מתח, להחליף את האלקטרודה.
    6. תחת השדה הבהיר, הנמך באיטיות את האלקטרודה כלפי הפרוסה העוצרת מעל פני השטח.
  2. מילוי אסטרוציט עם יוטופהורזיס.
    1. זיהוי האסטרוציטים 40-50 יקרומטר מתחת למשטח הפרוסה בניגוד להתערבות הדיפרנציאלית באינפרא-אדום (IR-DIC). לחפש תאים עם מוארך, בצורת אליפסה, בקוטר של 10 יקרומטר. ברגע שנבחר אסטרוציט, הזז אותו למרכז שדה הראייה.
      הערה: לתא טוב ליוטופהורזיס יש. גבולות ברורים ומוגדרים סביבו אל תבחרו בתאים קרובים מדי למשטח הפרוסה מכיוון שהם לא יכולים להיות מלאים לחלוטין. זה לוקח קצת תרגול במשך כמה ימים כדי להיות מסוגל לזהות באופן שגרתי אסטרוציטים למילוי צבע. בהתאם לאזור המוח המשמש את הניסוי, מספר האסטרוציטים עשוי להשתנות. זה עשוי להשפיע על הזמן הדרוש כדי לזהות אסטרוציט לפני מילוי.
    2. הנמך באיטיות את קצה האלקטרודה לתוך הפרוסה, מנווט דרך הרקמה, עד שהוא נמצא על אותו מישור כמו גוף התא.
      הערה: להעביר את האלקטרודה לאט כדי למנוע פגיעה ברקמה.
    3. לאחר גוף התא של אסטרוציט הוא ברור לעין מחולקת, לאט ובעדינות לקדם את האלקטרודה קדימה. העבר את האלקטרודה עד שהקצה מחלק את הסומה של התא. להעביר את המוקד של אובייקטיבי לאט למעלה ולמטה כדי לציין אם האלקטרודה היא בתוך הסומה.
      הערה: העצה האלקטרודה חייבת להיות בתוך גוף התא, וכניסה קטנה על סומה צריך להיות נצפתה. אין להזיז את האלקטרודה יותר כדי למנוע את הקצה העובר בתא.
    4. לאחר שעצת האלקטרודות נמצאת בתוך התא, הפעל את מכשיר הגירוי ב-~ 0.5 עד 1 V והוצא את הזרם הנוכחי לתוך התא. , בעזרת מיקרוסקופ הקונמוקד. שים לב למילוי התא הגדל את הזום הדיגיטלי כדי לראות את פרטי התא וודא שקצה האלקטרודה גלוי בתוך התא.
      הערה: הנמך את המתח אם נראה כי הצבע דולף מהתא או ממלא תאים אחרים בסביבה. אם נראה כי הצבע עדיין דולף מתוך התא, למשוך אלקטרודה החוצה לאט ולמצוא תא אחר. חשוב כי הצבע אינו לדלוף יש יחס אות/רקע גבוה בתמונה הסופית.
    5. המתן כ-15 דקות עד שהענפים והתהליכים הטובים יותר יופיעו, כבו את המתח ומשוך בעדינות את קצה האלקטרודה מהתא.
  3. צלם את התא המלא.
    הערה:     ניתן לבצע הדמיה מיד לאחר מילוי או בעקבות הצביעת עם אימונוהיסטוכימיה. מטרה בעלת פתח מספרי גבוה יותר (NA) גורמת לרזולוציה טובה יותר.
    1. המתן עד שהתא יחזור לטופס המקורי לפני הדמיה (15 עד 20 דקות) עם מטרה 40x. כדי לדמות את התא, התאם את ההגדרה באמצעות החיבור כדי לוודא שהענפים והתהליכים הטובים יותר מופיעים כמשמעותם.
    2. הגדר מחסנית z עם גודל שלב של 0.3 μm. בזמן הדמיה, להעביר את המטרה עד שאין אות מתא ולהגדיר את זה כחלק העליון. לאחר מכן, הזז את המטרה למטה (התמקדות דרך התא) עד שאין אות, קבע כי כתחתית.
    3. לאחר השלמת ההדמיה, בדוק את האלקטרודה להוציא את הצבע. אם מופיע ענן צבע גדול, ניתן להשתמש בו לפרוסה הבאה. אחרת, החלף אותו באלקטרודה חדשה.
      הערה: מילוי צבע של אסטרוציט יחיד והדמיה לוקח כ 45 דקות עד 1 h. עבור ניסוי ספציפי זה, ניתן היה להשיג כ 3-6 תאים לכל עכבר. במידת הצורך, ניתן לתייג תאים מרובים באותה פרוסה. עם זאת, כדי להבדיל astrocytes בודדים, הקפד לשמור על מרחק של כ 200 יקרומטר בין התאים.

6. צביעת עם אימונוהיסטוכימיה (אופציונאלי)

  1. לאחר ההדמיה נעשה, מיד למקם את הפרוסה ב 10% פורמלין על הקרח כדי לשמר עבור אימונוהיסטוכימיה. שמרו על פרוסות מוחית בחשכה ואחסנו במשך הלילה ב -4 ° c.
  2. לשטוף את מקטעי המוח 3x ב 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים (כלומר, טריטון X 100) עבור 5 דקות כל אחד. לאחר מכן מודדת בפתרון חוסם של 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים ו 10% סרום עז רגיל (NGS) עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדינה.
  3. מודלת את הסעיפים עם עצבנות בנוגדנים העיקריים מדולל 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים ו 5% NGS עבור 2 ימים ב 4 ° c.
    הערה: בגלל העובי של פרוסות המוח, תקופת הדגירה של הנוגדנים העיקריים צריך להיות מורחב לחדירה טובה יותר ואת ריכוז הנוגדן יכול להיות גדל. בניסוי זה, מ1:500 דילול שימש לנוגדן אנטי GFAP ו-1:500 דילול שימש עבור אנטי אקופורוב 4 נוגדן.
  4. לשטוף את הסעיפים 3x ב 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic הסורסטנט עבור 10 דקות כל אחד ולאחר מכן דגירה עם נוגדנים משניים מדולל ב 0.1 M PBS עם 0.5% nonionic החומרים ו 10% NGS עבור 6 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: אין לבחור נוגדן משני נרגש על ידי 488 ננומטר, אשר הוא אורך הגל המשמש להמחיש את צבע LY. בניסוי זה, 1:1000 דילול שימש לאלקסה Fluor 546 עז נגד עוף IgG (H + L) ו אלקסה Fluor 647 עז אנטי ארנב IgG (H + L).
  5. לשטוף את הסעיפים 3x ב 0.1 M PBS עבור 10 דקות כל אחד. לאחר מכן הר את הסעיפים על מיקרוסקופ זכוכית מחליק במדיה הרכבה מתאים לזריחה. . לאטום שקופיות תאי תמונה בגודל שלב של 0.3 μm.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הנתונים המדווחים במחקר זה הם מ 7-12 תאים מ 4 עכברים בכל ניסוי. נתונים ממוצעים מדווחים בלוחות האיור במידת הצורך.

כדי להעריך את מורפולוגיה אסטרוציט, הצלחנו לבצע בדיקת האסטרוציטים תאיים באמצעות לצבוע למלא אסטרוציטים ב CA1 שכבה רדיואטום, אשר מסוכם באיור 1. איור 2 מתאר את האסטרוציט הייצוגי ומבנה הורפולוגית המשוכלל. התא היה התמונה לאחר פיקסציה עם עדשת השמן 60x טבילה על מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד באמצעות קו הלייזר 488 ננומטר (גודל השלב של 0.3 יקרומטר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארים במאמר זה מתארת דרך להמחיש מורפולוגיה אסטרוציט באמצעות ביוטוזיס תאיים של צבע LY בפרוסות מוחית בקלות. קיימים מספר גורמים קריטיים המסומנים בפרוטוקול זה, התורמים לשחזור מוצלח של התאים ולשיחזור מורפולוגי. גורם אחד הוא האיכות והתוכסות של התמונות, אשר נקבע במידה רבה על ידי גיל העכבר ואת התוצאה של perfusion. במחקר זה, השתמשנו C57/BL6N עכברים 6-8 שבועות בן. פרזיה מוצלחת (התלויה מאוד במיקום הנכון של המחט המושרת ומציינת על-ידי מוח בצבע לבן והעדר דם בתוך המוח) הכרחית לתאים מפורטים וברורים ביותר. לאחר החלוקה על ידי אלק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים מודים לגב סוטו, ד ר יו וד ר אוקטו להדרכה, כמו גם הערות על הטקסט. עבודה זו נתמכת על-ידי NS060677.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% חוצץ פורמלין פוספטפישרSF 100-20ניתן להשתמש בחלופה זהה
מסנני מזרק Acrodisc עם Supor MembranePall 4692ניתן להשתמש בחלופה זהה
/AgCl גלולה טחונהWPIEP2ניתן להשתמש בחלופה דומה
Alexa Fluor 546 עיזים נגד עוף IgG (H+L)Thermo ScientificA-11040ניתן להשתמש בחלופה דומה
Alexa Fluor 647 עיזים נגד ארנב IgG (H+L)Thermo ScientificA27040ניתן להשתמש בחלופה דומה נוגדן
נגד Aquaporin-4Novus BiologicalsNBP1-87679ניתן להשתמש בחלופה דומה
Anti GFAPAbcamab4674חלופה דומה ניתן להשתמש
בפיפטות זכוכית בורוסיליקט עם נימהמכשירי דיוק עולמיים1B150F-4
C57BL / 6NTac עכבריםמלאי TaconicB6ניתן להשתמש בחלופה דומה
סידן כלורידסיגמא21108ניתן להשתמש בחלופה זהה ניתן להשתמש
במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליאולימפוסFV1000MPEחלופה דומה ניתן להשתמש ב
- D-glucoseSigmaG7528זהה ניתן להשתמש בחלופה
דיסודיום פוספטסיגמא255793ניתן להשתמש בחלופה זהה
חולץ אלקטרודות - דגם P-97SutterP-97ניתן להשתמש בחלופה דומה
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01ניתן להשתמש בחלופה זהה
הזרקת נתרן הפרין (1,000 USP למ"ל)Sagent Pharmaceuticals400-10ניתן להשתמש בחלופה זהה תוכנת
Imaris (גרסה 7.6.5)Bitplane Inc.ניתן להשתמש בחלופה דומה
איזופלואורןהנרי שיין בריאות בעלי חיים29404ניתן להשתמש בחלופה זהה ניתן להשתמש
בלידוקאין הידרוכלוריד להזרקה (2%)קוצץ1050035ניתן להשתמש בחלופה זהה ניתן להשתמש
בלוציפר צהוב CH מלח דיליתיוםסיגמאL0259
לוציפר צהוב CH מלח דיפוטסיוםסיגמאL0144
מגנזיום כלורידסיגמאM8266ניתן להשתמש בחלופה זהה ניתן להשתמש בכיסוי
מיקרוסקופ זכוכיתתרמו סיינטיפיק24X60-1ניתן להשתמש בחלופה זהה
שקופיות מיקרוסקופפישר12-544-2ניתן להשתמש בחלופה זהה
מעבדות וקטורסרום עיזים רגילותS-1000ניתן להשתמש בחלופה זהה
עדשת אובייקט (40x)אולימפוסLUMPLFLN 40XWניתן להשתמש בחלופה דומה
עדשת אובייקטיבי (60x)OlympusPlanAPO 60Xניתן להשתמש בחלופה דומה טבליות
PBS, 100 מ"לVWRVWRVE404ניתן להשתמש בחלופה זהה
מיקרומניפולטור פיפטה- דגם ROE-200SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200חלופה דומה יכולה להיות משומש
אשלגן כלוריסיגמאP3911ניתן להשתמש בחלופה זהה נתרן
ביקרבונטסיגמאS5761ניתן להשתמש בחלופה זהה
נתרן כלוריסיגמאS5886ניתן להשתמש בחלופה זהה
ממריץ- דגם Omnical 2010מכשירי דיוק עולמייםOmnical 2010ניתן להשתמש בחלופה דומה
Triton X 100SigmaT8787ניתן להשתמש בחלופה זהה
Vibratome- דגם #3000Pelco100-Sניתן להשתמש בחלופה דומה
Ag נוגדן

מקורות

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261(2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143(2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096(2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים