התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

סיכום

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

תקציר

חקר האינטראקציות בין מיקרואורגניזמים הוביל לתגליות רבות, החל מantimicrobials הרומן ועד לתובנות בתחומי האקולוגיה. גישות רבות המשמשות לחקר אינטראקציות מיקרוביאלית דורשות ציוד מיוחד והינן יקרות ועתירות זמן. נייר זה מציג פרוטוקול לשיתוף פעולה עם תרבות שיתוף, כי הם זולים, מדרגיים למדגם מספרים גדולים, בקלות להתאמה לעיצובים ניסיוניים רבים. מיקרואורגניזמים הם מתורבתים יחד, עם כל המייצגים שילוב אחד זיווגים ומיקרואורגניזמים. אורגניזם מבחן הוא מתורבת בצד אחד של כל היטב מודבטים הראשון בתרבות מונוטוני. לאחר מכן, אורגניזמים היעד מחוסן בו על הצד הנגדי של כל באר באמצעות חותמת החיסון 3D-מודפס. לאחר שיתוף התרבות, השלימה הושלמה הבקיע עבור פנוטיפים חזותיים, כגון צמיחה או עיכוב. מספר זה יכול לשמש כדי לאשר פנוטיפים או לזהות דפוסים בין מבודד של עניין. באמצעות שיטה זו פשוטה ויעילה, משתמשים יכולים לנתח שילובים של מיקרואורגניזמים במהירות וביעילות. זו גישה שיתוף תרבות ישימה לגילוי אנטיביוטי, כמו גם מחקר מבוססי התרבות מיקרובידום והוחל כבר בהצלחה שני יישומים.

מבוא

בטבע, לעתים נדירות מיקרואורגניזמים קיימים בבידוד; כתוצאה מכך, הם מאינטראקציה ללא הרף עם אורגניזמים אחרים. לכן, לימוד כיצד מיקרואורגניזמים מתקשרים אחד עם השני הוא חיוני כדי להבין ריבוי של התנהגויות חיידקים¹. אינטראקציות מיקרוביאלית יכולות להיות מדדיות, מיו, או אנטליסטית. אלה ב teractions יכול להשפיע לא רק את המיקרואורגניזמים עצמם אלא גם את הסביבות והמארחים כי המיקרואורגניזמים ליישב^1,2.

מדענים רבים מחקר אינטראקציות מיקרוביאלית כדי לזהות מולקולות מיקרוביאלית חדש. אחד מולקולות קליניות מיקרוביאלית חשוב הראשון נמצא באמצעות המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית. סר אלכסנדר פלמינג הבחין מזהם Penicליום spp. בידוד כי עכבות את הצמיחה של זן סטייהילוקוקוס , אשר הוביל לגילוי של פניצילין אנטיביוטי נפוץ³. אפיון המנגנונים בהם משתמשים מיקרואורגניזמים כדי להרגיז את המתחרים שלהם נותר משאב פורה לגילוי מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, זה הוכח לאחרונה כי Streptomyces sp. מאמץ Mg1 מייצרת linearmycins אנטיביוטי, אשר יש פעילות lytic ו degradative נגד מקרתגו subtilis⁴.

יתר על כן, פפטיד לא מסונתז בעלי שם לוגדאנב התגלתה לאחרונה לאחר התצפית כי האף המולוקוקוס מעכב אתמחלת הקוקוס המכונה⁵. מחקרים הראו גם כי אינטראקציות מדדיות בין המיקרואורגניזמים הם באותה מידה חזקה כמו אינטראקציות עוינת לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, רבים פטריה-חקלאות נמלים בתוך השבט Attini חיידקים סימביוטי המכונה Pseudonocardia על השלד החיצוני שלהם שמייצר מולקולות פטריות כדי לעכב את הפתוגן מחייב של יבול פטרייתי שלהם⁶. כמו המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית כבר מועיל לגילוי מולקולות מיקרוביאלית, השימוש במסכים תפוקה גבוהה עלול לגרום לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית חדשים.

ביחס לעלות ולקלות הביצועים, המתודולוגיות המשמשות לחקר האינטראקציות של מיקרוביאלית נעות בין פשוטה למורכבת. למשל, שיטת התקע אגר היא שיטה זולה ופשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את האנטניזם בין מיקרואורגניזמים מרובים⁷. עם זאת, שיטת התקע של אגר אינה הליך יעיל והיא יכולה להיות אינטנסיבית לעבודה עבור שילובים רבים של זיווגים. כדי להעריך את ההשפעות של מוצרים מתוצרת microbially על מבודד היעד של עניין באופן תפוקה גבוהה, מעבדות רבות להשתמש הדיסק דיפוזיה בחני⁸. שמות אלה הם קלים וזולים יכול להיות מדרגי למספר גבוה יותר של דגימות⁷. עם זאת, מעשה זה דורש את הדור של תמציות מיקרוביאלית ועשוי לייצר תוצאות מטעה עבור צירופים מסוימים של אורגניזמים ואנטיביוטיקה היעד, כגון סלמונלה ו צפלוספורנס⁹.

הגישות הקודמות מסתמכות על רכיבים מבודדים כדי לעורר תגובה באורגניזם מטרה, במקום לאפשר למיקרואורגניזמים לקיים אינטראקציה זה עם זה. זה של הערה משום שאינטראקציות בין חיידקים עשוי לעורר את הייצור של מולקולות מיקרוביאלית של "סודי" שאינם מיוצרים בתרבית. למשל, זה הוכח לאחרונה כי keyicin מיקרוביאלית מופק רק על ידי מיקרוונוספורמטר sp. כאשר משותף לתרבות עם מעלה sp. כי הוא מבודד מיקרובידום ספוג אותו¹⁰. מתודולוגיות אינטרקציה מורכבות יותר מאפשרות לעקוף את העיכוב הפוטנציאלי בתרבות המונאלית. למשל, ה-iChip שימושי לבידוד נדיר וקשה לטיפוח חיידקים מדגימות סביבתיות ומאפשר התבוננות באינטראקציות מיקרוביאלית באמצעות צמיחה באתרו¹¹. כדי לחקור את האינטראקציות בפרוטרוט, מטריקס סייעה להשתמש בהדמיית לייזר להדמיה בזמן של טיסת הדמיה של המסה ספקטרומטריה (MALDI-תוף-IMS). גישה זו מספקת מידע מפורט על הרכב והפצה של מולקולות קטנות פפטידים המיוצר על ידי אינטראקציה מושבות מיקרוביאלית עם רזולוציה מרחבית גבוהה. Maldi-תוף-IMS שימש גם במחקרים מרובים של אינטראקציות חיידקי כדי לאפיין את מנגנוני התחרות^12,13,14,15. עם זאת, MALDI-תוף-IMS לעתים קרובות דורש הכנה לדוגמה מפרך, מומחיות מיוחדת כדי להפעיל את הציוד, ואת יקר ומיוחדות ספקטרומטר מסה. מסיבות אלה, זוהי טכניקה קשה לשימוש עבור לימודי תפוקה גבוהה. לפיכך, שיטת שיתוף תרבות פשוטה, מדרגית ובעלת תפוקה גבוהה עבור אינטראקציות מיקרוביאלית הגוברת על מגבלות רבות של הגישות הנ ל יהיו מועילות.

כאן מוצג פרוטוקול לתרבות מיקרוביאלית של תפוקה גבוהה. מעשה זה פשוט ומשולב בקלות למחקרים קיימים של אינטראקציות מיקרוביאלית. בניגוד לשיטות רבות בשימוש נפוץ לחקר האינטראקציות של חיידקים, השיטה שלנו היא פשוטה, זולה, והיא קלה לחקירת מספר רב של אינטראקציות. מספר זה לא רק קל לביצוע, אבל החומרים זמינים באופן נרחב מרוב ספקי המעבדה או משאבים ציבוריים (למשל, ספריות, makerspaces). כתוצאה מכך, שיטת החקירה הזאת היא יתרון כשורה ראשונה לזיהוי וניתוח דפוסים מעניינים בקרב שילובי זיווגים רבים של מיקרואורגניזמים, שעשויים להועיל במיוחד לחקירת האקולוגיה של מיקרוביאלית.

פרוטוקול

הסכמה מושכלת הושגה מהוריו של התורם, וועדת האדם באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון אישרה את המחקר (לוח סקירה מוסדי [IRB] אישור מספר H-2013-1044).

1. דוגמא לתרבות

הערה: הליך זה משמש כאן לחקר האינטראקציות בין חיידקים מבודד מחלל האף האנושי. בעיקרון, השיטות הבאות ישימות על כל תנאי תרבות. המוח לב-ציר אינפוזיה (BHI) משמש עבור התפשטות כללית של חיידקים האף. כל הצלחות מתמצנות באמצעות 1.5% אגר. עבור מחקר זה, דגימות נלקחים מתמיסה מלוחים לתוך האף של תורם (שאיפה האף), הועבר לצינורות מיקרוצנטריפוגה, ו קפוא ב-80 ° c.

1. השתמש בטכניקות התרבות הסטנדרטיות לצלחת 100 μL של כל אחד מדגימות השטיפה המופשנות על צלחות BHI.
2. מודטה את הצלחות aerobically ב 37 ° c עבור שבוע אחד.
3. לאחר הדגירה, בחר ≥ 2 מושבות של כל מורפולטיפ שונים לוחית ומעבר את מבודד aerobically על לוחות BHI על ידי הליכה המושבה מן הצלחת הראשונית אל הצלחת BHI חדש ו מודקת את הצלחת ב 37 ° c. . אני חוזר עד שתרביות החיידקים טהורות
   הערה: מבודד חיידקי ניתן לזהות באמצעות מורפולוגיה המושבה, גראם כתמים, רצף הגנים rRNA של 16, או שיטה אחרת. עם זאת, הידיעה שזהותו של הבודד אינה נחוצה להמשך הפרוטוקול.
4. הקפאה מבודדת את כל החיידקים ב-80 ° c לאחר שילוב של 1 מ ל של 50% גליצרול עם 1 מ ל של תרבות לילה חיידקית (ראה סעיף 3) ב קריוצינוריות.

2. חותמות הדפסה תלת-ממדית

הערה: פוליקרבונט נבחר כחומר הטבעה בשל טמפרטורת מעבר זכוכית גבוהה (147 ° c) החורג מטמפרטורות האוטוקלב הסטנדרטיות (121 ° c), אשר ממזער את הפוטנציאל לדפורמציה לאחר שימושים חוזרים.

1. העמיסו את המדפסת התלת-ממדית בחוט פוליקרבונט.
2. החלת דבק בבית הספר הלבן (אצטט פוליוויניל) אל מיטת ההדפסה כדי לסייע הדבקה ולמזער את העיוות של חותמת החיסון במהלך ההדפסה.
3. . העמיסו את המטען קובץ מודל STL (קובץ נתונים משלים) עבור חותמת החיסון (איור 1) לתוכנת המדפסת התלת-ממדית.
4. הדפס את חותמת החיסון בטמפרטורה 290 מעלות צלזיוס, 60 בטמפרטורת מיטה של ° c וגובה שכבה של 0.38 מ"מ.
5. לעטוף את החותמת ברדיד אלומיניום ולעקר על ידי אוטוקלינג עבור 1.5 h על מחזור כבידה עם 15 דקות של ייבוש.
   הערה: למרות פוליקרבונט הוא hygroscopic, החותמות רק לשמור כ 0.5% משקל המים לאחר autoclaving ינג.

3. הכנת תרביות לילה

1. שימוש בצנרת סרוולוגית, פיפטה 3 מ ל של ציר BHI סטרילי ל -14 שפופרות של תרבות mL.
2. באמצעות לולאה מעוקר 1 μL, האיחסן מושבה חיידקית לתוך המרק. מערבולת את הלולאה כדי להבטיח את הגוש מפזר לתוך המרק. מערבולת התרבות צינורות זמן קצר לפני הדגירה.
3. מודטה את צינורות התרבות ב 37 ° c לילה (~ 16 שעות) על שייקר ב 250 סל ד.
4. מערבולת לשבור את הגושים של תאים לאחר התרבויות חיידקי להגיע מספיק עכירות (OD₆₀₀ ≥ 1).

4. הכנת לוחיות ביושיטת הרכב

הערה: לוחיות הרישוי מוכנות במכסה של זרימה שכבתית כדי לשמור על עקרות.

1. הכן מדיה BHI עם 1.5% אגר ולעקר על ידי אוטוקלינג על פי הוראות היצרן.
2. לאחר האוטוקלינג, צנן את מדיית BHI ל-55 ° c באמבט מים מבוקר טמפרטורה.
3. שימוש בצנרת סרוולוגית, פיפטה 3 מ ל של מדיית BHI מותכת לתוך כל 12 הבארות בצלחת 12. ודא כי הבארות הן מדויקות ואפילו ככל האפשר. ליטר אחד של מדיה תניב ~ 27 לוחיות ביוטכנולוגיה.
4. . הניחו לאגר לקבוע לילה

5. לאחר לוחיות בדיקת האורגניזם

הערה: אורגניזם מבחן מתייחס לאורגניזם שעבורו הייצור של פעילות העכבות (למשל, ייצור אנטיביוטי) נקבע באמצעות שיטת האינטראקציה בין תרבות שותפה. בשביל הניסוי הזה, האורגניזמים האלה הם. אקאובקטריה מבודדים מדגימות האף

1. החדרת האורגניזם לבדיקה על צלחת ביולוגית על-ידי הכנסת לולאה מנומנת של 10 μL לתוך התרבות של הלילה ומליטה על ה-droplet של התרבות מעל השליש השמאלי של צלחת היטב.
   הערה: מומלץ לרצף רק שליש מבאר, מאחר שגידול יתר של הבאר אוסר מאוחר יותר על אורגניזמים המטרה.
2. אני חוזר עד שכל 12 הבארות על. הלוחית חוסנו עם אורגניזם הניסוי
3. לוחיות הזיהוי הפוכות בטמפרטורה. המתאימה במשך 7 ימים בטמפרטורות גבוהות יותר (≥ 37 ° c) או באקלים יבש, מאחסנים את הצלחות במיכל לח כדי למנוע מהלוחות להתייבש.

6. הכנת אורגניזמים היעד

הערה: אורגניזם מטרה מתייחס לאורגניזם שמצב העיכוב שלהם נקבע באמצעות שיטת האינטראקציה בין התרבויות. בשביל הניסוי הזה, האורגניזמים המטרה הם. הבודדים מדגימות האף

1. לאחר הדגירה של לוחות ביולוגי 6 ימים, להכין תרבויות לילה של אורגניזמים היעד שצוין, כפי שנעשה לעיל (ראה סעיף 3).

7. אורגניזם היעד החיסון

הערה: לאחר הדגירה הלילה, להבטיח כי התרבויות הם נחל דלוח (OD₆₀₀ ≥ 1). כמה תרבויות בקטריאלי עלולות להיות. מואחרות בתחתית הצינורית התרבותית מערבולת התרבות צינורות לפזר גושים ולהעריך את העכירות תרבות.

1. להכין את לוחית היעד על ידי מילוי כל טוב של ריקה 12 היטב צלחת עם 1.8 mL של BHI ו 200 μL של תרבות לילה היעד.
2. לפתוח ולהציב חותמת חיסון. סטרילית בלוחית היעד מסובב בעדינות את התרבויות סביב הבארות, מטפל כדי להבטיח כי התרבויות לא לחצות מזהם בארות השכנות.
3. הרם את חותמת החיסון וודא שקיימת droplet של תרבות יעד מדוללת על כל קצה של חותמת.
4. הכינו לוחית שליטה מונונובית על ידי הצבת חותמת החיסון על צלחת ביולוגית בלתי מחוסנת והסלע העדין של הבול כך שירידה בתרבות מבטאת כל היטב. לאחר הסרת חותמת החיסון, יש לראות droplet של תרבות בבארות של לוחית העיבוד הביולוגית.
   1. אם בארות כלשהן אינן מחוסנו עם חותמת החיסון עקב רמות מחוספס של מדיה, ספוט 3 μL של תרבות לילה מדולל על הצד הימני של הבארות באמצעות פיפטה.
5. החזר את הלוחות הביותוניים כפי שנעשה לעיל (ראה step 7.4.1), אך יישר את החותמת כך שהעצות יתיישרו עם הצד הימני של 12 הלוחות היטב. ודא שהחותמת אינה מפנה אל המושבה החיידקית הקיימת כאשר היא מקיימת את הבארות.
6. הסר בזהירות את החותמת והמקום חזרה לצלחת היעד.
7. חזור על החיסונים עבור כל צלחת ביולוגית עד שכל הצלחות מחוסנו.
8. לוחיות הרישוי של הבית מודגרות בטמפרטורה המתאימה למשך 7 ימים.

8. ניקוד

1. לאחר שיתוף הבדיקה והיעד של אורגניזמים במשך שבוע אחד, ציון האינטראקציות המבוססות על ההערכה החזותית הבאה:
   1. ציון הבארות עם צמיחת האורגניזם היעד המוצגים צמיחה שאינה מאפשרת להבחין בין שליטה מונותרבותית כ-"0" (ללא עיכוב) (איור 2א, ב).
   2. ציון הבארות עם אורגניזם היעד המוצגים צמיחה מופחתת לעומת השליטה כ "1" (עיכוב חלש) (איור 2ג).
   3. ציון בארות שבו אורגניזם היעד לא לגדול כמו "2" (עיכוב חזק) (איור 2ד).

תוצאות

האינטראקציה בין שיתוף התרבות יכולה לשמש כדי להבין את האינטראקציות של מיקרוביאלית, לזהות דפוסי עניין ולחשוף מיקרוביאלית באמצעות פעילויות מעניינות. באלה מספר, אורגניזם מבחן הוא מונותרבותי בצד אחד של 12 צלחת אגר היטב ומודונבטים במשך 7 ימים. לאחר מכן, אורגניזם היעד הוא הבחין ליד האורגניזם במבחן ושני חיידקים היו שיתוף תרבותי עבור 7 ימים לפני הבקיע את הצמיחה של האורגניזם היעד. The מספר הם הבקיע מבוסס על ניתוח חזותי של הצמיחה או עיכוב של אורגניזם היעד.

דיון

אנטיביוטיקה ומטבוליטים משניים אחרים הבתווך אינטראקציות מיקרוביאלית שימושיות עבור שפע של יישומים, כולל גילוי סמים. במסמך זה, פרוטוקול לשיתוף התרבות המשותף מציג להערכת מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאלית. אלה שיתוף התרבות ההדדית האינטראקציה היא פשוטה, סבירים, מדרגי, תפוקה גבוהה פירושו לחקור שילובים זוגות רבים של מיקרואורגניזמים במקביל. אורגניזמים היעד הם זיהו ליד בדיקת אורגניזמים בבאר של 12 צלחת הבאר באמצעות חותמת חיסון, ועיכוב של אורגניזמים היעד הוא הבקיע מבוסס על בדיקה חזותית של האורגניזם היעד של היצור. רוב החומרים הנמצאי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 μ לולאות חיסון פוליסטירן חד פעמיות L, כחול	VWR	12000-806
10 μ לולאות חיסון פוליסטירן חד פעמיות L, צלחת	VWR	12000-810
12 בארות, סטרילית עם מכסה	Greiner bio-one	665 180
14 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול, 17 x 100 מ"מ 2style, לא פירוגני, בז סטרילי		352057
2.0 צינורות כובע בורג עצמאיים עם כובעים, סטרילי	USA Scientific	1420-9710
25 מ"ל סרולוגי פיפט	תא טיפול	229225B
אגר, בקטריולוגי	VWR	J637
לב עירוי מרק	נקודה מדעית	DSB11000-5000
נימה פוליקרבונט, לבן, קוטר 3 מ"מ	Keene Village Plastics	12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R
דבק בית ספר	Elmer's	EPIE304
מדפסת תלת מימד Taz 6	Lulzbot

תרבית תאים צהובה מוח