מאמר שיטה

השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה

8.6K צפיות

DOI:

10.3791/60314

8 בפברואר 2020

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ברור גרורות תא כליות קרצינומה של תאים היא מחלה ללא מודל בעל חיים כולל לחקירה יסודית מראש. פרוטוקול זה ממחיש שני מודלים של בעלי חיים חדשניים עבור המחלה: מודל העכבר המושתל אורתולמריחה ומודל ממברנה של עוף כוראלואלי, שניהם הפגינו גרורות בריאות הדומה למקרים קליניים.

תקציר

ברור גרורות תא הכליה קרצינומה של תאים (ccRCC) הוא סוג המשנה הנפוץ ביותר של סרטן הכליה. CcRCC מקומי יש תוצאה כירורגית חיובית. עם זאת, שליש מהחולים ccRCC יפתחו גרורות לריאות, אשר קשורה לתוצאה גרועה מאוד עבור חולים. למרבה הצער, אין טיפול זמין בשלב זה קטלני, כי המנגנון המולקולרי של גרורות נשאר ידוע. זה ידוע במשך 25 שנים כי אובדן הפונקציה של פון היפפל-ינדאו (VHL) גן מדכא הגידול הוא pathognomonic של ccRCC. עם זאת, לא נוצר מודל העכבר הטרנסגניים רלוונטי קלינית של ccRCC. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג ולהשוות שתי מודלים בעלי חיים שהוקמו לאחרונה עבור ccRCC גרורתי. הראשון הוא השתלת כליות במודל העכבר. במעבדה שלנו, המערכת לעריכת גנים CRISPR היה מנוצל כדי להפיל את הגן VHL בכמה קווי תא RCC. אורתוקרט השרשה של אוכלוסיות ccRCC הטרוגנית לקפסולה כליות יצרה מודלים ccRCC הרומן לפתח גרורות ריאות חזקה בעכברים המוסמכת. המודל השני הוא מערכת קרום כוראלואלי של עוף (CAM). בהשוואה למודל העכבר, מודל זה הוא יותר זמן, עבודה, וחסכוני. מודל זה תמך גם היווצרות הגידול חזק ומלא. בשל הקצר 10 תקופה של גידול הגידול ב CAM, לא גרורות גלוי נצפתה על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) ברקמות העובר שנאספו. עם זאת, כאשר גידול הגידול הוארך על ידי שבועיים בעוף מקווקו, מיקרומטר נגעים ccRCC נצפו על ידי IHC בריאות. אלה שני דגמים מראש רומן קליני יהיה שימושי כדי ללמוד עוד מנגנון מולקולרי מאחורי גרורות, כמו גם להקים חדש, החולה נגזר xenografts (PDXs) לקראת פיתוח של טיפולים חדשניים עבור ccRCC גרורתי.

מבוא

קרצינומה של תאי הכליה (RCC) הואהסרטן הנפוץ ביותר 7 בארצות הברית. מדי שנה, 74,000 אמריקאים מוערך להיות שאובחנו לאחרונה, חשבונאות עבור יותר מ 14,000 מקרי מוות (ברור תא משנה היסטולוגית, או ccRCC, הוא סוג המשנה הנפוץ ביותר, חשבונאות עבור כ 80% של מקרים RCC. חולים עם ממאירות מותאמים לשפות אחרות מטופלים עם כריתת הנפרוטומיה ויש להם שיעור חיובי הישרדות 5 שנים של 73%1. עם זאת, 25%-30% מהחולים לפתח גרורות רחוקות איברים חיוניים כגון הריאות, וכתוצאה מכך הישרדות עני מרושע של 13 חודשים ושיעור ההישרדות של 5 שנים של רק 11%1,2,3. הבנה נוספת של מנגנון גרורתי ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ולהשתמש הוועדה (IACUC), המיועדים הוועדה לחקר בעלי חיים של הקנצלר UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 ו ARC 2017-102-01A). פרוטוקול 2002-049-53 הוא אופטימיזציה עבור ההשתלה של התאים הסרטניים ccRCC לתוך קפסולת הכליה של עירום או BALB/c עכברים. ניסויים בהשתלת הגידול בביצים עוף מופרות לפני הבקיעה אינו דורש אישור IACUC. כדי להאריך את הזמן להקמת גרורות ריאות, העוברים עם גידול CAM מותר לבקוע ולצמוח לתוך תרנגולות. פרוטוקול 2017-102-01A מכסה ניסויים אלה בעלי חיים.

1. אורתוטופית לימודי הגידול בעכברים

הערה:ציר הזמןלניסוי זה מוצג באיור 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל ניסוי בוצע לפחות 3 x, אלא אם נכתב אחרת. נתונים מוצגים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). המשמעות נקבעה על ידי מבחן T של סטודנט משויך, כאשר היו שתי קבוצות או על-ידי ANOVA בכיוון אחד כאשר היו שלוש קבוצות או יותר. הפסקת ערך p של 0.05 שימש לקביעת משמעות.

מושתל אורתולמריחה תאים RENCA גדל בהצלחה על הכליות עכברים, כפי שאושרו על ידי בלי מ& E הצביעת (איור 2א-ב). למרות שלא היה כל הבדל בצמיחה.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבור חולים רבים עם ממאירות אפיתל, גרורות לאיברים חיוניים הוא הגורם העיקרי לתמותה. לכן, חיוני למצוא את המנגנון הבסיסי ואת השדרה החדשה של טיפול במחלה גרורתית. למרבה הצער, יש היעדר מודלים של בעלי חיים מגרורתי הרלוונטיים. האתגר בחלק הגדול נובע מחוסר יכולת לשחזר ccrcc בעכברים למרות הדור של כליות הטרנסגניים רבים האפיתל ממוקד vhl מודליםהעכבר 9,10. כאן, אנו להדגים את השיטות כדי ליצור הוהשתלות גרורות ccRCC גידול בשתי מערכות בעלי חיים, העכבר ומצלמת העוף. ממצאים אלה אומתו ה.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

העבודה הזאת ממומנת על ידי מענק הזרע JCCC באוניברסיטת ucla, המענק 3R של ucla, UCLA CTSI, ו-UC TRDRP (LW). אנו מודים למכון לדימות מראש של מכון Crump, TPCL, ו-UCLA של מחלקת רפואת בעלי חיים במעבדה (DLAM) על עזרתם בשיטות נסיוניות. Cy, הזרמת מחלות של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (JCCC) והמרכז לחקר האיידס של מכון המחקר Cy, הנתמך על ידי מכונים לאומיים של פרסי בריאות P30 CA016042 ו 5P30 AI028697, ועל ידי JCCC, מכון האיידס של UCLA, בית הספר לרפואה ע ש דויד גפן באוניברסיטת קליפורניה, משרד הקנצלר של UCLA, ומשרד המחקר של סגן הנשיא באוניברסיטת ucla. שירותי ייעוץ וניתוח נתונים לסטטיסטיקה סופקו על ידי תוכנית ביוסטטיסטיקה, אפידמיולוגיה ותכנון מחקר (BERD) הנתמכת על יד....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין, 0.1% EDTA ב-HBSS ללא סידן, מגנזיום ונתרן ביקרבונטקורנינג25053CI
8050-N/18 ערכת כלים מיקרו 8V MaxDremel8050-N/18
נוגדן נגד VHLAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 מזרקי אינסוליןBD Biosciences14-826-79
BD פארם ליזBD Biosciences
BD שימוש כללי ודיוק מחטים היפודרמיות FisherScientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-Luciferin Firefly, מלח אשלגןGoldbioLUCK-1G
DPBS ללא סידן ומגנזיוםGibcoLS14190250
DYKDDDDK תג נוגדן חד שבטי (FG4R)eBioscience14-6681-82
אתנול 200ניהול צילינדרים43196-11הכן 70% במים
סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDAפישר סיינטיפיק10-437-028
פישרברנד מספריים חיתוך מחודדיםפישר סיינטיפיק08-940
פישרברנד כדורי כותנה סטרילייםפישר סיינטיפיק22-456-885
Fisherbrandפינצטה/מלקחיים מחודדים דיוק גבוהBeautiful Scientific12-000-122
Fisherbrandצינורות מיקרוצנטריפוגה פרימיום: 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק05-408-129
סולן פורמלדהיד, 4%, חוצץ, pH 6.9 (כ-10% סולן פורמלין), להיסטולוגיהMilliporeSigma1.00496.5000
מזרק מותאם אישית המילטוןהמילטון8040825 ומיקרו; L, דגם 702 SN, מד: 30, סגנון נקודה: 4, זווית: 30, אורך מחט: 17 מ"מ
נוגדן HA-probe (Y-11)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc805
המוציטומטרHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo KitIncubator WarehouseHB1588D
תמיסת איזותזיה (איזופלורן) HenrySchein Animal Health1169567762
IVIS Lumina II In Vivo ImagingSystem Perkin Elmer
Matrigel GFR MembraneMatrix CorningC354230
Medline וילון מכשיר כירורגי Medline, דבק שקוף, 24 אינץ' x 18 אינץ'Medex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [סרום בקר אלבומין] בידוד הלם חוםMilliporeSigma2910-25GM
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100X, 10,000 יחב"ל פניצילין, 10,000ug/mL סטרפטומיציןפישר סיינטיפיקMT-30-002-CI
פנטוברביטל נתרןסיגמא אולדריץ'57-33-0הכן 1% במי מלח
פרוקסידאז AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
תמיסת פובידון-יוד USP, 10% (w/v), 1% (w/v) יוד זמין, לשימוש במעבדהRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 בינוני (מוד) 1X עם L-גלוטמיןקורנינג10040CV
Scientific 96-Well ללא חצאית, פרופיל נמוךFisher ScientificAB-0700
SHARP טיפים למחסום דיוק, עבור P-200, 200 ומיקרו; l, 960 (10 מתלים של 96)סרט משלוח של תומאס סיינטיפיק1159M40
, רב תכליתי, 1.89 אינץ' x 109.4 יארד, שזוף, חבילה של 6 לחמניותאופיס דיפו220717
תפרEthiconJ385H
Tegaderm חבישה שקופה בסגנון מסגרת מקורי 2 3/8 אינץ' x 2 3/4 אינץ'Moore Medical1634
כרית מחוממת תרמו-עוףK& H ייצורשקופים 1000
Tygon - קיר 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 רגל)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9 של VHL, ואז מסומן באופן lentivirally עם EGFP מתויג דגל & גחלילית לוציפראז
VHL-WTמתויג Lentivirally עם חלבון פלואורסצנטי mStrawberry מתויג HA & גחלילית לוציפראז
מכשיר דיוק עולמי מלקחיים איריס 10 ס"מ CVD SERRפישר סיינטיפיק50-822-331
ערכת אוטוקליפס פצעיםBraintree scientific, inc.ACS KIT
Xylenes (היסטולוגי), פישר כימיקלפישר סיינטיפיקX3S-4
555899 הוכחה צינורות מעבדה נוקאאוט בתיווך

מקורות

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VHLCRISPR

מאמרים קשורים