הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כרונית, חריפה, ו-HIV ההפעלה מופעל מודלים העכבר חיסוני הומניזציה

10.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60315

⸱

3 בדצמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

במאמר זה

סיכום

המתואר כאן הם שלוש גישות ניסיוני ללמוד את הדינמיקה של זיהום HIV בעכברים הומניזציה. הראשון מתיר את המחקר של אירועי זיהום כרונית, בעוד שני האחרונים מאפשר לימוד של אירועים חריפים לאחר זיהום ראשוני או נגיפי ההפעלה מראש.

תקציר

בסיס הומניזציה/מזהה/IL-2 הקולטן γ עכבריםnull לאחר כמה תכונות של חסינות האדם, אשר ניתן לנצל במחקר בסיסי וטרום קליני על מחלות זיהומיות. מתוארים כאן הם שלושה מודלים של עכברים הומניזציה לקויה לחקר הדינמיקה של נגיף ה-HIV. הראשון מבוסס על הזרקה התוך הכבד של CD34+ תאי גזע המטפאות בעכברים היילוד, אשר מאפשר את החוקה של מספר התאים ורקמות הלימפה מוגבלים, ואחריו זיהום עם התייחסות מאמץ HIV. מודל זה מאפשר ניטור עד 36 שבועות לאחר ההדבקה ולכן נקרא מודל כרונית. המודלים השני והשלישי מכונים מודלים חריפה ומהירים, בהם תאי דם היקפיים הintraperitoneally מוזרק לעכברים מבוגרים. במודל החריף, תאים מתורם בריא מעפילו דרך התוואי התוך-הצפק, ולאחריו זיהום עם התייחסות למתח HIV. בסופו של דבר, במודל ההפעלה מההתחלה, תאים מתורם הנגוע באיידס תחת הטיפול האנטי-ויראלי מנחטרים באמצעות תוואי הצפק. במקרה זה, סביבה נטולת סמים בעכבר מאפשר ההפעלה מחודש וירוס ועלייה בעומס נגיפי. הפרוטוקולים המסופקים כאן לתאר את הגישה הניסיונית קונבנציונאלי עבור הומניזציה, מודלים העכבר החיסוני של נגיף ה-HIV.

מבוא

הומניזציה/SCID/אינטרלוקין (IL)-2 קולטן γ-שרשרתnull (להלן המכונה ההונים γ-שרשרתnull) מודל העכבר כבר בשימוש נרחב לחקר הפתוגנזה של זיהומים, חסינות אוטומטית, סרטן, כמו גם עבור מחקרים פרה-קליניים של תרופות, האדם תאים מבוססי טיפולים1,2. עכברים אלה מבוססים על רקע שאינו מהשמנת יתר (נוד), עם מוטציה scid ו מוטציה ממוקד ב-il-2 קולטן γ-שרשרת (γ שרשרת משותפת עבור il-2, il-4, il-7, il-9, il-15, ו-il-21), אשר לגרום ליקוי חמור בפיתוח העכבר T-, B-, ו הרוצח הטבעי (NK) תאים1 לפיכך, הם תומכים בתאום של רקמת האדם, CD34 האדם+ תאי גזע המטפאות (HSCs), ותאי דם היקפיים מונפקטיים (pbmcs)3,4,5. בנוסף, ביטוי הטרנסגניים של גורמים המטבטיים האנושיים, כגון מקדם של תאי גזע (scf), גרנולוציט/מקרופאג המושבה-גורם מגרה (GM-שדרתי), ו-IL-3 מקדם את העפיתו של אוכלוסיות מיאלואידית האדם6,7,8.

עבור לימודי HIV, מודלים מסוימים של ההונים γ-שרשרתnull תוארו, אשר שונים במתח העכבר, סוג של תאים אנושיים בשימוש, סוג של רקמות עבור חרט, ואת המקור של תאים (כלומר, בריא vs. תורם נגוע באיידס)9,10. הזן המקורי, עם זאת, משמש באופן נרחב בשל רמות גבוהות של תאים אנושיים בתיאום ונגיפי שכפול לאחר זיהום עם התייחסות מאמץ HIV11,12,13. חיסוני דומה לקוי של העכבר עם ביטוי טרנסגניים של גורמים המטטיים האנושיים (g., חעוגה-exl או nsg-SGM3) או עם שתלים של הכבד האנושי רקמות בלוטת התימוס (העצם במח-כבד בלוטת התימוס [בייקון] עכברים) שימושיים להערכת התפקיד של אוכלוסיות מיאלואידית בתגובה החיסונית אנטי-HIV, ההשפעות של HIV על רקמות אלה, ואת השתתפותם כמו מאגריםויראלי 14,15. יתר על כן, כמה זנים עם ביטוי טרנסגניים של אנטיגן לוקיציט אנושי (hla) מולקולות, כמו גם עכברים, ניתן להשתמש ללמוד את התגובה לתאי T לזיהום איידס16,17.

באופן כללי, בעכברים האלה, הומניזציה תלוי במקור התאי, בתוואי המשלוח (בתוך הצפק, בתוך הכבד, בתוך ורידי, בתוך הבית) ובגיל העכבר בזמן המועד המקביל18,19,20. לגבי מקור התא, האדם CD34+ hsc נגזר דם טבורי, הכבד עובר, או מגוייס דם היקפי ניתן להזריק היילוד או הצעיר עכברים3,21. בנוסף, בוגרים γ-שרשרת העכבריםnull יכול להיות הומניזציה על ידי הזרקת pbmc (כאן, הנקרא hu-pbmc-NS γ-שרשרת העכבריםnull ), המאפשר המחזור הזמני של תאים אלה בדם, איברי הלימפה המשני, ורקמות מודלק22,23,24.

המתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור הקמתה של ההוני γ-שרשרת מודלים העכברnull למחקר של זיהום HIV. הראשון הוא המודל הכרוני, שבו האדם CD34+ HSCs נגזר דם טבורי מתורם בריא מוזרק עכברים היילוד, ואחריו זיהום עם התייחסות למתח HIV לאחר 14 שבועות של המערכת החיסונית האנושית מחדש החוקה. מודל זה מאפשר ניטור של עכברים עד ~ 36 שבועות לאחר ההדבקה. המודל השני הוא מודל אקוטי, שבו PBMCs נגזר תורם בריא מוזרק ב-NS למבוגרים γ-שרשרתריק עכברים, ואחריו זיהום עם מאמץ התייחסות HIV לאחר 3 שבועות של התרחבות האדם T-cell בעכבר. לבסוף, המודל השלישי הוא מודל ההפעלה מההתחלה, שבו pbmcs נגזר של תורם מזוהם HIV תחת הטיפול המדכא תרופתי (אמנות) מוזרק למבוגרים NS γ-שרשרתריק עכברים. במקרה זה, סביבה נטולת סמים מאפשרת ההפעלה ויראלי ולהגדיל את העומס הנגיפי. שני הדגמים האחרונים מאפשרים ניטור עד ~ 9 שבועות לאחר החרט.

בסך הכל, אלה שלושה מודלים שימושיים למחקרים virological, טרום קליני מחקרים של תרופות הרומן, והערכה של השפעות הזיהום של HIV על התגובה החיסונית הגלובלית. חשוב גם לשקול כי שימוש בעכברים נגועים באיידס הומניזציה דורש סקירה ואישור על ידי ועדת Biosafety טיחות מוסדית (IBC) כמו גם על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) לפני כל ניסוי. הדבר מבטיח כי המחקר מלווה בכל התקנות המוסדיות הפנימיות והחיצוניות לשימוש בחומרים ביולוגיים מסוכנים ובטיפול הומאני בבעלי חיים ניסיוניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעבודה זו, כל טיפול בעלי חיים ונהלים בוצעו על פי פרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת מרילנד בית הספר לרפואה (פרוטוקול מספרים 1018017, 1018018, ו 0318009).

1. CD34 האנושי+ hsc של העכברים היילוד

  1. תמיד להשתמש בציוד אישי חד פעמי הגנה (PPE), כולל חלוקים סטרילי, כפפות, הנעליים ייעודי, מכסה נעליים, מסכה, משקפי שמש, מכסה שיער/זקן, ומעילים סטרילי מעבדה.
  2. השהה מחדש 1 x 106 של CD34 קפואים+ HSCs (ראה טבלת חומרים) ב-10 מ ל של RPMI 1640 מדיה 10% fbs תחת ארון מוסמך אבטחה טיחות ולשמור על תנאים סטריליים.
  3. השתמש 10 μL של ההשעיה לספור (כדי להבטיח את הנוכחות של מספר התאים הצפויים) ולבדוק את הכדאיות של התא על ידי טריקון כחול כתמים הכדורית בתוך הומוציטוטומטר.
  4. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). להיפטר supernatant ולהשעות מחדש קר 1x PBS לריכוז הנדרש (1.4 x 105 של CD34+ HSCs ב 50 μl). . השאר את התאים בקרח עד ההזרקה
  5. מקום גורים (NS γ-שרשרת כלבלביםnull של שני המינים מ 1 – 4 ימים) לתוך סטרילי 100 mm2 צלחת פטרי יחד עם כמות קטנה של חומר מצעים מהכלוב מגדל. בנוסף, שפשף מצעים נקיים בין הידיים כדי להסוות את כל הריחות הזרים על גורי המטופל.
    הערה: זה ממזער ריחות זרים להיות ספוג על הגורים, ובכך לשפר את הסיכויים של אמהות לקבל את הגורים שלהם בחזרה לכלובים לאחר ההליך.
  6. לשים את צלחת פטרי לתוך כלוב תחבורה נקייה למקם את הכלוב בכלוב העכבר נקי מיקרובודדים כדי להגן על הגורים מהסביבה. כסו את כלוב התחבורה עם משטח כיסוי כדי למנוע חשיפה של בעלי חיים לאור חיצוני תוך כדי המעבר לחדר ההקרנה.
  7. ההקרנה גורים עם 100 cGy הקרנה כולה הגוף (WBI) על ידי חשיפה למקור 137 Cs. נקו את הפנים של חוסר הרדיאטור עם תמיסה מחטא, מניחים עכברים בחוסר הסקה, ומדליק את הפטיפון כך שכל הגורים מוקרן לקרינה. סגור את הרדיאטור ולחץ על מתג ההפעלה כדי ליזום את תהליך ההקרנה. המתן עד שזמן ההקרנה יושלם ומיד להסיר את העכברים.
    הערה: כיוון שההקרנה אינה מפיקה מתח בעכברים, אין צורך בהרדמה קודמת.
  8. 2 – 4 h לאחר הליך ההקרנה, מניחים כלבלבים בארון ביוטיחות בתוך צלחת פטרי מקורר מכוסה בגזה סטרילית על הקרח, עד שהוא מורדם (~ 5 – 10 דקות). הרדמה מספקת מושגת כאשר תנועות ברוטו לחדול.
  9. טען את המזרק עם מחט מחוברת (29 גרם, 0.5 ") עם 50 μl של השעיית התא ו1.4 x 105 של CD34+ HSCs תחת ארון הבטיחות אבטחה טיחות.
  10. עבור החרט באמצעות הזרקת הכבד, לרסן את הגורים עם האגודל ואת האצבעות המדד. כדי למזער את האיפוק העכבר (~ 30-45 s), בואו חוקר אחד להחזיק את הגור ולנהל את הזריקה, ולקבל את החוקר השני לטעון את המזרק עם ההשעיה HSC. נקה את האתר הזרקה עם 70% אלכוהול ולספק 50 μL של תאים ישירות לתוך הכבד. השתמש בזווית מחט רדודה בעת הזרקת כדי למנוע פירסינג לחלוטין בכבד. כפקד, להזריק עכברים עם 50 μL של 1x PBS לתוך הכבד.
  11. הניחו את הגורים על צלחת פטרי מחומם מראש, מכוסה גזה סטרילית עבור 1 – 5 דקות כדי לאפשר התאוששות. לחמם את התבשיל באמצעות משטח התחממות אינפרא אדום עבור מכרסמים ב 20 ° c כדי להבטיח כי גורים לא יהיה מחומם יותר.
  12. מיד לפני שהחזירו את הגורים להוריהם, החילו כמות קטנה של משחה המבוססת על מנטול ואקליפטוס, תוך שימוש באגודל ובאצבעות המפתח, לחוטם של שני ההורים כדי להימנע מקניבליזם או מדחייה של הגורים.
  13. בדקו כלובים כל יום, מחפשים סימנים של מחלת שתל-מול-מארחים (GVHD) בגורים כגון עור יבש, אין האכלה, פריחה, התקרחות. המתת חסד החיות אם אחד מהסימנים האלה הם נצפו.
  14. לגמול עכברים בגיל 3 שבועות, לקבץ אותם על ידי מין. אין לשים יותר מ 5 בעלי חיים לכל כלוב. יש לבדוק בסדר היקפי הדם ההיקפי על ידי הזרמת cy, בגיל 14 שבועות.
    הערה: שיעור ההצלחה של העפיב הוא בין 80%-100%.

2. בתאום מראש של עכברים קטינים

  1. עבור מודלים חריפה ומשוב, להזריק 6 – 8 שבוע בן NS γ-שרשרת intraperitoneally עכברים עם האדם PBMCs נגזר תורם בריא או איידס חולה שהיה תחת אמנות, בהתאמה. בשני הדגמים, כוללים עכברים שהוחדרו עם PBMCs מתורם בריא ללא זיהום HIV (שאם) כפקדים.
  2. שכבה 15 מ ל של דם שלם ב 5 מ ל של דחיסות סטרילית מעבר צבע בינוני לתוך צינורית חרוט 50 mL.
  3. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 30 דקות ב RT, ללא בלמים, כדי למנוע מעיל באפי להיות מעורב עם צפיפות מעבר הצבע בינוני.
  4. בזהירות לאסוף את החלק של התאים המוננובית (בין בינוני מעבר הצפיפות ו supernatant) ולהעביר את המעיל באפי כדי שפופרת צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 10 מ ל של 1x PBS. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב RT.
  5. להיפטר supernatant ולהסיר את התאים הנותרים דם אדום על ידי lysing עם 5 מ ל של מאגר ACK שנוספו לתאי הפלטד. דגירה עבור 4 דקות ב RT.
  6. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב RT. למחוק את supernatant ולהשעות מחדש ב 10 מ ל של 1X PBS או RPMI 1640 בינוני.
  7. השתמש 10 μL של השעיית התא כדי לספור את התאים ולבדוק את הכדאיות על ידי כתמים כחול הדרה הכדורית בתוך הומוציטומטר. בדרך כלל, 1 – 2 x 106 תאים מתקבלים עבור כל 1 מ ל של דם, עם יותר מ 95% כדאיות.
  8. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב RT. להיפטר supernatant ולהתאים את מספר התא לריכוז הנדרש (במקרה זה, 3.5 x 106 תאים ב 200 μl של 1x PBS).
  9. טען את המזרק עם מחט מחוברת (28 G, 0.5 ") עם 3.5 x 106 של pbmcs ב 200 μl של PBS 1x תחת הקבינט אבטחה טיחות מוסמך.
  10. להסיר את העכבר מהכלוב ולהחזיק אותו בזנב כך שהוא יכול לאחוז את רשת השינוי, החלת המתיחה עדין לאחור. לאחר מכן, מניחים את האינדקס ואת אצבעות האגודל על כתפי החיה, תופסים את העור הרופף של הצוואר ומשתמשים באצבע האמצעית כדי לייצב את גבו.
  11. החלק את ראש העכבר לאחור כך שגבו הוא מעל הראש. זה מאפשר למעיים בחלל הבטן להיות מעקורים לאחור ומפחית את הסיכון של לכווץ את האיברים הפנימיים במהלך הזריקה.
  12. נקה את אתר ההזרקה עם 70% אלכוהול.
  13. לחדור את המזרק המשמש בשלב 2.9 דרך קיר הבטן ומתה לפני הזרקת התאים, אם חומר כלשהו הוא מנושף, להסיר את המזרק ולהשליך אותו. אחרת, הכנס את התאים לאט בחלל הפנימי של הצפק, הסר את המזרק והשמט אותו. הכנס את ה-PBS 1x כדי לשלוט בעכברים.
  14. . החזר את החיה לכלוב שלו
  15. יש לוודא כי הוא מוצב בתוך דם היקפי על ידי זרימה cy, במהלך 3 שבועות לאחר ההזרקה.

3. טיפול שלאחר התפילה

  1. זיהוי עכברים באמצעות תיוג אוזניים.
  2. צפו בעכברים המשמשים בניסויים אלה מקרוב 2x ליום לאחר כל הליך של סימנים קליניים של מצוקה.
  3. לאחר השתלת תאים אנושיים, הצג עכברים עבור GVHD. עבור ניטור הסימפטומים GVHD ב היילוד, נוער, ועכברים למבוגרים, להעריך בעלי חיים עבור המראה של מחלת עור (כלומר, צבע, יובש, פריחה, התקרחות), בנוסף משקל הגוף מדידה. הערכת בעלי חיים אשר מראים סימנים אלה על ידי וטרינר לשקול המתת חסד מוקדמת.

4. הליך הידבקות באיידס והליך זיהום מזויף

הערה: עבור מודלים כרוניים וחריפה, עכברים נגועים במאמץ התייחסות האיידס BaL בשבוע 14 ו שבוע 3 לאחר הפניה, בהתאמה. זריקות עם HIV מנוהל intraperitoneally לתוך הרביעים בבטן התחתונה.

  1. בצע את תהליך הטעינה של וירוס/PBS לתוך מזרקים, באמצעות 28 G 0.5 "מחט, בארונות BSL2 בעקבות ABSL2 פרוצדורות. הסכום הכולל של וירוס הזריק הוא 15,000 התרבות החציוני רקמת הרקמה הזיהומית (TCID50) ב 200 μl של סטרילי RPMI 1640.
  2. להסיר את העכבר מהכלוב ולהחזיק אותו בזנבו כך שהוא יכול לאחוז את רשת השינוי, החלת המתיחה עדין לאחור. לאחר מכן, הצב את האצבע המורה ואת האגודל על כתפי בעל החיים, תופס את העור הרופף של הצוואר ומשתמש באצבע האמצעית כדי לייצב את הגב.
  3. החלק את ראש העכבר לאחור כך שגבו מעל ראשו. הדבר מאפשר למעיים בחלל הבטן להיות עקורים לאחור ומפחית את הסיכון לאיברים פנימיים הניתנים לתקר במהלך ההזרקה.
  4. נקו את העכברים עם משטח אלכוהול מראש ברבע השמאלי התחתון/הימני של הבטן. הכנס 15,000 TCID50 של נגיף האיידס BaL הכלול 200 μl של 1640 RPMI.
  5. לאחר הזרקה, להחזיר את העכבר לכלוב הבית שלו.

5. איסוף דם על ידי ניקוב רטרוביטל

הערה: דימום רטרוקטולי מאפשר את האוסף המהיר של הדם, ובכך להקטין את הזמן איסוף הכולל והגדלת היציבות של סמנים לימפוציטים אנושיים. השתמש צינורות EDTA לאסוף דם עכברים.

  1. במודל כרונית, במהלך 14 שבועות post-HSC הזרקת, לאסוף את הדם באמצעות וריד retroorbital סלולית. במודלים החריפים וההפעלה מלכתחילה, בצע הליך זה ב-3 שבועות הזרקת לאחר PBMC.
  2. באמצעות 250 μL של שאיפת isof, לפני איסוף הדם במעמד של מכסה בטיחות ביולוגי B2, מתחת לפני השימוש בבעלי החיים החיצוניים.
  3. לחלק את האיזואופלוראן לתחבושות כותנה מתחת לרשת תיל בצנצנת מלאה של 1 L בארונית ביולוגית שפרקו מחוץ לבניין. השימוש ברשת השינוי מבטיח כי בעלי החיים לא יצרו קשר עם המשטח הספוג של isofלבנה, שיכול לגרום לגירוי בעור ולמינון מופרז פוטנציאלי מכיוון שהוא נספג גם דרך העור. כמו כן, שים מגבת נייר רכה בין הרשת לבין בעל החיים כדי למנוע פציעות גפיים.
  4. ברגע שהכד רווי באיזואולוראן (1 דקות לאחר הוספתו), הציגו את בעל החיים ושימו לב לקצב הנשימה, שיגדיל את הירידה. בדקו את האינדיקציה הקלינית למישור הרדמה עמוק, הכולל חוסר ברפלקס הצתה (על ידי צנצנת המפנה בעדינות) וחוסר בתנועות ברוטו. להתחיל את ההליך דימום ברגע שהחיה היא רגועה לחלוטין וחסר רפלקס הבוהן צביטה.
    הערה: מאז Isofלורה Ane מתאדה, לוותר על סמים יותר אם לא סימנים של הרדמה הם נצפו.
  5. עבור דימום מסלולית, לחץ על העכבר וריד הווריד החיצוני caudal אל הלסת התחתונה עם האגודל, ועם אותה יד, להעלות בעדינות את העפעף העליון עם האצבע המורה.
  6. הכנס צינורית המטוקריט לתוך הדרך המדירית של העין וישר אותו בכיוון ונטרופאני עד שהדם מתחיל לשוטף.
  7. לאסוף לפחות 100 μL של דם. לאחר שכמות הדם הרצויה מתקבלת (אמצעי אחסון לא יותר מ-1% ממשקל הגוף של בעל החיים), הפסק את לחץ הצוואר החיצוני והוצא את צינור המטוקריט.
  8. להבטיח כי ההקפאה הושלמה על ידי החלת הלחץ הישיר על העין באמצעות גזה סטרילי למינימום של 30 s.
  9. . מרח טטריין בעין לעקוב אחר בעל החיים עד שהוא התאושש לחלוטין מההרדמה ולמקם אותו בחזרה בכלוב.
    הערה: ה100 μL של דם שנאסף משמש להערכת רמת הCD45 של האדם+ ואוכלוסיות אחרות של תאי דם, כמו גם להערכת עומס פלזמה ויראלי.

6. הקרנת הניתוח של רמת התיאום והזרימה

  1. פעל בעקבות הזרימה המקובלת cy, מכתים פרוטוקול לדם שלם, הכולל את הדגירה של נוגדנים אנטי-אנושיים המסומנים ב-fluorochrome (עבור לוח זרימה מוצע, ראה טבלת חומרים), ואחריו הליזה של כדוריות דם אדומות ושטיפת שלבים13,15.
    הערה: עבור הקרנת הרמה של החרט, כוללים נוגדן CD45 אנטי-אנושי. עבור השוואה, נוגדן CD45 נגד העכבר עשוי לשמש גם. כלול שולטת פיצוי, כמו גם דגימת דם האדם מוכתם עם שילוב נוגדנים זהה, עכבר מוכתם ובדיקות דם אנושיים, ושליטה שאינה הומניזציה כדי לבדוק את החוצה מחדש פעילות של ריאגנטים. לאחר הצביעת, תמיד קיים אות רקע; עם זאת, כל האותות החיוביים נבדלים בבירור מפקדים שליליים ומגיבים בין תגובתית.
  2. ב cytometer זרם מתאים, לרכוש לפחות 10,000 אירועים על השער לימפוציטים (FSC-A לעומת מטוהאס-a). עבור הניתוח cy, לאחר הדרה משוכפל, לקבוע את אחוז התאים האנושיים CD45+ כמו גם אוכלוסיות תאים אחרות של עניין.

7. הערכת עומס פלזמה ויראלי

  1. הערכת העומס ויראלי ב-HIV נגוע בחיות 1x לשבוע לאחר ההדבקה.
  2. לאחר דימום מסלולית (כ 100 μL), להשיג פלזמה על ידי איסוף supernatant לאחר צנטריפוגה של דם anticoagulated ב 3,500 x g עבור 3 דקות ב מיקרוצנטריפוגה. . הגלולה משמשת לפנוטיפים של תא דם
  3. השתמש מסחרי נגיפי RNA ערכת החילוץ (ראה טבלת חומרים) כדי לקבל RNA מ 40 μl של פלזמה.
  4. המרת RNA לתוך cDNA באמצעות לערבב את הזנים הראשון סינתזה (ראה טבלת חומרים) ו-HIV מחסום SK431.
  5. לבצע PCR כמותי בזמן אמת באמצעות מחסום HIV התחל SK38/SK39 ו צבע ירוק פלורסנט (g., sybr גרין) כפי שמתואר במחקרים קודמים13,25.

8. ניהול הטיפול האנטי-ויראלי

  1. ניהול אמנות בעל פה לפחות 3 שבועות לאחר ההדבקה, כאשר עומס נגיפי גבוה הוא נצפתה, במודלים כרונית, חריפה, וההפעלה מחוזרת.
  2. לחשב את מינונים של disoproxil הפירוק fumarate (TDF), emtricitabine (FTC), ו raltegravir (RAL), על פי הערכים ק מ 37 ו 3 עבור בני אדם ועכברים, בהתאמה26. בדרך כלל, המינון המקבילה האנושית של TDF, FTC, ו-RAL הם 61.7 מ"ג/ק"ג/יום, 40.7 mg/ק"ג/יום, ו 164 מ"ג/ק"ג/יום, בהתאמה.
  3. עבור המינהל במים לשתייה, מועך טבליות סמים ולהוסיף את הסכום המתאים בבקבוק המים, להבטיח כי כל עכבר בכלוב רוכש המינון היומי שלו. מאז אבקת התרופות עשוי ליצור משקעים בבקבוק, מדי פעם לנער את בקבוק המים כדי להשיג השעיה הומוגנית.
  4. להחליף את בקבוק המים כל שבוע. עם סמים טריים מומס
  5. לאסוף את הדם באמצעות וריד retroorbital סלולית מדי שבוע או כל 2 שבועות לאחר חניכה האמנות להעריך את השינויים בעומס ויראלי CD4: CD8 יחס.

9. עכבר המתת החסד, אוסף של איברי הלימפה משנית, ובידוד של תאים מונוליניים

  1. המתת חסד מבוצעת בשלושת דגמי העכבר ההומניגניים, מעת לעת לאורך זמן ההדבקה, או בסוף הניסוי.
  2. לבצע את המתת החסד של עכברים למבוגרים על ידי שיתוף2 חנק, ואחריו נקע בצוואר הרחם. עבור חנק, להשתמש בחדר שאינו טעונה מראש, לוותר CO2 מ צילינדר מסחרי עם וסת הלחץ קבוע בשורה גביל שליטה על זרימת הגז בתוך 20%-30% של הנפח בחדר/דקה כדי לקיים עם 2013 avma הנחיות.
  3. לשמור על הזרימה CO2 עבור מעצר הנשימה של > 60 s (אשר עשוי להימשך עד 5 דקות), ואחריו נקע צוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד.
  4. המתת חסד neonates < 7 ימים על ידי שיטה פיזית (כלומר, באמצעות מספריים חדים).
  5. לדמיין את השחי, mediastinal, ואת בלוטות הלימפה מצע (אשר בדרך כלל נצפו) ולחלץ אותם עם מספריים ומספרים חדים. כמו כן לחלץ את הטחול, ממוקם בצד השמאלי העליון של חלל הצפק.
  6. הפקדה את רקמות הלימפה 1.5 mL צנטריפוגה צינורות המכילים סטרילי RPMI 1640 בינונית.
  7. מיד לעבד את רקמות הלימפה ב 70 מ"מ בגודל הנקבוביות תא ניילון מסננת, איסוף התאים בצינור 50 mL. . אל תירק את הרקמות
  8. לשטוף את התאים עם 5 מ ל של RPMI 1640 בינונית בתוספת עם 1% FBS כדי להקל על סינון תאים.
  9. לאחר הפירוק רקמות, צנטריפוגה את התאים ההשעיה ב 3,500 x g עבור 10 דקות ב מיקרוצנטריפוגה.
  10. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים עם 500 μL של 1x PBS.
  11. העברת תאים ההשעיה לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL המכילה 500 μL של בינונית צפיפות מעבר סטרילי.
  12. צנטריפוגה ב 3,500 x g עבור 3 דקות ב מיקרוצנטריפוגה, ללא בלם, כדי למנוע את המעיל באפי מערבוב עם צפיפות בינונית מעבר הצבע
  13. בזהירות לאסוף את החלק של תאים mon, ברור (בין בינוני מעבר הצפיפות ו supernatant) ולהעביר את מעיל באפי לצינור צנטריפוגה 1.5 mL המכיל 500 μL של 1x PBS. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 3 דקות.
  14. הסר את הנותרים כדוריות הדם האדומות על ידי lysing עם 500 μL של מאגר ACK, הדגירה עבור 4 דקות ב RT.
  15. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 3 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש ב-1 מ ל של 1X PBS או בינוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שמתואר לעיל, במהלך 14 שבועות post-HSC הזרקת (מודל כרוני) או במהלך 3 שבועות לאחר PBMC הזרקה (מודלים חריפה וההפעלה מראש), העכברים הם דימם להקרנה את רמת התאים האנושיים הסדר ידי הזרימה cy, try. נציג האסטרטגיה להערכת 1) האדם CD45+ תאים החוקה ו 2) אחוז של CD4+ ו CD8+ T-תאים מוצג באיור 1א. בדרך כלל, רמת החרט (אחוז של האדם CD45+ תאים) נע בין 10% – 80% לאחר CD34+ hsc הזרקה והוא תלוי בתוואי של הזרקה ומתח העכבר, בין הגורמים האח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התפתחויות חשובות הושגו בפיתוח של זנים של העכבר החיסוני להאנשה, עם מספר אפשרויות שונות שניתן להשתמש על פי עניין המחקר1. בתנאי כאן הוא פרוטוקול כללי עבור הומניזציה של NS γ-שרשרת העכבריםnull זנים דומים גנטית להיות מועסק בשלושה מודלים שונים עבור לימוד זיהום HIV. בגישה הניסיונית הראשונה, העכברים היילוד לקרינה מוזרק עם האדם CD34+ HSCs, אשר יכול להיות נגזר דם טבורי, הכבד עוברית, או מגוייס דם היקפי3,21. הקרנה מתאימה של γ NS-ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי החטיבה הקלינית IHV קרנות פנימיות כדי JCZ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0. 5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהנפטון3735.S.X
1. 5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהנפטון3745.S.X
10 מ"ל פיפטות סרולוגיותsceintific כוכביVL-4090-0010
15 מ"ל צינורות חרוטייםStellar scientificT15-600
25 מ"ל פיפטות סרולוגיותsceintific כוכביVL-4090-0025
5 מ"ל פיפטות סרולוגיותכוכביותVL-4090-0005
50 מ"ל צינורות חרוטייםStellar scientificT50-600
ACK מאגר ליזהאיכותי ביולוגי118-156-101
רפידות הכנה לאלכוהולפישר מדעי06-669-62
שיבוט CD3 סטרילי אנטי אנושי UCHT1Biolegend300439APC מצומד
אנטי-אנושי CD4 שיבוט OKT4Biolegend317420AF488 מצומד
אנטי-אנושי CD45 שיבוט 2D1Biolegendמצומד
אנטי-אנושי CD8 שיבוט SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5
מצומד Biosafaty ארון רמה 2אם אפשרי מחובר ל-exauste chimeny בעת טיפול באיזופלורן
מצנפתפישר מדעית17-100-900כובע לשימוש חד פעמי להגנה בסיסית
CavicideMetrex13-1000תאי
CD34+Lonza2C-101כמה שיותר בקבוקונים זמינים מתורם יחיד
צנטריפוגהבקמן65-6KR
צנצנת שקופהאמזון77977
כריתגזה כותנהפישר מדעי22-415-468
מעילי מעבדה חד פעמיים סטרילייםפישר מדעי19-472-422
צינורות מיקרו EDTAגריינר ביו-וואן450480
מסכת פניםפישר מדעי17-100-897
תמיסת ליזינגFACS BD340202
FBS פרימיום HIאטלנטה ביולוגיתS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
ציטומטרהשתמשנו
בצינורות ציטומטריה זרימהFalcon3520545 מ"ל פוליסטירן ותחתית עגולה
HIV BaLהוכן במתקן הליבה שלנו uQUANT
PBMCsמתנדבים חיוביים ושליליים
אינפרא אדום כרית חימוםVenet ScientificDCT-25כרית חימום טיפולית זמנית לבעלי חיים קטנים
Isentress (Raltegravir)MerckNSC 0006-0227061תרופה אנטי-רטרו-ויראלית לטיפול בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-מעכב אינטגראז
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I irradiatorציוד השייך לאוניברסיטה של מרילנד
מיקרו פיפטות
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף
עכבר תגי אוזניים להקהלאומית & Tag company1005-1L1
צינורות איסוף דם של Natelsonפישר מדעי02-668-10
NOG-EXLTaconicHSCFTL-13395-F
עכברי NSGג'קסון5557נקבות בהריון בזמן לחריטת CD34 וצעירים לחריטת PBMCs
NSG-SGM3ג'קסון13062
פרפורמלדהיד 16%מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710
PBS 1X pH 7.4Gibco100-10-023
צלחות פטריפישר מדעי08-757-28
מכונת Quantistudio qPCRריאגנטים תרמוQS3
Costar4870
RPMI מדיה 1640 1XGibco11875-093
נעל מכסהפישר מדעי17-100-911
כפפות חד פעמיות סטריליותMicroflexSUF-524
SuperScript II סינתזת גדיל ראשון SuperMixInvitrogen10080-400מזרקי סינתזת cDNA
28-G x 1/2BD329-461
מזרקים 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine ו TenofovirGileadNDC 61958-0701-1תרופה אנטי-רטרו-ויראלית לטיפול בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-מעכב אנלוגי-טרנסקריפטאז
טריפאן כחולסיגמאT8154ספירת תאים וכדאיות
Vick Vaporubבריאות בית הספר43214משחה על בסיס מנטול ואקליפטוס
ביולוגיה מולקולרית מים כיתהאיכות ביולוגית351-029-131
368522-BV421 חומר זיהומי משטח זרימה של FACS Aria II אנושיים HIV מאגרי

מקורות

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118(2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280(2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HIVHIVHIVHIVCD34
כרונית, חריפה, ו-HIV ההפעלה מופעל מודלים העכבר חיסוני הומניזציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.