מאמר שיטה

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

13K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60309

⸱

17 באוקטובר 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר רגולציה משלימה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכניאולוגיה. אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי ליצור דגימות מועשר מאוד אידיאלי עבור פרוטאומוניקס וברצף עמוק. דגימות אלה יכולות להציע תובנות מכניסטיות חשובות להיבטים מגוונים של פיתוח שרירים.

תקציר

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר תהליכים מגוונים כגון רגולציה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכנילוגיה, המשפיעים על פיתוח שרירים וmyofibrillogenesis. נתונים מסוג omics, כגון אלה המופקים על ידי ספקטרומטר מסה או רצף עמוק, יכולים לספק תובנות מכניסטיות חשובות לתהליכים ביולוגיים אלה. עבור גישות כאלה, מועיל לנתח דגימות ספציפיות לרקמות כדי להגביר את הסלקטיביות והספציפיות של טביעות האצבעות של האומניקס. כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי לייצר דגימות שריר מועשר ביותר עבור יישומים omics. אנו מתארים תחילה כיצד לנתח את שרירי הטיסה בשלבים גולמי מוקדם (< 48 h לאחר היווצרות puparium [apf]), כאשר השרירים ניתן להבחין על ידי חלבון פלורסנט ירוק (gfp) תיוג. לאחר מכן נתאר כיצד לנתח את השרירים מהגלמים המאוחרים (> 48 h APF) או מבוגרים, כאשר השרירים ברורים מתחת למיקרוסקופ מבתר. פרוטוקול הווידיאו הנלווה יהפוך את הניתוח התובעני של הניתוח ליותר נגיש בפני שרירים וקהילות מחקר . עבור יישומי RNA, אנו מתוך שיטת הכמות והאיכות של RNA שניתן לבודד בנקודות זמן שונות ובגישות שונות. אנחנו עוד מראים כי Bruno1 (Bru1) הוא הכרחי עבור משמרת זמנית בשרשרת רירן שרשרת כבדה (Mhc) שחבור, הוכחת כי השרירים ניתן להשתמש עבור mrna-Seq, ספקטרומטר המסה, והפוך שעתוק פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR) יישומים. פרוטוקול הניתוח הזה יסייע לקדם ניתוחים ספציפיים לרקמות והוא יכול להיות מיושם בדרך כלל כדי ללמוד היבטים ביולוגיים מרובים של מיוגנזה.

מבוא

טכנולוגיות מודרניות מספקות תובנות חשובות לפיתוח שרירים ומנגנונים המשמשים כבסיס להפרעות בשריר האדם. לדוגמה, ניתוח של נתונים transcript בשילוב עם אימות גנטי וביוכימיים במודלים בעלי חיים חשף כי אובדן של גורם החדרת RBM20 גורם שריר הלב המורחבים בשל הרגולציה של רשת היעד של יותר מ 30 סרקומר גנים הקשורים בעבר עם מחלות לב, כולל titin1,2,3.

בדוגמה השנייה, מחקרים מתרבות התא, מודלים בעלי חיים, וחולים אנושיים הראו כי ניוון מיוטוני נגרמת על ידי שיבוש בתקנה RNA בשל קיבוע על של מוסקלעיוורים (mbnl) ו upregulation של CELF14,5. הדינמיקה בין הרגולציה והזמן בין MBNL ו CELF1 (נקרא גם CUGBP1 או ברונו-כמו 2) לעזור להסביר את דפוסי שחבור עובריים מתמשך בחולי ניוון מיוכי. בנוסף, רשת גדולה של מטרות מוסדרות עוזר להסביר את האופי המורכב של המחלה4,6,7,8. רוב מחקרים כאלה לנצל גישות omics באורגניזמים מודל גנטי כדי להבין את המנגנון הבסיסי מחלת השריר האנושי. יתר על כן, הם להדגיש את החשיבות של הבנה הראשון הזמני ורקמות מסוג ספציפי ביטוי גנים, שינוי חלבון, דפוסי חילוף החומרים בשריר בריא כדי להבין שינויים בשריר חולה או מזדקן.

דרוזופילה מלאנוסטר היא עוד אורגניזם מודל גנטי מבוסס. המבנה של סרקומר, כמו גם רכיבי סרקומר הפרט נשמרים מאוד מפני זבובים לחוליות4,9,10, ואת שרירי הטיסה עקיף (ifms) הפכו מודל רב עוצמה כדי ללמוד היבטים מרובים של פיתוח שרירים11,12. ראשית, שרירי הטיסה fibrillar הם מבחינה פונקציונלית ו מורפולוגית ברורים מפני שריריהגוף הכרישים 11,13, המאפשר חקירה של סוג שרירים מנגנונים התפתחותיים ספציפיים. גורמים שעתוק כולל Spalt מז (Salm)14, אקסטרדנטילה (exd), ו הומוחזה (hth)15 זוהו כמו fibrillar הגורל הרגולטורים. בנוסף, במורד הזרם של salm, CELF1 הומולוג Bruno1 (Bru1, רט) מנחה תוכנית שחבור מיוחדת לfibrillar,16,17.

שנית, ifms הם מודל חשוב להבנת התהליך של מיוגנזה עצמה, מן היתוך myoblast חוז ומיוטוטר מצורף myofibrillogenesis ו סרקומר התבגרות9,18,19. שלישית, הגנטיקה דרוזופילה מאפשרת חקירת תרומות על ידי חלבונים בודדים, תחומים של חלבונים וחלבון איזוforms למערך, תפקוד ומאפיינים ביופיזיים20,21,22 ,23. לבסוף, מודלים ifm פותחו למחקר של הפרעות שרירים אנושיים מרובים, כגון ניוון מיומני, myofibrillar myopathies, הפרעות ניווניות שרירים, actinopathies, וכו '24,25,26 ,27, וסיפקו תובנות חשובות למנגנוני מחלות ולטיפולים פוטנציאליים28,29,30. לפיכך, דרוזופילה הוא מודל שימושי לטיפול בשאלות פתוחות רבות בתחום המויוגנזה, כולל מנגנונים של תמלול מסוג שרירים, שחבור ורגולציה, כמו גם לתפקיד חילוף החומרים בהתפתחות השריר. היישום של טכנולוגיות omics המודרנית, במיוחד בשילוב עם מגוון רחב של גנטי, ביולוגי, הביוכימיים וביולוגיים הסלולר הזמין ב Drosophila ילה, יש את הפוטנציאל לקדם באופן דרמטי את ההבנה של השריר פיתוח, הזדקנות ומחלות.

Ifms הם השרירים הגדולים ביותר בזבוב, פורש כמעט 1 מ"מ על פני כל אורך החזה במבוגרים31,32. עם זאת, גודל קטן זה מייצר את האתגר של קבלת מספיק מדגם כדי להחיל טכנולוגיות omics ב Drosophila ילה באופן מסוים רקמה סוג. יתר על כן, ifms הם חלק השרירים מבוגרים שנוצר במהלך שלבים גולמי. הפתיל myoblasts חזיק ליצור מיופופרות, אשר לצרף הגידים סביב 24 שעות לאחר היווצרות puparium (apf) ולעבור שלב דחיסה הכרחי כדי ליזום myofibrillogenesis סביב 30 h apf (איור 1a-D)18,33, 34.

סיבי מיואז לצמוח לאורך כל אורכו של בית החזה, עם מיופילס עובר שלב הצמיחה הראשונית התמקדו סרקומר בנוסף עד כ 48 h apf, ולאחר מכן מעבר לשלב התבגרות, שבו סרקומר לגדול באורך וברוחב והם שופצה להקמת מתיחה הפעלה על-ידי 72 h apf (איור 1A-D)32,35. התחלתה של התבגרות סיבים הוא לפחות נשלט באופן חלקי על ידי salm ו-E2F32,36,37, ומספר מרובים של החלבון ifcomere הספציפי שחבור נשלט על ידי Bru1 משולבים במהלך זה שלב16,17. זבובים מבוגרים לאבד מ 90-100 h APF. משמעות הדבר היא כי כדי ללמוד פיתוח שרירים, ifm צריך להיות מבודד עם כמות מספקת, איכות, טוהר ממספר נקודות גולמי מרובים כדי להקל על ניתוח באמצעות omics גישות.

מספר פרוטוקולים לניתוח IFM פורסמו. למרות שפרוטוקולים אלה פועלים היטב עבור היישומים המיועדים שלהם, אף אחד מהם אינו אידיאלי לגישות של omics. פרוטוקולים השמרו על מורפולוגיה ifm עבור מערכת חיסונית של גולמי ומבוגרים ifm19, לבודד סיבי ifm עבור הערכה מכנית31, או לנצל מיקרוניתוח של גולמי ifm מ-קריוסעיפים38 הם מיוחדים מדי זמן ו עבודה אינטנסיבית כדי להשיג באופן סביר כמויות מספיקות של רקמות IFM עבור יישומים omics. פרוטוקולים אחרים פותחו לניתוח מהיר של במיוחד בוגרים ifm38,39, ולכן הם לא חלים על שלבים גולמי, ולהשתמש במאגרים שאינם אידיאליים או יכול להיות לא תואם, למשל, RNA בידוד. לכן, יש צורך לפתח גישות חדשות כדי לבודד גולמי ifm עבור יישומים ביוכימיה או omics.

כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח של ifm במהלך שלבים גולמי שנעשה בהצלחה עבור ניתוח mrna-Seq מ 16 h apf דרך מבוגרים שלבים16,32. הפרוטוקול מעסיק חלבון פלורסנט ירוק (gfp) תווית כדי לזהות את ifms בכל שלבי התפתחות גולמי ומבוגרים, המאפשר לבתר את החיים תחת מיקרוסקופ מנתח פלורסנט. הגישה הינה פחות אינטנסיבית לעבודה, עם תפוקה גבוהה יותר מאשר פרוטוקולי הניתוח הקיימים של IFM. זה מאפשר בידוד מהיר והקפאה של דגימות, יצירת חומר מספיק לאחר מספר סיבובים של ניתוח לגישות omics כמו גם עבור שרשרת סטנדרטית הפוכה בשרשרת התגובה (RT-PCR) או בלוק המערבי.

אנו מציגים את הפרוטוקול בשני חלקים, הדגמת כיצד לנתח במהירות ifms לפני 48 h apf (במהלך הגלגול המוקדם, כאשר קבצים מצורפים ifms הם יותר קלוש) ולאחר 48 h apf (כאשר תוכנית הגוף גולמי וקבצים מצורפים ifms מוגדרים היטב). אנו מדגימים כי אנו יכולים לבודד RNA באיכות גבוהה מ גזור IFMs בכל זמן והצגת נתונים על גישות שונות כדי בידוד RNA ושעתוק הפוכה. לבסוף, אנו מדגימים את היישום של פרוטוקול הניתוח ל-mRNA-Seq, ספקטרומטר מסה, ו-RT-PCR באמצעות CELF1 הומולוג Bruno1 כדוגמה. אנו מציגים ביטוי מיותר של החלבון סרקומר בנתונים פרוטקומקס מ Bruno1 מוטציה ifm ולבחון Bruno1 רגולציה של C-טרמינל אחוי האירוע של שרשרת כבדה רירן (mhc). תוצאות אלו מתארות כיצד הנתונים של omics יכולים לספק הבנה עמוקה יותר של תופעות ביולוגיות, ומשלימים ניסויים גנטיים וביוכימיים.

פרוטוקול

1. היערכות לגלמים

  1. העלאת הזבובים של גנוטיפ הרצוי בבקבוקים (איור 1E). או לעשות היפוך טרי של מלאי החיתוך או להגדיר צלב עם לפחות 20 בתולה נקבה זבובים. לשמור על הבקבוקים עד הזבובים מתחילים להחטה.
  2. איסוף מראש הגלמים עם מכחול מוצוף והעברה לנייר סינון בצלחת פטרי 60 מ"מ (איור 1F).
  3. סקס הגלמים, איסוף המין המתאים לניסוי (איור 1גר'). הזכרים מזוהים על ידי נוכחות של האשכים, אשר מופיעים ככדורים שקופים בגולם האטום האחר.
  4. סמן את צלחת פטרי עם הזמן, התאריך והגנוטיפ, ולאחר מכן הקלד את הגלמים לשלב הרצוי (איור 1ח).
    הערה: שמירה על צלבים/מניות וגלמים בחממה מבוקרת טמפרטורה (כלומר, 25 ° צ' או 27 ° צ' לצלבים RNAi, כמו Gal4 פעילות מוגברת בטמפרטורות גבוהות יותר מגביר את יעילות הדופק40). ודא כי הלחות גבוהה מספיק כך שהגלמים לא יבשים כאשר מזדקנים מספר ימים.

2. ניתוח IFM לפני 48 h APF

  1. להרכיב את הציוד הדרוש כולל שני #5 ביולוגיה כיתה מלקחיים, פיפטה, טיפים פיפטה, קרח יבש, ו (עבור דגימות RNA) בידוד מגיב (ראה לוח חומרים). בנוסף, לצנן את הצלחות שחור (ראה שולחן חומרים), 1x פוספט מתכלה מאגר (PBS) באגירה, ו 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות על הקרח.
  2. באמצעות מברשת צבע, העבירו את הגלמים הממווים לצלחת מבתר שחורה, מלאה בשני שלישים עם הערוץ ה-PBS הקרים (איור 2א, ב). . מעבר למיקרוסקופ פלורסנט
    הערה: השתמשו בכמה שיותר גלמים כפי שניתן לגזור בחלון זמן של 30 דקות. בהתאם לניסיון, נע בין 3 ל-15 גלמים. ראה שיטות משלימות לדיון בחלופות לניתוח שחור.
  3. בעזרת מלקחיים #5, דחפו את אחד הגלמים לתחתית מיכל מבתר שחור והתאימו את מיקרוסקופ הזום והתמקד בבהירות לראות את הגולם (איור 2ג).
  4. אחוז בחלק הקדמי של הגולם עם מלקחיים אחד (איור 2ד), ואז לתקוע את הגלמים עם קצה אחד של המלקחיים האחרים מעט מחוץ למרכז בבטן, ממש מאחורי בית החזה. זה מחזיק את הגולם במקומו ומונע מ-IFMs לנוע לתוך הבטן (איור 2E).
    הערה: התחל בתזמון אורך הניתוח מנקודה זו, ברגע שהיושרה של גולמי מופרת. השתמש באורך מוגדר של הניתוח (לדוגמה 20 – 30 דקות) כדי למזער את מוות השריר ושינויים הקשורים הטרנססקריפט והפרוטאומית. לנתח כמו זבובים רבים ככל האפשר בתקופה זו של זמן.
  5. באמצעות מלקחיים הראשון, להסיר את החצי הקדמי של המקרה גולמי (איור 2F).
  6. השתמשו באותו מלקחיים כדי לצבוט את הגלמים החשופים ממש מאחורי החזה, ולהפריד את הבטן מהחזה (איור 2G).
  7. באמצעות מלקחיים, לסחוט בעדינות את החלק הקדמי של החזה (עבור < 35 h APF) או לקרוע את החזה כדי לחשוף את התווית הפלואורוסקופים (איור 2h). אם Ms בקלות להתנתק מן האפידרמיס, כמו ההחזקות גיד בזמן המוקדמות נקודות שבירות. להשליך את הגווייה הנותרת באמצעות מלקחיים כדי לדחוף אותו לצד הנגדי של המנה.
  8. שלבים חוזרים 2.3 – 2.7, מנתחים גלמים נוספים.
  9. לאסוף את סיבי IFM עם מלקחיים ולארגן אותם לתוך ערימה בתחתית הצלחת מבתר שחור (איור 2I, J). להסיר את כל הפסולת על ידי דוחף אותו מתוך שדה התצוגה באמצעות מלקחיים.
    הערה: עם התרגול, עצות מלקחיים ניתן להגיע קרוב מבלי לגעת זה בזה. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לתפוס באופן רופף IFMs בלי להרוס אותם. שיטות חלופיות כוללות לדחוף בעדינות או להרים את IFMs עם קצה אחד או מלקחיים סגורים לחלוטין, או לקחת קצת שומן או רקמה אחרת עם IFMS והסרת השומן כפי שמתואר בשלב 2.10.
  10. איכות לשלוט בדגימת שריר IFM, באמצעות מלקחיים כדי להסיר שרירי שאינם IFM, שומן, קוטיקולה, וכו ' מן המדגם (איור 2K, L).
    הערה: עם Mef2-Gal4, IFM היא בעלת תווית חזקה יותר מאשר סוגי שרירים אחרים בזמן מוקדם נקודות (איור 2K, k '), המאפשר הסרה של שריר לקפוץ ושרירי זחל מבוסס על עוצמת הזריחה ואת הצורה שריר. שומן, רקמת קוטיקולה נראה שונה לא מתויג על ידי תווית פלואורסצנטית ספציפי שריר (איור 2k, k '). עיין בסעיף הדיונים עבור שורות Gal4 אחרות המתווית את IFM.
  11. באמצעות קצה הצינורות החתוכים, להעביר את ערימת IFMs לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL מלא 250 μL של מקורר 1x PBS (איור 2M-O). . המשך מיד למחלקה 4
    הערה: דגימות IFM עלול לאבד רק על ידי היצמדות לצד הקצה של הפיפטה. ללטף מאגר למעלה ולמטה מספר פעמים לפני איסוף IFMs יכול לעשות טיפים סטנדרטיים פחות דביק, וסיליפיזציה או perfluoroalkoxy (לראות את הטבלה חומרים) עם מתחים פני השטח התחתון יכול לעזור למנוע אובדן לדוגמה.

3. הניתוח IFM לאחר 48 h APF

  1. להרכיב את הציוד הנדרש כולל שני #5 ביולוגיה כיתה מלקחיים, מספריים משובחים, רגיל מיקרוסקופ זכוכית מגלשות, נייר דבק כפול, פיפטה, טיפים פיפטה, קרח יבש, ו (עבור יישומי RNA) בידוד מגיב (ראה לוח חומרים). לצנן את הצינורות 1 x PBS ומיקרוצנטריפוגה על הקרח.
  2. באמצעות מכחול קל, העבירו את הגלמים המבווים לרצועה של סרט דביק כפול-דו-צדדי רכוב על שקופית מיקרוסקופ (איור 3א). מניחים את הגלמים בקו מכוון בכיוון זהה (למטה ולמטה לכיוון תחתית השקופית).
    הערה: היזהרו לא להשתמש ביותר מדי מים על מכחול או מסנן, או הגלמים לא יהיה טוב. אם הגלמים אינם נדבקים, מייבשים אותם על ידי העברה ראשונה לסינון יבש או לנייר טישו. הר כמו הגלמים רבים ככל שניתן לגזור בתוך 30 דקות חלון זמן, באופן אידיאלי ~ 10 הגלמים.
  3. הסר את הגולם מהתיק הפופל. השתמש מלקחיים להקניט לגזרים ולפתוח את המקרה גולמי מעל נושפות הקדמי (איור 3ב).
  4. השקופית בעדינות זוג מלקחיים דורסלי לכיוון האחורי, חיתוך המקרה גולמי כמו מלקחיים להעביר (איור 3ב '). היזהר שלא לקרוע. את הגולם הבסיסי שחרר את הגולם מהתיק הפתוח והעבר אותו מיד לירידה של 1x PBS בשקופית מיקרוסקופ שנייה (איור 3ב', ג).
  5. חזור על שלבים 3.3 ו-3.4 עבור כל הגלמים בשורה, ולאחר מכן הגדר את שקופית הסרט מקל כפול בצד.
  6. בעזרת המספריים העדינים, חתכו את בטן הגולם הרחק מבית החזה ודחפו אותו לערימה נפרדת (איור 3ד, ד). חזרו על הגלמים הנותרים.
    הערה: התחילו את הזמן את אורך הניתוח עם שלב 3.6, ברגע שהשלמות גולמי מופרת. לנתח כמו זבובים רבים ככל האפשר בתוך 20-30 דקות כדי למנוע מוות של תאים והקשורות החלפת הטרנססקריפט והפרוטאומית. כאשר מדובר במבוגר אחד או ב> 90 מעלות הגלמים, נוח לעתים קרובות לצעדים מאוחרים יותר כדי להסיר בנוסף את הראש עם המספריים העדינים.
  7. באמצעות נייר טישו, להסיר את רוב 1x PBS (בדרך כלל מעונן עם שומן מושעה), כמו גם את ערימת בטנם (איור 3E). הוסיפו טיפה של הערוץ החדש, מקורר 1x PBS לשאר הצירים.
  8. השתמשו במספריים כדי לחתוך את בית החזה במחצית (איור 3f, f ') על ידי חיתוך מהראש לאורך ציר הגוף האורכי בתנועה אחת. לחילופין, אם הראש הוסר, הכנס תחילה את המספריים שבהם הראש היה מחובר וחתך את החצי העליון של longitudinally החזה בין השניים. ואז, חותכים את הצד הגחוני של בית החזה עם חתך נוסף באותו אוריינטציה.
  9. חזרו על שלבים 3.7 ו-3.8 לגזור את כל הגלמים, היוצרים ערימה של מפרבית החזה בסמוך למרכז השקופית. ודא שיש מספיק מקורר 1x PBS על השקופית, כך המירות לא להתייבש.
    הערה: לאחר 48 h APF, IFMs הם גדולים מספיק כדי להיות גלויים תחת מיקרוסקופ מבתר רגיל לעין מיומן. בשלב זה בפרוטוקול, ניתן להעביר שרירים עם תווית פלורסנט לתוך ניתוח פלורסנט כדי לסייע בזיהוי IFM או למטרות הכשרה, אך אין צורך בכך.
  10. . לנתח את היציאה מתוך החזה לבודד את אחת ההדמיעות באמצעות מלקחיים #5 (איור 3G, H). בעדינות להוסיף את קצות מלקחיים אחד מעל ומתחת לאמצע של IFMs (איור 3G, H '). בעוד מחזיק את הלקחיים הראשונה עדיין, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך קצה אחד של IFM הרחק מן הקוטיקולה והגידים. ואז, לחתוך את הקצה השני של IFM חינם מן הקוטיקולה (איור 3G ', H ' ').
    הערה: בהתאם לכיוון החזה לאחר החתך הראשון של IFM, היא שימושית לסובב את החזה 180 °, כך שחיתוך השני של IFM יהיה קל יותר לביצוע.
  11. הסר את צרור IFM מן החזה עם מלקחיים (איור 3G ' ', H' '), העברת אותו לקצה של בועת PBS להשתמש במתח המים כדי להחזיק אותו במקום (איור 3I). תדחוף את הגווייה. לצד השני של המגלשה חזור על הפעולה הנותרת בבית החזה, הפקת אוסף של לגזור.
    הערה: אם ה-IFMs לא יישאר בערימה מסודרת, הסר חלק מ-1x PBS עם רקמה. היזהרו לא לתת את כל ה-PBS להתאדות, ולוודא את הגזור את הניתוח ואת המיטוררים להישאר מכוסים על ידי המאגר.
  12. לאחר ניתוח כל הטרשת הנפוצה, במהירות לבצע בקרת איכות על השריר בגזור. באמצעות מלקחיים #5, להסיר כל שריר לקפוץ או שברי הקוטיקולה שאולי מצאו את דרכם לתוך המדגם (איור 3J-K ').
    הערה: שריר הקפיצה מופיע שונה מ-IFM. אם מבתר Mef2-Gal4 התווית שריר תחת פלואורסצנטית, שריר לקפוץ יש זריחה חלשה יותר צורה ומרקם שונים. תחת האור הרגיל, היא נראית כמעט שקופה בעוד שה-IFMs מהווה אטום, צהוב חלבי (איור 3j-j ', K).
  13. שימוש במתח מים, לכידת (אך לא מחצו) הגזור את החלק השני בין זוג מלקחיים (איור 3ליטר). העבר את IFMs לצינור 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה ממולא מראש עם 250 μL של מקורר 1x PBS (איור 3M). . המשך מיד עם סעיף 4
    הערה: כאשר טיפים מלקחיים מובאים בסמיכות זה לזה והרים מתוך פתרון מאגר, מתח מים גורם בועה של מאגר להילכד בין טיפים מלקחיים. אם אם Ms נמצאים גם בבועה זו, הם יכולים להיות הרים מתוך הפתרון והועברו בקלות לשקע אחר מלא מאגר. חשוב לסחוט את המלקחיים כדי להביא את הטיפים הסמוכים אחד לשני בלי לגעת זה בזה, כדי למנוע את רקמת הרקמה שנתפסו בועה מאגר.

4. גלולה ולשמר את דגימת IFM

  1. גלולה IFMs על ידי תפרידו 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת עבור 3 – 5 דקות ב 2,000 x g ב צנטריפוגה שולחן בטבלה (איור 4a, B).
  2. הסר את המאגר באמצעות עצת פיפטה (איור 4ג).
  3. עבור יישומי RNA, השהה מחדש את הגלולה IFM ב-50-100 μL של מאגר בידוד ה-RNA הרצוי (ראה טבלת חומרים, איור 4ד). . אחרת, המשך לשלב 4.4
    הערה: IFMs יכול להיות יבש קפוא לאחר שלב 4.2 עבור ההכנות ספקטרומטר המסה או בידוד של RNA עם ערכות מסחריות (ראה תוצאות מייצגות). עבור יישומי RNA, תוצאות טובות יותר מתקבלות על ידי השעיית מיידית והקפאת הגלולה IFM בבידוד מאגר.
  4. הקפא דגימה על קרח יבש או הקפא בחנקן נוזלי (איור 4E). חנות ב-80 ° צ' עד מוכנים לצעדים הבאים בהכנה לדוגמא לניתוח במורד הזרם.
    הערה: לאחר הקפאת ההזמנה, דגימות ניתן לאחסן במשך כמה חודשים לפני העיבוד לחקירה במורד הזרם.

תוצאות

פרוטוקולי הניתוח שהוצגו לעיל שימושיים להפקת דגימות של אם מועשר מ -16 לאחר היווצרות puparium (APF) עד לשלב המבוגר. גזור דגימות שריר הטיסה ניתן להשתמש עבור יישומים מרובים, ויש עד כה הוחל בהצלחה עבור RT-PCR4,17, RNA-Seq16,32, שבב36,37, המערבי 14,41 וניסויים בספקטרומטר המסה (ראו להלן). כדי לסייע למשתמשים פוטנציאליים לבתר יישומים מבוססי RNA, אנו הראשון להציג את התוצאות שלנו הדגשת שיקולים חשובים במיוחד עבור בידוד של RNA מ-IFMs. כדי להדגים באופן נרחב יותר את כלי השירות של פרוטוקולי הניתוח שלנו, אנו לאחר מכן להמחיש חלק אפשרי – omics יישומים באמצעות הנתונים שלנו על RNA-Bruno1 חלבון.

ניתוח IFM התשואות באיכות גבוהה RNA

חשוב לקבוע את מספר הזבובים שיש לגזור מראש, כמו קידוד mRNA מוערך להוות רק 1 – 5% מכלל RNA42. הגענו בממוצע 24 ± 9 ng של RNA כולל לטוס מ IFM גזור מ 1 d מבוגרים (איור 4F ו משלימה איור 1a), עם תשואות בדרך כלל גדל עם ניסיון. תשואה זו של כולל RNA לטוס הוא קבוע יחסית, תנודות סביב 25 ng עבור IFM גזור 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF ו 90 h APF (איור 4F ו משלימה איור 1B, D, E). תצפיות אלה גם משקפים כל RNA מבודדים מזיהום שומן, גיד, קנה הנשימה או סוגים אחרים של תאים, אשר עשוי להיות גבוה יותר בדגימות מבודדים מנקודות זמן קודמות. כך, הגענו > 1 μg של RNA סך מ IFM מ 50 זבובים ובדרך כלל לנתח IFM מ 100 ל-150 זבובים כדי ליצור > 3 μg של RNA סה כ עבור הדגימות RNA-Seq.

השיטה של בידוד RNA משפיע על כמות ואיכות של RNA ששוחזרו, ואנו מעודדים משתמשים לאמת את גישת הבידוד שלהם. לדוגמה, בעוד בידוד באמצעות שיטה 1 מייצרת בממוצע 1143 ± 465 ng של RNA סך מ IFM מ 50 1 d מבוגרים זבובים, בידוד עם ערכות מסחריות שונות תשואות בכל מקום מ 186 ± 8 ng אל 1261 ± 355 ng של RNA סה כ (איור 4G ו איור משלים 1C). RNA מבודדים מערכות מסחריות הוא בדרך כלל באיכות טובה (איור 4H ו משלימה איור 1f), אבל נמוך שחזורים מראים כי RNA לא ניתן להתחמק ביעילות מן העמודות. שלמות RNA יכול להיות גם בסכנה על ידי שימוש בערכה כפי שנעשה בשיטה 2 (איור 4H, העלילה השנייה), כנראה בשל החוקה מאגר טיפולים חום, המוביל פיצול חמור שיכול להשפיע ניסויים במורד הזרם.

חשוב גם להתבונן בטכניקה המתאימה RNase-free בעת בידוד וטיפול בדגימות RNA. למרות מחזורי הקפאת ההפשרה ו 4 הטמפרטורה בחדר הדגירה לא להשפיע באופן דרמטי פרופילים שלמות RNA, אפילו כמויות קטנות של RNase להוביל השפלה RNA מהירה (איור 4אני ושיטות משלימה). משתמשים עדיין מעודדים לעבוד על קרח להגביל להפשיר כדי למנוע הידרוליזה RNA ופיצול. זה לא זוהה כאן, אבל מניעת זיהום RNase באמצעות עצות סינון מאגרים מטופלים DEPC הוא חיוני בהחלט.

היעילות של תמלול הפוכה משפיעה גם על ההצלחה של יישומים במורד הזרם. הצלחנו להשיג תוצאות אמינות עם שניים מתוך שלוש ערכות RT מסחריות שבדקנו, אשר הן להגביר את הרצועות החזקות RT-PCR עבור גן ריבוזומיום rp49 (איור 4J). עם זאת, RT Kit #2 עשוי להיות רגיש יותר לאיתור של תעתיקים ביטוי נמוך, כפי שקיבלנו להקות חזקות עבור bru1 החלבון RNA-כריכה עבור כל שלוש משכפל ביולוגי (איור 4J). יחד, תוצאות אלה ממחישים כי RNA באיכות גבוהה ניתן לבודד מ IFMs גזור עם הליך זה.

גזור IFMs לייצר באיכות גבוהה mRNA-Seq ו פרוטאומניקס נתונים

שימוש ifm לגזור על פי הפרוטוקול הנ ל 30 h apf, 72 h apf ומתוך 1 למבוגרים זבובים, אנו בעבר הראו כי חלבון מחייב RNA ו-CELF1-הומולוג Bruno1 (Bru1, מעצר, רט) שולט שביל החדרת ספציפי של ifm במורד הזרם של ה גורם שעתוק Spalt מז (Salm)16. Ifms מ-null מוטציות, כמו גם זבובים עם bruno1 rnai שרירים ספציפיים (bru1-IR) להציג מומים צמיחה סרקומר, misregulation של רירן פעילות בסופו של דבר היפרהתכווצות ואובדן של סיבי שריר16,17 . בהמשך אנו להדגים את השירות של גזור IFMs עבור כולו פרוטמטריה המסה ספקטרומטר ולהראות כי כמה שינויים הביטוי שראינו ברמת RNA הם גם ברור על רמת החלבון. אנו מדגישים את האירוע ההתפתחותי מסוים ב- Mhc שנמצא להיות מוסדר על ידי Bruno1, הממחישות כי mrna-Seq ו-RT-PCR מ גזור ifms ניתן להשתמש כדי להדגים את הרגולציה של השתלשלות האירועים החלופיים.

בהתאם לאיכות ולעומק של הספריה, ניתן לנתח נתונים מסוג mRNA-Seq ברמת יחידות הגנים (חישוב ממוצע של ספירות קריאה על כל ההרחבות של הגן), exons בודדים, או אחוי צמתים. mRNA-Seq נתונים מ -bru1-IR ifms בהשוואה לסוג wildtype מציג שינויים חלשים בביטוי על יחידת הגנים ברמה16 (איור 5א). ב 72 h apf, יש כבר מגמה עבור גנים סרקומר כגון חלבון LIM שרירים ב 60a [Mlp60A], אקטין 57 b [Act57B], חלבון שרירים ספציפי 300 kda [Msp300], או מתיחה-mlck [strn-mlck]) כי הם חשובים עבור פיתוח שרירים נאותה להיות מוסדרות ב bru1-IR שריר (איור 5A וטבלה משלימה 1). עם זאת, הצגנו בעבר כי ברמה של exons בודדים, יש הרבה יותר להוריד את הרגולציה של הגנים הספציפיים סרקומר16, מציע את הפונקציה העיקרית של Bruno1 היא לשלוט שחבור חלופיים (שולחן משלים 1 ).

באמצעות שימוש מלא-פרוטמטריה בספקטרומטר מסה על גזור IFMs, אנחנו יכולים להראות תקנה דומה על רמת החלבון (איור 5B ו- טבלה משלימה 2). מבין קבוצות 1,895 פפטיד שאותרו, 524 (28%) מהם הם מוסדרים ב Bru1M2 מוטציה ifm ב 1 d מבוגרים (טבלה משלימה 2). להוריד את השליטה הן Strn-Mlck ו Mlp60A חלבון הוא גם נצפתה, התאמת תצפיות ברמת התעתיק בנתונים mRNA-Seq שלנו. למרות המספר המוגבל של פפטידים במסד הנתונים המפות לחלבונים ספציפיים (ראה שיטות משלימות לפרטים ניתוח), עבור חלבונים סרקומר tropomyosin 1 (Tm1), אישר (למעלה/TnT), mhc, כפוף (bt/המקרין) ו פאריוסין (prm) אנחנו להתבונן upregulation של פפטידים מאחד isoform ו-downregulation של אחר (איור 5B), מאשרת התצפיות הקודמות שלנו של תקנה דומה על RNA ברמה16. זה מדגים כי גזור IFMs שימושיים עבור שניהם mRNA-Seq ו פרוטאומניקס יישומים.

כדוגמה נוספת לאופן שבו נתוני omics יכולים להשלים את הגישות המסורתיות כדי לשפר ולהרחיב את התובנה הביולוגית, בחרנו להתמקד בשחבור ב-C-טרמינוס של Mhc. קו מלכודת חלבון שאפיינו בעבר נקרא weeP26 מוכנס לתוך אינטרון הסופי של mhc43,44 (ראה שיטות משלימות למיקום מדויק). weeP26 מכיל אחוקטור חזקה והוא משולב כנראה כל התעתיקים Mhc (איור 5ג). עם זאת, GFP התווית חלבון ב-IFM משולבים בשתי "נקודות" משני צדי הקו, תוך שריר הרגל, היא משלבת באופן אחיד על פני קו M וחלש על פני חוטים עבים (איור 5E). Orfanos ו ספארו הראו אלה "נקודות" בטופס ifm בשל התפתחות mhc isoform התפתחותית: הטופס mhc isoform ביטא לפני 48 h apf הוא gfp מתויג כמו weeP26 אקסון מוסיף במסגרת לקרוא פתוח, בעוד mhc isoform הביע לאחר 48 h apf הוא בלתי מסומן, כמו weeP26 אקסון הוא כלול במורד במורד הדרך של לעצור קודון 3 '-utr44.

נתוני ה-mRNA-Seq שלנו אפשרו לנו לאפיין את הביטוי C-terminal Mhc בפירוט רב יותר. בעוד שני הפסקות mhc שונות דווחו43,44, הנתונים שלנו mrna-Seq וביאור flybase הנוכחי (FB2019_02) מראים כי יש למעשה שלושה השני האפשרות השני מאחוי האירועים ב mhc C-טרמינוס (exon 34-35, 34-36, או 34-37) (איור 5ג), אשר אושרה על ידי RT-PCR (איור 5ד). weeP26 Gfp מוכנס אינטרון בין exon 36 ו 37; כך, כמו שניהם Exon 34-35 ו Exon 34-36 איזוforms להכיל להפסיק את הקודונים, GFP יכול לתרגם רק ב Exon 34-37 איזוform (והתוצאה היא Exon 34-GFP-37). אנחנו עוד יכולים לראות את הרגולציה הטמפורלית והמרחבית של כל Mhc . ב IFM, אנו צופים מתג Mhc Isoform מ exon 34-37 כדי exon 34-35 בין 30 h apf ו 48 h apf (איור 5ג, D, F) ב 27 ° c, למרות שזה עדיין לא נראה על ידי immunofluorescence בשנת 48 h apf (איור 5E). הרגליים כבר לבטא תערובת של Exon 34-37 ו Exon 34-35 ב 30 h APF, ועל ידי 72 h APF לבטא את כל שלושת Mhc איזוforms (איור 5D, F). שריר הקפיצה למבוגרים (TDT) גם מבטא את כל שלושת Mhc איזוforms (איור 5F), הרומז זה נכון בדרך כלל עבור השרירים הסומטיים הצינורי. לפיכך, נתוני mRNA-Seq שלנו מאפשרים הרחבה של ממצאים קודמים על-ידי צמצום מסגרת הזמן עבור הבורר Mhc isoform ב-ifm והאפיון של שימוש בשרירי הצינורי.

לאחר מכן נבחנו התקנות Mhc איזוform ב- salm ו- bru1 מוטציה ifm. בשני המקרים, ראינו חוסר התקנה של weeP26. Salm מוטציה ifms להיכשל להשלים את הבורר ההתפתחותי ביטוי Mhc הגברת ודפוסי שחבור הרגל פניהעתק בשלבים מאוחרים יותר, כולל הרווח של Exon 34-36 אירוע (איור 5F). זה מסכים עם ממצאים קודמים כי אובדן של Salm התוצאות שינוי הגורל כמעט מלאה של IFM לשריר הצינורי16. Bru1-IR ו Bru1 מוטציה ifm, דומה salm-/- ifm, שומר על האירוע exon 34-37 אחוי בשלבים מבוגרים (איור 5E, F), וכתוצאה מכך דפוס התיוג weeP26 gfp דמוי שריר הרגל, אבל זה לא לקבל את האירוע Exon 34-36. הדבר מצביע על כך שBruno1 הכרחי ב-ifm לפחות שליטה חלקית במתג ההתפתחותי באמצעות שחזור אלטרנטיבי של mhc , אך הוא מצביע על כך שגורמי שחזור נוספים מוסדרות גם בהקשר של salm-/-הקשר. יתר על כן, דוגמה זו מתארת כיצד RT-PCR ו-mRNA-Seq נתונים גזור IFM יכול להיות בעל ערך בהשגת הבנה עמוקה יותר של מנגנוני שחבור התפתחותיים מורפולוגיות הנצפים ליקויים.

figure-results-1
איור 1: ifm פיתוח והיערכות של גלמים. (A) סכמטי של פיתוח ifm ב 24 h apf, 32 h apf, 48 h apf, 72 h apf, ומבוגרים 1 d מראה דחיסה של שרירי הטיסה (ירוק) ב ~ 32 h apf וצמיחה סיבים הבאים כדי למלא את בית החזה. . הגידים בצבע אפור כהה (ב) מיקוד של תמונות קבועות של ifms מפני הספר הפתוח (24 שעות, 32 h, 48 h)19 או בראש החזה (72 h, 1 יום) ויטראז עבור אקטין (rhodamine phalloidin, מגנטה) ו-gfp (ירוק). (ג, ד) תמונות של קרינה מג GFP בגלמים חיים הממחישות שלמות IFM מורפולוגיה של קו החיתוך לעוף במישור (C) או לרוחב (D) המטוס. כוכביות מציינים מיקום IFM. (ה) להתכונן לניתוח, מניות לעוף צריך להיות התהפך או צלבים להגדיר 3 – 4 ימים מראש. (ו) הגלמים מסומנים בצבע לבן שלהם (חץ ראשי צהוב) ומבודדים באמצעות מברשת צבע (f ', f '). (ז) הגלמים צריכים להיות מחולקים כדי להפריד נקבות מן הזכרים המבוססים על נוכחות של האשכים המופיעים כדורים שקופים ממוקמים באופן שקוף (כוכביות צהובות). (ח) הגלמים מיושנים על נייר סינון במנות 60 מ"מ. סולם ברים = 100 יקרומטר (ב), 1 ס"מ (C, D, E, H), 1 מ"מ (f, f ', G). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הניתוח של ifms לפני 48 h apf. (א) תוספת של מאגר PBS של 1 x לצלחת מבתר שחורה עם פיפטה העברה. (ב) העברת גלמים מבויים באמצעות מברשת צבע. (ג) מתחת למיקרוסקופ פלורסנט, כדי להמחיש את ה-gfp, דוחף את הגולם לתחתית צלחת מבתר בעזרת מלקחיים #5 (המתואר באפור). ה-"X" במעגל מציין תנועה לתוך התמונה. (D, E) אוחז מתוך הגלמים (ד), ולאחר מכן דוחף את הגלמים מאחורי החזה (E). מקף במעגל אינו מציין שום תנועה. (F, G) משיכת עם מלקחיים הקדמי (חץ) כדי להסיר את המקרה גולמי (F), ולאחר מכן הסרת הבטן (G). (ח) חזרה על C-G עבור מספר גולם. קווים מנוקדים צהובים ממוספרים לציון הגלמים התורמים. (I, J) השימוש של מלקחיים (I) כדי לבודד את IFMs מן הרקמה הסובבת (J). נקודה בעיגול מציינת תנועה מחוץ לעמוד. (K, L) הסרת מזהמים כולל שרירי השומן והקפיצה (K) כדי ליצור מדגם IFM נקי (L). TDT יש ביטוי GFP נמוך וצורה שונה מאשר סיבי IFM (K '). (M, N, O) שימוש בעצת פיפטה חתוכה (M) לאיסוף גזור IFMs (N) והעברתו לצינור מיקרוצנטריפוגה (O). סולם ברים = 1 ס"מ (A, B, M, O), 1 מ"מ (C-G), 500 יקרומטר (H-L, N). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הניתוח של ifms לאחר 48 h apf. (א) יישור הגלמים על קלטת כפול-סטיק. (ב) הסרת הגלמים מהמקרה הפופל באמצעות פתיחת הפתיח (ב), גזירת המקרה (ב), והוצאת הגולם (ב). סמלים מעגלים המיוצגים באופן זהה לאיור 2. (ג) העברת גלמים לאגירה. (ד) הסרת הבטן על ידי גזירה עם מספריים (חצים כפולים צהובים) והפרדה מ Thoraxes (d '). (E, F) תוספת של מאגר נקי (E), ולאחר מכן חיתוך של ת'ורגרזנים במחצית longitudinally (f, f). (G, H) ניתוח ניתן לבצע תחת אור לבן (G) או זריחה כדי להמחיש את GFP (H); חיתוך של IFMs בצד אחד (G '), ואז הצד השני (G ' '); להרים מתוך החזה עם מלקחיים (המתואר באפור) (G ' '). (I, J, K) אוסף של IFMs במאגר (I) והסרה של חוט העצב הגחוני (VNC), בטן, ושריר לקפוץ (TDT) (J) כדי ליצור מדגם IFMS נקי (K). TDT יש ביטוי GFP נמוך וצורה שונה מאשר סיבי IFM (J ' ', K '). (L, M) השימוש מלקחיים כדי להעביר IFMs (L) לצינור מיקרוצנטריפוגה (M). סולם ברים = 1 ס"מ (A, E, M), 1 מ"מ (ב-D ', F-L). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ifm שימור ופרטי בידוד RNA. (א) ifms מפלדים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 2000 x g. (ב) ifm גלולה (חץ) ו גלולה תחת זריחה (ב). (ג) הסרת כל המאגר עם טיפ של פיפטה. (ד) להפקת רנ א, השעיית מחדש של גלולה בתוך מאגר בידוד. ניתן לדלג על שלב זה כדי להקפיא הקפאה יבש. (ה) הקפאת מדגם בחנקן נוזלי או בקרח יבש ואחסון בשעה-80 ° c. סולם ברים = 10 ס"מ (A), 1 מ"מ (ב, ב), 1 ס"מ (C, D, E). (ו) ננוגרמות (ng) של RNA סך מ גזור ifm המתקבל לכל לטוס ב 16 h apf, 24 h apf, 30 h apf, 48 h apf, 72 h apf, 90 h apf, ו-1 d מבוגר. קווי שגיאה = SD. (G) סך RNA מבודדים מ ifm גזור מ 50 1 d מבוגרים זבובים באמצעות שיטות החילוץ השונים. קווי שגיאה = SD. (H) מייצגים עקבות שלמות RNA לאחר שיטות מיצוי שונות. הלהקות הריבוזומבית פועלות בדיוק מתחת 2000 נוקלאוטידים (nt) ולהקת הסמן ב -25 nt. מרשמים נוספים זמינים באיור המשלים 1. (I) נציג עקבות של מדגם RNA מבודד טרי (למעלה), דוגמה להקפיא הקפאת 25x על קרח יבש (העלילה השנייה), מדגם שמאלה עבור 4 h על הספסל (העלילה השלישית), ומדגם שטופלו RNase A (העלילה התחתונה). הערה השפלה מלאה של RNA בתוספת RNase A. (J) RT-PCR ג'ל מ ערכות כפי שכותרתו עבור bru1 ו rp49. העוצמה היחסית של הפס הbru1 מנורמלת נגד rp49 מותווה למטה. קווי שגיאה = SEM (לא מזווג t-test, p = 0.0119). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: יישום הניתוח של ifm לחקירת Bruno1 פונקציה בחבור חלופיות. (A) מגרש הר געש של Mrna-Seq נתונים (יחידת גנים) מ ifms גזור ב 72 h apf. גנים כי הם מוסתות באופן משמעותי בין bru1-IR לבין wildtype (padj < 0.05, abs (היומן2FC) > 1.5) מוצגים בכחול, וגנים שאינם משמעותיים באפור. חלבונים sarcomere מודגשים באדום, ולבחור גנים מתויגים. (ב) מגרש הר הגעש של שלמות הפרוטמטריה של המסה התוצאות של מבוגרים 1 d ifms. חלבונים שונים באופן משמעותי בין מוטציות מ רברוו-wildtype (רוזוולט < 0.05) מוצגים בצבע כחול, חלבונים לא משמעותיים באפור. חלבונים sarcomeric מודגשים באדום. פפטידים המתאימים לגנים ב (א) מסומנים באדום. סטים של מיפוי פפטידים לצורות איזוforms שונות של אותו חלבון מסומנות באותו צבע. (ג) הערכה של ה-c-טרמינוס של mhc הממחישות שונות של תעתיק ומיקום ההכנסה של מלכודת הגנים weeP26 (ראה שיטות משלימות לנקודת ההכנסה). הצבע התחל-PCR מסומן כקווים שחורים מעל התעתיקים. לקרוא ספירות עבור קילובסיס למיליון בסיסים (RPKM) מ-mrna-Seq מוצגים עבור ifms גזור מן wildtype ב 30 h apf (כתום) ו 72 h apf (אדום), מ bru1-IR (כחול) ו- salm-/- (ציאן) ב 72 h apf ומכל הרגל (ירוק) ב 72 h . (ד) RT-PCR עם התחל נגד mhc מראה את מתג האיזוטופס ב-ifm בין 30 h apf ומעלה נקודות זמן. האירוע Exon 34-35 אחוי הוא רק חלש מבחין ב- ברוM3חשבונאי ifm או ברגל המבוגר. (E) תמונות confocal וקד של לוקליזציה weeP26 gfp ב wildtype ifm sarcomeres ב 48 h apf ו 90 h apf לעומת 90 h apf שריר הרגל. שינוי קנה מידה = 1 μm. (ו) אחוי הצומת הנתונים מתוך נתוני mrna-Seq עבור הגנוסוגים ונקודות זמן כתווית. קריאות הצומת מוצגות כיחס של האירוע אחוי מסוים (אקסון 34 כדי 35 באפור, 34 כדי 36 בסגול, ו 34 כדי 37 בירוק) לאירועים מספר כולל שיתוף אקסון 34 אחוי תורם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
משלימה איור 1: (א, ב, ג) RNA תשואות מתוך דגימות של גנוטיפ זהה לגזור על ידי החוקר אותו באותו שבוע. לאחר גזור כל הדגימות, RNA היה מבודד ונמדד באותו יום. (A) ננוגרמות (ng) של ה-RNA הכולל שהושג מניתוח IFM לזבוב מבוגר אחד. קווי שגיאה = SEM. (ב) סה כ RNA שהתקבל מ גזור IFM לטוס ב 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF ו-1 d מבוגר. (ג) RNA סה כ מבודדים מ IFM גזור מ 50 1 d מבוגרים זבובים באמצעות שיטות החילוץ השונים. (ד) הכולל ריכוזי RNA לכל לטוס מפני גזור, שריר לקפוץ (tdt) ו-ifm. יותר RNA מתקבל מ-IFMs גדול יותר. קווי שגיאה = SD. (E) הכולל ריכוזי RNA לכל זבוב של ifm גזור מפקדים לעומת rnai או דגימות מוטציה ב 30 h apf, 72 h apf ו-1 d מבוגר. עבור מוטציות, w1118 שימש שליטה wildtype. נתוני המוטציות מודרו מ -bru1-IR, salm-/- ועוד מוטציה של חלבון מחייב RNA. שים לב כי עבור מניפולציות אלה, התשואות RNA ירדו ב 1 d מבוגר בשל ניוון שרירים ואובדן, כך זבובים יותר צריך להיות גזור כדי להשיג כמויות מספיקות של גישות omics. סרגלי שגיאות = SD. (F) עקבות נוספים המראים שלמות rna עבור שיטות בידוד rna המוצג באיור 4G ו באיור משלים 1c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
שיטות משלימות: תיאור מפורט של השיטות והריאגנטים המשמשים לאורך כל הטקסט, בפרט, כדי ליצור את הנתונים המוצגים באיור 1A-D, איור 4F-K, איור 5, שולחן משלים 1, ו שולחן משלים 2. נתונים אלה להמריץ את פרוטוקול הניתוח ולהפגין את השירות שלה עבור בידוד RNA, mRNA-Seq, RT-PCR, ו פרוטאומניקס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור 5 ופסקאות משויכות בטקסט הראשי
שם טאבתקציר נתונים
חלבונים sarcomereרשימה של הגנים סרקומר מספאות ואח '. Elife 2018; כאן אנו מפרט את ה-FBgn הנוכחי ואת שם הגנים.
SP units_DESeq2_72h גןשימוש בנתונים מ-spletter ואח ' embo נציג 2015, חיפשנו באופן ספציפי בגנים סרקומר בנתונים mrna-Seq ב 72 h apf. זה מהניתוח DESeq2 מזהה ביטוי דיפרנציאלי ברמת היחידה של הגן בין השליטה (Mef2-Gal4, UAS – GFM-גמה מעבר w1118) ו Mef2-Gal4, UAS-הגמה-x Bruno1-IR. שורות המסומנות בצהוב הן בעלות מעלה או למטה גנים מוסדרים (מעל/מתחת לסף של log2FC = abs (1.5)). נתונים אלה הם שכבת-על של נקודה אדומה באיור 5A. עבור כל גן סרקומר, אנו מספקים מידע מזהה, את log2FC מ DESeq2, p ערך וערך p מותאם, כמו גם ספירות ביטוי מנורמל DESeq2.
SP exon_DEXSeq_72hשימוש בנתונים מ spletter ואח ' embo נציג 2015, חיפשנו במיוחד ב סרקומר גן אקסון שימוש בנתונים mrna-Seq ב 72 h apf. מדובר בניתוח DEXSeq הזיהוי של השימוש הדיפרנציאלי בין השליטה (Mef2-Gal4, UAS-GFM-גמה לw1118) ו Mef2-Gal4, UAS--גמה x Bruno1-IR. שורות המסומנות בצהוב מסומנות באור למעלה או למטה exons מוסדרים (מעל/מתחת לסף של log2FC = abs (1.5)). אנו מספקים אקסון ומידע מזהה גנטי, log2FC מ dexseq, p ערך מותאם ערך p, כמו גם רשימה של התעתיקים המשויכים.
אנא שימו לב כי גנים רבים מציגים רגולציה של הרחבות אחת או יותר בניתוח DEXSeq, לעתים קרובות עם ערכי log2FC גבוהים ו-P נמוך ערך/להתאים ערכי P, בעוד רשימה מוגבלת של גנים מראה שינויים ב 72 h APF. זה תומך בהשפעה חזקה של אובדן של ברונו על הרגולציה של שחבור אלטרנטיבי.

טבלה משלימה 1: טבלה של 72 h apf mrna-מידע Seq עבור החלבונים סרקומר המזהה הגנים הביעו מהותית (דרך DESeq2) ו exons (באמצעות dexseq) ב bru1-IR vs. wildtype ifms.

איור 5B ופסקאות משויכות בטקסט הראשי
שם טאבתקציר נתונים
פלט פרסאוסזהו גיליון אלקטרוני של נתונים מעובדים המציג את נתוני הספקטרומטר ההמוני המשמשים להפקת איור 5B. דגימות IFM הן מ-1 d בקרת מבוגרים (w1118) ו-מוטציה (bruno1-M2) זבובים. עמודות חשובות הן ערכי העוצמה המשתנים עבור כל אחד מ-4 המשכפלת עבור כל דוגמה, הסטטיסטיקה והמשמעות של מבחן t, מזהי הפפטיד ושמות הגנים המתאימים ומזהי ה-Flybase. מסמנים חושבו באמצעות הגדרות סטנדרטיות בפרסאוס (רוזוולט <. 05). ישנם 1859 חלבונים/פפטידים זיהה, אשר 524 (28%) שונים באופן משמעותי בין הדגימות.
הפחתת מוסדריםאלה הם כל 252 חלבונים/פפטידים מהפלט פרסאוס כי הם מוסדרות ב-bruno1-M2 מוטציה IFM. כמו מזהי Flybase ושמות הגנים מיושנים, אנו מספקים בנוסף את מזהה הגנים הנוכחי של Flybase ואת שם הגן.
אוגולולבטיםאלה הם כל 272 חלבונים/פפטידים מהפלט פרסאוס כי הם upregulated ב bruno1-M2 מוטציה IFM. כמו מזהי Flybase ושמות הגנים מיושנים, אנו מספקים בנוסף את מזהה הגנים הנוכחי של Flybase ואת שם הגן.
הינכם מתבקשים לשים לב כי החלבונים סרקומר המסומנים באדום באיור 5b נמצאים ברשימות הנ ל. רשימת הגנים הנחשבים לחלק של סרקומר זמין באחת הכרטיסיות בטבלה משלימה 1.

שולחן משלים 2: שולחן של כל מידע מחקר המסה-ספקטרומטריה של מבוגר 1 d זיהוי באופן מהותי הביע חלבונים וחלבונים איזוטפסים ב- ברוM2מוטציה נגד. מסוג wildtype-IFMs.

דיון

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את הטכניקה הבסיסית לנתח את דרוסופילה ifms מפני גלמים מוקדם ומאוחר לבידוד של חלבון, DNA, RNA או קרו אחרים. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול לנתח IFM מזבובים למבוגרים. אנו מדגימים את השירות של פרוטוקול הניתוח שלנו עבור mRNA-Seq, פרוטאומיקס ו-RT-PCR יישומים. עם שיפור מתמשך של טכנולוגיות omics כדי לאפשר ניתוח של דגימות עם חומר התחלתי פחות וריכוזי קלט נמוך, הניתוחים הללו יהיו בעלי ערך רב עבור יישומים נוספים רבים. כמו ifms הם מודל מבוסס עבור האדם myopathies4,24 ו-סוג שריר הפיתוח הספציפי9,12, אנו לדמיין, למשל, אם מועשר טבולומיקס, חקירות של כרומטין קונפורמציה באמצעות 3C או 4C, החדרת הערכה לרשת באמצעות האינטראקציות של CLiP או של פוספהו-פרוטאומניקס של myofibrillogenesis.

חשוב לשקול שניתוח זה מפיק דוגמה מועשרת עבור IFM במקום דגימת IFM טהורה. זה בלתי נמנע עקב מנוע העצב המנוע, ההחזקות גיד והחדירה הקנה של סיבי שריר. ניתן להשתמש בניתוח ביואינפורמטיקה כדי לזהות את הגנים או החלבונים המועשר של IFM, אך ניסויים נוספים נדרשים להדגים כי הם בעצם הינם ספציפיים ל-m. טוהר לדוגמה יכול להיות הרים באמצעות סמנים ספציפיים רקמה שפורסמה כגון פס45 (גיד), Act79B4,44 (שריר הכרישים), Act88F15 (ifm), או syb46 (ספציפי עצבי). ייתכן שיהיה ניתן להשתמש בסמנים כגון לנרמול ערכות נתונים לתוכן הספציפי ל-IFM, אך משתמשים מהזהרתי כי השינויים הטמפורלית בביטוי הגנים המשמשים לנורמליזציה, לדוגמה גנים ספציפיים של IFM או טובולין, עלולים להיות מוטה בגישה כזו.

מקודד גנטית שיטות תיוג ספציפי לתוויות, לדוגמה EC-תיוג47,48 או פאבפ-תוויות49,50 עבור בידוד RNA פותחו בשנים האחרונות, אשר עשוי לסייע להשיג באמת דגם RNA ספציפי לרקמות. עם זאת, התיוג EC דורש הזנה מתמדת של זבובים47 ולכן אינו ישים במהלך שלבים גולמי. הרגישות והשלמות של ההמרה המסומנת ב-פאבפי התווית עשויות להיות בעלי מגבלות51. FACS גישות לבידוד סיבי שריר בודדים הם מסובכים על ידי גודל גדול והאופי הסינציאני של IFMs. 52שלמים,53 גישות בסגנון ניתן להחיל על בידוד מסוימים בתאי הסלולר של ifms, אשר עשוי להוכיח שימושי עבור בידוד אוכלוסיות טהורות של הגרעין ifms או המיטואום. ניתוח ידני הוא עדיין התקן הנוכחי להשגת רקמות IFM שלמות עבור רוב יישומי במורד הזרם.

איכות הדוגמה תלויה במספר שלבים קריטיים בתהליך החיתוך. הניתוח מאוד תובעני, עם מהירות החיתוך וטוהר המדגם הולך וגובר עם ניסיון. מבתר לפרקי זמן קצרים (20 – 30 דקות) במאגר מקורר ללא חומרי ניקוי והקפאה מיידית מסייעת לשמר את השלמות לדוגמה, כפי שנצפתה בעבר עבור גיד העכבר בידוד54. IFMs ניתן בהצלחה יבש-קפוא לאחר הסרת כל מאגר מתוך הגלולה, אבל במיוחד עבור בידוד RNA, הקפאת דגימות במאגר בידוד נוטה להפיק תוצאות טובות יותר. אם ms מתוך עד 20 הניתוחים הנפרדים משולבים לפני RNA או חלבון בידוד, המאפשר לטפס למעלה ואיסוף חומר מספיק, אפילו מנקודת זמן מוקדמת או מוטציות16,32, עבור ניתוח במורד הזרם.

עבור יישומי RNA, הצעד הקריטי ביותר עשוי להיות הבידוד של ה-RNA עצמו. גואנידיניום thiocyanate-פנול-כלורופורם בידוד (שיטה 1 מעל) מבצעת את רוב ערכות מסחריות נבדק, כפי שצוין קודם לכן, הוא הרבה פחות יקר55. ההבדלים שנצפו ב-RNA תשואות בידוד עם ערכות מסחריות הוא בהסכמה עם תצפיות קודמות56,57. אנחנו עוד להוסיף גליקוגן במהלך משקעים איזופנול כדי לעזור לשחזר את כל RNA. מעבר לתשואה RNA, חשוב לוודא שלמות RNA כדי להבטיח שמדגם לא היה מפוצל או מושפל במהלך תהליכי הניתוח והבידוד. זה חיוני גם לעבוד RNase-חינם. לבסוף, הבחירה של RT-kit יכול להשפיע על הרגישות של תהליך התמלול הפוכה. למרות שלא לעיתים קרובות דנו בפרטים, כל הנקודות האלה משפיעות על איכות המדגם IFM ואת הנתונים שהתקבלו מיישומים במטה.

מספר שינויים חשובים מגדיר את הפרוטוקול מלבד פרוטוקול ניתוח IFM קיים. למרות שפרוטוקול הניתוח המפורט לצורך החיסונית של IFM מתקיים ב-19, פרוטוקול זה מציג גישה שונה לניתוח פופל המאפשר בידוד מהיר יותר של רקמת ifm. הדבר מאפשר איסוף של כמויות גדולות של רקמת IFM (דיבור יחסי) עם זמני ניתוח מוגבל כדי למנוע שינויים בפרוטאום או בהמרה. פרוטוקולים אחרים מתארים את החיתוך של מבוגרים ifm עבור ויזואליזציה של כתמים gfp ב בודדים מיופיבריס39 או עבור כתמים של זחל גוף-השרירים הקיר58, אבל הם לא מטפלים בניתוח בשלבים גולמי או לבידוד של RNA או חלבון. גישה זו היא גם ברורה מן הפרוטוקול הקיים עבור מיקרוניתוח של גולמי ifms מ-קריוסעיפים38, אשר עשוי לייצר דוגמה לטהור ifms אבל הוא יותר עבודה אינטנסיבית ומייצרת פחות חומר. לעומת אחרים מהירה ביותר מהיר הפרוטוקולים ifm לנתיחה38,39, ifm מבודדים במאגר PBS ללא אבקת כדי להגביל אינדוקציה מתח ושינויים ביטוי העיקריים אחרים.

ההתקדמות המפתח בפרוטוקול זה היא הכללה של עיתונאי חי, פלורסנט, המאפשר בידוד של ifms בשלבים גולמי מוקדם. אנו משתמשים באופן בMef2-GAL459 נהיגה או uas-CD8:: gfp או Uas-gfp:: גמה60. זה מאפשר תיוג דיפרנציאלי של ifm (שרירי הטיסה הם בעלי תווית חזקה יותר בצורה שונה מאשר שרירי גולמי אחרים), כמו גם ביצועים של GAL4-uas מניפולציות מבוססי, למשל הצלה או ניסויים rnai. ניתן גם לשלב Mef2-GAL4 עם אמבטיה-GAL80Ts כדי להימנע rnai-הקשורים מוקדם למניעת הרמוניה או עם uas-Dcr2 להגדיל את היעילות rnai40.

ישנם מנהלי התקנים GAL4 נוספים או gfp-קווים זמינים המשתנים בספציפיות לסוג השריר, תבנית ביטוי זמני וחוזק מנהל התקן19,61 שניתן להשתמש בהם במקום Mef2-GAL4. לדוגמה, Act88F-GAL4 מבוטא לראשונה סביב 24 h apf, כך שלא ניתן להשתמש בו עבור נקודות זמן קודמות; עם זאת, זה מאוד לתייג IFM והוא עשוי להיות שימושי כדי להימנע RNAi-הקשורים מוקדם הקשורות. אותו-Gfp או Act88F-GFP התווית ifm, שוב עם הגבלות הזמן, אבל הם להימנע GAL4 התלות של ביטוי סמן יכול להיות שימושי בשילוב עם רקע מוטציה של עניין. רשימות של שורות סמן אפשריות אחרות זמינות19. יש לציין גם כי השימוש טרנסגנים ו GAL4/UAS מערכת עלולה לגרום לכלוכים ביטוי גנים, כך חשוב להשתמש בפקדים מתאימים, למשל קו הנהג חצה את זן הרקע מסוג פראי, כך חפצים כאלה הם ככל הנראה אותו הדבר בכל הדגימות.

עם הווידאו הנלווה, זה פרוטוקול מפורט שואפת להפוך גולמי ifm לבצע ניתוח נגיש יותר ולקדם את השימוש בגישות omics ללמוד פיתוח שרירים. הזיווג של הכוח של דרוזוהילה גנטיקה וביולוגיה של התאים עם הביוכימיה והאומניקס מציע נגישות דרך גזור ifm יש את הפוטנציאל לקדם הבנה מכניסטית של מיוגנזה ותפקוד השריר. מחקרים עתידיים המקשר בין מערכות תצפיות ברמה של בקרת השליטה והפרוטקות כדי פלטי מטבולית ופונקציונלי יספק הבנה עמוקה יותר של השריר סוג מסוים התפתחות הפתוגנזה של הפרעות שריר.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו אסירי תודה לאנדריאס לדבנר ולפרנק שנוררר לתמיכה נדיבה. אנו מודים סנדרה Esser לסיוע טכני מעולה Akanksha Roy ליצירת מידע ספקטרומטר המסה. אנו מכירים במרכזי המניות של בלומינגטון ווינה לאספקת זבובים. אנו מודים למרכז הביודמיה של מיתקן לעזרה עם דימות ממוקד ו Zentrallabor, פרוטאינאנליטיק לניתוח של דוגמאות ספקטרומטר המסה, הן במרכז הביו-רפואי LMU (מרטיסריד, DE). העבודה שלנו היתה נתמכת על ידי הגרמני Forschungs Geמיישלסירכתיים (MLS, SP 1662/3-1), המרכז למדעי החלבון המשולב במינכן (מינכן) ב לודוויג-מקסימיליאן-אוניברסיטת מינכן (MLS), הפרדריק באוור Stiftung (MLS), והמקס הבינלאומי בית הספר למחקר פלאנק (EN).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5x High Fidelity (HF) bufferThermo FisherF518L
60 מ"מ כלי תרביתSigma-AldrichZ643084-600EAכלי גריינר, 60 מ"מ x 15 מ"מ, מאוורר
כלי חיתוך שחור (זכוכית)Augusta Laborbedarf42021010Lymphbecken, זכוכית שחורה, 4 ס"מ x 4 ס"מ
כלי חיתוך סיליקון שחור: אבקת פחם פעילSigma-AldrichC9157ניתן להשיג גם ברוב בתי המרקחת
כלים לניתוח סיליקון שחור: Sylgard 184Sigma-Aldrich761036הכלים מיוצרים על ידי ערבוב הסילגארד (~50 גרם) עם אבקת פחם פעיל (200 מ"ג) וריפוי בכלי פטרי (~4 כלי 60 מ"מ).
עלי כחולSigma-AldrichZ359947-100EAכל עלי גלולה שניתן לעקר, ניתן להשתמש בו גם עם מטחנה מונעת
מצלמת טלפון סלולרי, Samsung Galaxy S9SamsungSM-G960F/DSהמשמש לתמונות שלא צולמו תחת מיקרוסקופ
כלורופורםPanReac AppliChemA3691,0500
מיקרוסקופ קונפוקלי, Leica SP8X זקוף קונפוקליLeica
מיקרוסקופ קונפוקלי www.leica-microsystems.com, Zeiss LSM 780 קונפוקלי הפוךZeisswww.zeiss.com
סרט מקל כפולסקוטש/3M3M ID 70005108587סרט דו צדדי, זמין ברוב המטפלים בציוד משרדי
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools11252-20Inox קצה ישר 11 ס"מ, דרגת ביולוגיה עם קצה 0.05 מ"מ x 0.02 מ"מ
EtOH (100%, RNase חינם)Sigma-Aldrich32205-M
, מצלמת Leica DFC310 FXLeicawww.leica-microsystems.com
תוכנת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, Leica Application Suite (LAS) גרסה 4.0.0Leicawww.leica-microsystems.com
מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, Leica M165 FCLeica
www.leica-microsystems.com זבוב: Bru1 [M2]מלאי זבוב; מאמר זה
זבוב: Bru1 [M3]Fly stock; נייר זה
זבוב: Mef2-GAL4מרכז המניות בלומינגטוןBDSC:27390זבוב סטוק
זבוב: salm[1]מרכז המניות בלומינגטון3274זבוב סטוק
זבוב: salm[FRT]זבוב מלאי; ראה Spletter et al., Elife, 2018
זבוב: UAS-Bru1IRמרכז המחקר וינה דרוזופילהGD41568זבוב, RNAi סיכת ראש
זבוב: UAS-GFP::GMAמרכז המניות של בלומינגטוןBDSC:31776זבוב סטוק
זבוב: UAS-mCD8a::GFPבלומינגטון סטוקסנטר BDSC:5130זבוב סטוק
זבוב: w[1118]בלומינגטון סטוקסנטר 3605זבוב סטוק
זבוב: weeP26זבוב מלאי; ראה קליין ואחרים, גנטיקה, 2003
GFP זיהוי ריאגנט, GFP-BoosterChromoTekgba488-100
GlycogenInvitrogen10814-010
תוכנת עיבוד תמונה, פוטושופ CS6Adobewww.adobe.com
IsopropanolSigma-AldrichI9516-25ML2-פרופנול
שיטה 1 (בידוד RNA): TRIzolLife Technologies15596018תמיסה מונופאזית גואנידיניום איזותיוציאנט ופנול
שיטה 2 (בידוד RNA): שיטה 1 + TURBO ערכה נטולת DNAInvitrogenAM1907בידוד TRIzol ואחריו טיפול בערכה להסרת DNA
שיטה 3 (בידוד RNA): Direct-zol RNA Miniprep Plus KitR2070SZymo Researchב-TRIzol, אך מעל עמודות מסחריות במקום להשתמש בהפרדת פאזה. טיפול מומלץ ב-DNase שבוצע עם Monarch Dnase I במאגר התגובה של Monarch DNase I.
שיטה 4 (בידוד RNA): RNeasy Plus Mini KitQiagen74134השתמשנו בטיפול ה-DNase שסופק. כדורי IFM הומוגניים במאגר RTL כפי שהוצע לרקמות בעלי חיים.
שיטה 5 (בידוד RNA): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep SystemPromegaZ6110יישמנו את הפרוטוקול עבור ' טיהור RNA מרקמות סיביות'.
שיטה 6 (בידוד RNA): ערכת Monarch Total RNA Miniprep NewEngland BiolabsT2010Gיישמנו את הפרוטוקול עבור רקמות/לויקוציטים וליזה ב-300 μ L של מגיב הגנת RNA.
צינורות מיקרוצנטריפוגהתרמו פישרAM12400צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"ל
שקופיות מיקרוסקופתרמו פישר12342108שקופיות סטנדרטיות, לא טעונות, להבי מיקרוטום 1 מ"מ
PFM Medical207500003C35 נוצה 80 מ"מ
Monarch DNase Iניו אינגלנד BiolabsT2004-21
Monarch DNase I מאגר תגובהחדש England BiolabsT2005-21
סרום עיזים רגילThermo Fisher16210072
OneTaq PolymeraseNew England BiolabsM0480X
PaintbrushMarabu1910000000Marabu Fino Round No. 0, או מברשת דומה מכל אספקת אמנות
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS buffer (1x)Sigma-AldrichP4417טבליות מלח חוצצות פוספט לתמיסות 1 ליטר, pH 7.4
PFA PureTip קצות פיפטהElemental ScientificES-7000-0101תחליף אופציונלי לקצות פיפטה סטנדרטיות להפחתת אובדן הדגימה; 100 מ"ל, פתח 0.8 מ"מ
Phusion High Fidelity PolymeraseThermo FisherF-530XL
קצות פיפטהSigma-AldrichP5161פיפטה אוניברסלית 200 מ"ל טיפים
Preomics iST 8x KitPreomicsP.O.00001ערכת הכנת פפטידים לספקטרומטריית מסה
Q ספקטרומטר מסה אקסאקטיביThermo Fisher725500ספקטרומטריית מסה בוצעה ביחידת ניתוח החלבונים של המרכז הביו-רפואי LMU
Qubit ערכת בדיקת RNA LifeTechnologiesQ32855
רודמין-פלואידיןInvitrogen, בדיקות מולקולריות
10063052 ריכוז RNA גישה 1 & עקבות שלמות RNA, BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA
ריכוז RNA גישה 2, NanodropThermo FisherND-2000
RNA ריכוז גישה 3, קיוביט 4 פלואורומטרInvitrogenQ33238
RNA שבבי פיקוAgilent Technologies5067-1513
RNase APromegaA7937
מים ללא RNase, דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)Sigma-AldrichD5758DEPC מטפלים במים למשך הלילה ולאחר מכן אוטוקלאב, כדי להסיר את כל ה-RNase.
ערכת RT #1: ערכת תמלול הפוך Super Script IIIInvitrogen18080-044ערכת תמלול הפוך
ערכת RT #2: ערכתתמלול הפוךNew England BiolabsE3010S
ערכת RT #3: ערכת תמלול הפוך של QuantiNova ערכת תמלול הפוךQiagen205410
מאגר הרכבה לשקופיות, מעבדות וקטור VectashieldH-1200מכיל DAPI
תוכנה סטטיסטית: GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
תוכנה סטטיסטית: Microscoft ExcelMicrosoftנרכש במסגרת החבילה: Office Home & סטודנט 2019
צנטריפוגה שולחניתEppendorf5405000760Eppendorf צנטריפוגה 5425 או שווה ערך
רקמות / KimwipesSigma-AldrichZ188956מגבוני טישו סטנדרטיים
העברת פיפטהSigma-AldrichZ350796פיפטה מפלסטיק
Triton-X100Sigma-AldrichT9284-500ML
מספרייםקפיציים של VannasFine Science Tools15000-003 מ"מ קצה חיתוך, קוטר קצה 0.05 מ"מ, אורך 8 ס"מ
נייר WhatmanSigma-Aldrich1004-070עיגולי נייר סינון, כיתה 4, 70 מ"מ
מצלמת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בידוד RNA של R2070S של LunaScript

מקורות

  1. Rexiati, M., Sun, M., Guo, W. Muscle-Specific Mis-Splicing and Heart Disease Exemplified by RBM20. Genes. 9 (1), 18(2018).
  2. Guo, W., et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nature Medicine. 18 (5), 766-773 (2012).
  3. Guo, W., et al. Splicing Factor RBM20 Regulates Transcriptional Network of Titin Associated and Calcium Handling Genes in The Heart. International Journal of Biological Sciences. 14 (4), 369-380 (2018).
  4. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Ravichandran, K., Wittner, A., Spletter, M. L. Conserved functions of RNA-binding proteins in muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 110, 29-49 (2019).
  5. Wang, E. T., et al. Dysregulation of mRNA Localization and Translation in Genetic Disease. The Journal of Neuroscience. 36 (45), 11418-11426 (2016).
  6. Wang, E. T., et al. Antagonistic regulation of mRNA expression and splicing by CELF and MBNL proteins. Genome Research. 25 (6), 858-871 (2015).
  7. Kalsotra, A., et al. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20333-20338 (2008).
  8. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. The EMBO Journal. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  9. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mechanisms of Development. 144, Pt A 92-101 (2017).
  10. Iwamoto, H. Structure, function and evolution of insect flight muscle. Biophysics. 7, 21-28 (2011).
  11. Schnorrer, F., Dickson, B. J. Muscle building; mechanisms of myotube guidance and attachment site selection. Developmental Cell. 7 (1), 9-20 (2004).
  12. Spletter, M. L., Schnorrer, F. Transcriptional regulation and alternative splicing cooperate in muscle fiber-type specification in flies and mammals. Experimental Cell Research. 321 (1), 90-98 (2014).
  13. Benoist, P., Mas, J. A., Marco, R., Cervera, M. Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene. A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification. Journal of Biological Chemistry. 273 (13), 7538-7546 (1998).
  14. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  15. Bryantsev, A. L., et al. Extradenticle and Homothorax Control Adult Muscle Fiber Identity in Drosophila. Developmental Cell. 23 (3), 664-673 (2012).
  16. Spletter, M. L., et al. The RNA-binding protein Arrest (Bruno) regulates alternative splicing to enable myofibril maturation in Drosophila flight muscle. EMBO Reports. 16 (2), 178-191 (2015).
  17. Oas, S. T., Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Arrest is a regulator of fiber-specific alternative splicing in the indirect flight muscles of Drosophila. The Journal of Cell Biology. 206 (7), 895-908 (2014).
  18. Kim, J. H., Jin, P., Duan, R., Chen, E. H. ScienceDirect Mechanisms of myoblast fusion during muscle development. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 162-170 (2015).
  19. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 2-14 (2014).
  20. Rai, M., Nongthomba, U., Grounds, M. D. Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Mice and Flies. Mechanisms of Regeneration. 108, Elsevier Inc. 247-281 (2014).
  21. Swank, D. M., Wells, L., Kronert, W. A., Morrill, G. E., Bernstein, S. I. Determining structure/function relationships for sarcomeric myosin heavy chain by genetic and transgenic manipulation of Drosophila. Microscopy Research and Technique. 50 (6), 430-442 (2000).
  22. de Joussineau, C., Bataillé, L., Jagla, T., Jagla, K. Diversification of muscle types in Drosophila: upstream and downstream of identity genes. Current Topics in Developmental Biology. 98, 277-301 (2012).
  23. Maqbool, T., Jagla, K. Genetic control of muscle development: learning from Drosophila. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 28 (7-8), 397-407 (2008).
  24. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: Emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Seminars in Cell & Developmental Biology. 64, 171-180 (2017).
  25. Haigh, S. E., et al. Drosophila indirect flight muscle specific Act88F actin mutants as a model system for studying congenital myopathies of the human ACTA1 skeletal muscle actin gene. Neuromuscular Disorders. 20 (6), 363-374 (2010).
  26. Batonnet-Pichon, S., et al. Myofibrillar Myopathies: New Perspectives from Animal Models to Potential Therapeutic Approaches. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (1), 1-15 (2017).
  27. Kreipke, R. E., Kwon, Y. V., Shcherbata, H. R., Ruohola-Baker, H. Drosophila melanogaster as a Model of Muscle Degeneration Disorders. Current Topics in Developmental Biology. 121, 83-109 (2017).
  28. Souidi, A., Zmojdzian, M., Jagla, K. Dissecting Pathogenetic Mechanisms and Therapeutic Strategies in Drosophila Models of Myotonic Dystrophy Type 1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4104(2018).
  29. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other Model Organisms for Sarcomeric Muscle Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 642, 192-206 (2008).
  30. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1184, 1-20 (2010).
  31. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  32. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, 1361(2018).
  33. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Current Biology. 24 (7), 705-716 (2014).
  34. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 72, 56-66 (2017).
  35. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  36. Zappia, M. P., Rogers, A., Islam, A. B. M. M. K., Frolov, M. V. Rbf Activates the Myogenic Transcriptional Program to Promote Skeletal Muscle Differentiation. Cell Reports. 26 (3), 702-719 (2019).
  37. Zappia, M. P., Frolov, M. V. E2F function in muscle growth is necessary and sufficient for viability in Drosophila. Nature Communications. 7 (1), 10509(2016).
  38. Bryantsev, A. L., et al. Myogenesis in Drosophila melanogaster: Dissection of Distinct Muscle Types for Molecular Analysis. Methods in Molecular Biology. 1889 (5), 267-281 (2019).
  39. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  40. Kaya-Çopur, A., Schnorrer, F. RNA Interference Screening for Genes Regulating Drosophila Muscle Morphogenesis. Myogenesis. 1889, Chapter 20 331-348 (2019).
  41. Chechenova, M. B., et al. Functional redundancy and non-redundancy between two Troponin C isoforms in Drosophila adult muscles. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 760-770 (2017).
  42. Alberts, B. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York, NY. (2017).
  43. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green fluorescent protein tagging Drosophila proteins at their native genomic loci with small P elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  44. Orfanos, Z., Sparrow, J. C. Myosin isoform switching during assembly of the Drosophila flight muscle thick filament lattice. Journal of Cell Science. 126 (1), 139-148 (2013).
  45. Volohonsky, G., Edenfeld, G., Klambt, C., Volk, T. Muscle-dependent maturation of tendon cells is induced by post-transcriptional regulation of stripeA. Development. 134 (2), 347-356 (2007).
  46. Estes, P. S., Ho, G. L., Narayanan, R., Ramaswami, M. Synaptic localization and restricted diffusion of a Drosophila neuronal synaptobrevin--green fluorescent protein chimera in vivo. Journal of Neurogenetics. 13 (4), 233-255 (2000).
  47. Hida, N., et al. EC-tagging allows cell type-specific RNA analysis. Nucleic Acids Research. 45 (15), 138(2017).
  48. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PLoS ONE. 7 (7), 40276(2012).
  49. Yang, Z. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucleic Acids Research. 33 (17), 148(2005).
  50. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  51. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 1775-1821 (2015).
  52. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9691-9704 (2012).
  53. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  54. Grinstein, M., Dingwall, H. L., Shah, R. R., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A robust method for RNA extraction and purification from a single adult mouse tendon. PeerJ. 6 (8), 4664(2018).
  55. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , (2012).
  56. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), 16(2018).
  57. Ford, K. L., et al. Optimisation of laboratory methods for whole transcriptomic RNA analyses in human left ventricular biopsies and blood samples of clinical relevance. PLoS ONE. 14 (3), 02136855(2019).
  58. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harbor Protocols. (8), 5469(2010).
  59. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Developmental Biology. 176 (1), 143-148 (1996).
  60. Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34 (1-2), 146-151 (2002).
  61. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. Journal of Visualized Experiments. (132), e57312(2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GFPRNART PCRBruno1
חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.