מאמר שיטה

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

DOI:

10.3791/60323

⸱

31 באוקטובר 2019

 ,  ,  , 
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציה של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס עם פני השטח של תאים אנדותל מתווך בזרימת הדם באמצעות חלבונים מכניביים מרכיב כגון מקדם וויללמותג פון (vwf). גליקופרוטאין זה משנה את המבנה המולקולרי שלה בתגובה למתח ההטיה, ובכך חושף אתרי כריכה לקשת רחבה של מארחים ואינטראקציות. באופן כללי, הקפדה על תאי האנדותל הראשוניים תחת זרימת הטיה מוגדרת לקדם את הבידול התאי המסוים ואת היווצרות של שכבת אנדותל יציבה ומקושרת היטב הדומה לפיזיולוגיה של הציפוי הפנימי של כלי הדם . לפיכך, ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פתוגנים חיידקיים לבין הפונדקאי המארח מעורבים חלבונים מכנימים רגישים דורש הקמת מערכות משאבה שיכולות לדמות את כוחות הזרימה הפיסיולוגיים הידועים להשפיע על פני השטח של תאי כלי הדם.

המכשיר המיקרו-פלואידיג המשמש במחקר זה מאפשר הפעלה מתמשכת ורציפה של נוזלים עם קצב זרימה מוגדר. מערכת משאבת לחץ האוויר מבוקרת המחשב מחיל לחץ הטיה מוגדר על משטחי תא אנדותל על ידי יצירת זרימה רציפה, חד כיווני, בינונית ומבוקרת. שינויים מורפולוגיים של התאים והקבצים המצורפים החיידקיים יכולים להיות מנוטרים באופן מיקרוסקופי ולכמת בזרימה באמצעות שקופיות ערוץ מיוחדות המיועדות להדמיה מיקרוסקופית. בניגוד לזיהום התרבות התא סטטי, אשר באופן כללי דורש קיבעון לדוגמה לפני תיוג החיסונית ניתוחים מיקרוסקופיים, שקופיות microflu, מאפשר הן איתור מבוססי-פלואורסצנטית של חלבונים, חיידקים, ורכיבים סלולריים לאחר קיבעון דגימה; כתמים מוחיסורתיים; וגילוי מבוסס-פלואורסצנטית ישיר בזמן אמת. בשילוב עם חיידקים פלורסנט ונוגדנים ספציפיים המסומנים בקרינה פלואורסצנטית, זה הליך זיהום מספק מערכת יעילה מרובת רכיבים מרובים עבור ספקטרום עצום של יישומים מדעיים הקשורים תהליכים כלי דם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפתוגנזה של זיהומים פנאומטי מאופיין באינטראקציה רבת-פנים עם מגוון של תרכובות מטריצות ורכיבים של המטאוסטזיס האנושי, כגון פלמיננוגן ו vwf1,2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה רב התחומים גליקופרוטאין VWF משמש כרגולטור מפתח של הומוסטאזיס מאוזנת על ידי גיוס thrombocyte מדיה ו התאגדות פיאין באתר של היווצרות כלי דם הטרובוס9. החשיבות של הפונקציונלי, VWF פעיל עבור שליטה דימום וריפוי הפצע הוא הפגינו על ידי המחלה של פון Willebrand, הפרעת דימום משותף הפרעה10.

כדורי vwf מסחררת במערכת הדם האנושי בריכוז של עד 14.0 μg/mL11,10. בתגובה לפציעה וסקולרית, שחרורו המקומי של vwf על ידי הגופים האלה של weibel palade (wbp) גדל במידה ניכרת11,12. מחקרים קודמים מראים כי הדבקות האנטי-קוקוס לתאי האנדותל של האדם והייצור של הנקבוביות היוצרות משאבה משמעותית מעוררת באופן משמעותי את הפרשת הלומיאל (VWF)13. הכוחות ההידרודינמיים של זרימת הדם גורמים לפתיחת מבנה של תחומים VWF מכנימים. בקצב זרימה של 10 דינמיקה/ס"מ2 vwf multimerizes למחרוזות חלבון ארוך של עד כמה מיקרומטר באורך הנותרים מחוברים subאנדותל10,12.

כדי להבין את הפונקציה של מחרוזות VWF מולטימzed שנוצר תחת לחץ הטיה באינטראקציה של אבקת הקוקוס עם משטח אנדותל, מבוססי microfluidic מבוסס תרבות התא הגישה זיהום הוקמה. התקן מיקרופלואידיג עם מערכת משאבת הלחץ על התוכנה בקרת האוויר שימש. פעולה זו איפשרה הפעלת מבנה חד-כיווני ורציף של מדיום תרבות התא עם קצב זרימה מוגדר. ובכך, המערכת החלה להדגיש הטיה מוגדרת על פני השטח של תאים אנדותל, אשר נשאר מחובר בתוך שקופיות הערוץ המקצועית. גישה זו אפשרה את הסימולציה של כוח ההטיה בתוך זרם הדם של מערכת כלי הדם של האדם, שבו מחרוזות VWF מופקים על תאים אנדותל מובחנים בתנאי זרימה קבועים מוגדרים. לצורך זה, תאי האנדותל מעובדים בשקופיות מסוימות של ערוצים (ראו טבלת חומרים), שהותאמה לניתוחים מיקרוסקופיים במהלך הזרימה. מערכת המשאבה microflu, מספק את המצב מאוד מוגדר ומבוקר לחץ להטות הנדרש עבור היווצרות של מחרוזות VWF המורחבת על שכבת התאים שוטפת של הרשת. לאחר הגירוי של VWF-הפרשה של האדם בוגר הטבור וריד בתאי הטבורי (HUVEC) על ידי תוספי היסטמין, היווצרות מחרוזת המושרה על ידי החלת מתח הטיה (ԏ) של 10 דינמיקה/cm2. לחץ ההטיה מוגדר ככוח הפועל על שכבת התא. הוא מחושב בקירוב על פי הקורנית. אל14 עם משוואה 1:
figure-introduction-1

כאשר ԏ = להטות את המתח בדינמיקה/cm2, η = צמיגות ב (דינמיקה ∙ s)/cm2, h = מחצית גובה הערוץ, w = חצי רוחב הערוץ, ו Φ = שיעור flowrate-mL/min.

התוצאה של משוואה 1 תלויה בגבהים וברוחב השונים של השקופיות השונות המשמשות (ראה טבלת חומרים). במחקר זה שקופית ערוץ luer של 0.4 יקרומטר והתוצאה היא גורם שקופית קאמרית של 131.6 שימש (ראה נוסחה 2).
figure-introduction-2

צמיגות של המדיום ב 37 ° c הוא 0.0072 דינמיקה ∙ s/cm ² ו להטות את הלחץ של 10 דינמיקה/cm ² שימש. זה הביא לקצב הזרימה של 10.5 mL/min (ראה פורמולה 3).
figure-introduction-3

כאן, הסתגלות וקידום של הליך מיקרופלואידיג תא culturing באמצעות מערכת זרימה חד-כיוונית למינארי עבור החקירה ויזואליזציה של מנגנוני זיהום חיידקי בתוך המארח המארחים מתואר בפירוט. הדור של מחרוזות VWF על שכבות אנדותל יכול להיות גם מגורה באמצעות מערכות משאבה אחרות, כי הם מסוגלים להחיל לחץ מתמשך ויציב להטות15.

לאחר הטיפוח של תאי האנדותל הראשוניים למפגש בזרימה וגירוי של היווצרות מחרוזות VWF, הבעת הופעת חלבון פלואורסצנט אדום (RFP)16 נוספו לשכבת התא האנדותל תחת שליטה מיקרוסקופית מתמדת. ההחזקה של חיידקים כדי vwf מחרוזות על פני השטח של תאים אנדותל היה מאכל דמיין והפיקוח עד שלוש שעות בזמן אמת על ידי שימוש ב-vwf ספציפי נוגדנים מתויג-פלורסנט. עם גישה זו, התפקיד של VWF כמו קופקטור הדבקה לקידום ההחזקה החיידקית של כלי הדם אנדותל היה נחוש8.

בנוסף להדמיה המיקרוסקופית של הפרשת החלבון והשינויים השונים, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לפקח על צעדים בודדים של תהליכי זיהום חיידקי בזמן אמת, כדי לכמת את כמות החיידקים המצורפים בנקודות זמן שונות של זיהום. מערכת ספציפית מבוקרת תוכנה מספקת גם את האפשרות לתרבות התאים האנדותל בתנאי זרימה קבועה מוגדר למשך עד מספר ימים ומאפשר הדגירה פעמו זרימה בינונית. כמו-כן, ניתן להחיל שיטה זו באמצעות סוגי תאים שונים. התאמת פרוטוקול הצביעת גם מאפשרת איתור והדמיה של חיידקים הפנימו לתוך תאים איקריוטית.

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הניסיוני המתקדם שניתן להשתמש בו כגישה מוגדרת, אמינה וניתנת ליישום לאפיון יעיל ותכליתי של תהליכים פתופסלוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפוח-תרגול של התאים המיקרופלואידיג התבצע עם תאי הטבור העיקריים של העורק האנושי הראשי (HUVEC). החברה מבודדת את התאים עם הסכמה מושכלת של התורם. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הלשכה הרופאים של המדינה הפדרלית באדן-Wuerttemberg עם מספר הסימוכין 219-04.

הערה: ראה טבלת חומרים לאספקת פרוטוקולים.

1. טיפוח-תרגול של תאי האנדותל הראשוניים

  1. הפשרת בקבוקון גליצרול קפוא המכיל 1 x 105 HUVEC הראשי מתוך שלושה תורמים שונים בעדינות ב 37 ° צ' ו הזרע את התאים 7 מ ל של הצמיחה של תא אנדותל בינונית (ecgm, מוכן לשימוש עם תוספי) ב 25 ס מ2 תא בקבוקון.
    הערה: התאים האנדותל העיקריים מאבדים את יכולת הבידול לאחר יותר מ -5 מחזורי הפצה. לכן, רק תאים עם פחות מ 5 מעברים ניתן להשתמש אם ציונים גבוהים של בידול התא נדרשים.
  2. לטפח את התאים ב 37 ° c ב 5% CO2 אווירה עבור 60 דקות כדי לאפשר מצורף משטח ולהחליף את המדיום תרבות תא ecgm כדי להיפטר שאריות מהקפאה.
  3. המשך לשלב את התאים בשעה 37 ° cבאווירה של 5% שכונתיות עד שהם יוצרים שכבת תא תת-שוטפת.
    הערה: ה-HUVEC אינו צריך לצמוח לשכבה שוטפת מאז שאנשי הקשר הצמודים לתאי התא מונעים היווצרות שכבת תא יציבה בהמשך הזרימה.

2. טיפוח-תרגול של סטרפטוקוקוס

אזהרה: דלקת ריאות סטרפטוקוקוס היא ברמת בטיחות 2 סוכן והוא מותר רק להיות תרבותי ב אבטחה טיחות רמת 2 מעבדות. השתמש ספסל נקי מסווג עבור רמת בטיחות 2 עבור כל הטיפולים חיידקי, להימנע בקפדנות היווצרות תרסיס, ולהשתמש צנטריפוגה עם הגנה תרסיס לשקעי חיידקים.

  1. אינוחסן דם קולומביה צלחת אגר עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס בידוד ATCC11733 נגזר מתוך מניות גליצרול מאוחסן כל הזמן ב-80 ° c ולטפח את הצלחת אגר לילה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. הכינו 40 מ ל של מרק נוזלי של טוד יואיט בתוספת תמצית שמרים 1% (שלך) ו 15 מ ל של מלוחים סטרילי באגירה פוספט (PBS) pH 7.4, לטיפוח בקטריאלי ושטיפת שלבים.
  3. השתמשו בצינור סטרילי לטיפוח חיידקי ומשתמשים בציר התרבות הנוזלי עם מסה חיידקית. שלוט על כמות החיסונים במדידה של 1 מ ל ב600 ננומטר נגד מרק נוזלי שאינו מחוסן כהפניה. מילוי מסה חיידקית לתוך המרק הנוזלי עד שהוא מגיע לדחיסות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) של 0.15.
  4. משחיז את המרק הנוזלי מחוסן מבלי לרעוד ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ולקבוע את OD600 כל 30 דקות על ידי מדידת 1 mL הalits באמצעות כימיקלים פלסטיק.
  5. ברגע התרבות החיידקית הגיע OD600 של 0.4, אשר מתאים לשלב הגידול האקספוננציאלי, צנטריפוגה את השעיית התרבות החיידקית עבור 10 דקות ב 1,000 x g בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: אל תאפשר התרבות הפנאומטי כדי להגיע OD600 של יותר מ 1.0, כי צפיפות התרבות הגבוהה והפנאומטי הגבוה ידוע להפעיל את הקישור החיידקי בקטריאלי, אשר עשוי להשפיע על הכושר הכולל חיידקי.
  6. להשעות משקע חיידקי בעדינות עם 10 מ"ל PBS ו משקע שוב עבור 10 דקות ב 1,000 x g ב RT.
  7. מחדש את המשקעים בקטריאלי שטף בעדינות ב 1 מ ל PBS ולקבוע את OD600 של 10 μl של ההשעיה חיידקי באמצעות 1 ML של PBS כהפניה.
  8. להתאים את כמות החיידקים ב-PBS ל-OD600 של 2.0. לדברי לשעבר ספירת חיידקים נקבע, OD600 של 2.0 מתאים 2 x 109 המושבה היוצרים יחידות (cfu). מיד להמשיך עם ההליך זיהום כדי למנוע אוטומטית בקטריאלי.

3. טיפוח תאי האנדותל של HUVEC בתנאים מיקרו-פלואידידים

  1. נתק את תאי האנדותל העיקריים מהבקבוקון של תרבות התא על ידי פרוטפוליזיס נשלט. בצע את השלבים הבאים בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. הכינו נפח של 15 מ ל של PBS סטרילי עבור שלבי הכביסה.
    1. הסר את ה-ECGM משכבת-HUVEC הגדלה באופן שוטף ושטוף את שכבת התאים עם 10 מ ל PBS באמצעות פיפטה סרוולוגית כדי להיפטר ממדיום תרבות התא.
    2. המלון משלב את שטיפת HUVEC עם 3 מ ל של 37 מעלות צלזיוס של פתרון הדיסוציאציה לניתוק תאים עבור 5 דקות ב 37 ° c. שימו לב לניתוק התא של הפרוטחרדה על ידי ניטור מיקרוסקופי בכל דקה.
    3. פיפטה תא מנותק הבולם לתוך צינור המכיל 7 מ ל של ECGM בתוספת 2% סרום עגל עוברי (FCS) עבור עצירת הפרוטפוליזיס משקע את התאים עבור 3 דקות ב 220 x g ב RT.
    4. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את HUVEC ב 250 μL של ECGM שיושלם עם 5% FCS ו 1 מ"מ MgSO4. השתמש 10 μL של השעיית התא עבור ספירת תאים באמצעות תא Neubauer אואר לספור ולהתאים את ספירת התא כדי 4 x 106 תאים/ML ecgm בתוספת 5% fcs ו 1 מ"מ MgSO4.
      הערה: עבור כל ניסוי זרימה 30 מ ל של ECGM בינונית שיושלם עם 5% FCS עם 1 mM MgSO4 יידרש. מכאן על הרכב בינוני זה נקרא ECGMS-בינונית. הגידול של ריכוז FCS במדיום התרבות מ 2% כדי 5% תומך תא מצורף והכדאיות התא של HUVEC שופרה בשקופית הערוץ. תוספי מדיום FCS ו MgSO4 לייצב באופן משמעותי את התא המצורף של HUVEC תחת תנאי לחץ הטיה.
  2. הזרע ולטפח את HUVEC בשקופית הערוץ. לעבוד בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. התאים יהיו מעובדים תחת לחץ הטיה עבור 2 ימים ואחריו זיהום עם חיידקים ניטור מיקרוסקופיים עבור אחר 2 h.
    1. שקופית ערוץ, מערכת זלוף 1.6 מ"מ קוטר ו 50 ס"מ אורך, סדרת מחלקים של ecgms-medium, ו luer ערוץ שקופית 0.4 יקרומטר בגובה, עבור 24 h בחממה עם 5% CO2 אווירה ב 37 ° צ' כדי להקטין את מספר בועות האוויר.
      הערה: הליך זה מומלץ לדגה את הציוד הפלסטי ולחמם את המדיום, את צינורות ההיתוך ואת המאגרים. אם החומרים או הנוזלים אוחסנו ב-RT או במקרר, הגזים המומסים בפלסטיק ובנוזלים ישוחררו כאשר הם ייתחממו בחממה במהלך הניסוי. בועות הגז יופיעו לאחר מכן. מנטרל את כל רכיבי הפלסטיק לפני הניסוי יבטל את האפקט הזה. בכל פעם שהמערכת נלקחת מהאינקובטור, תהליך קליטת הגז מתחיל שוב. לכן, לעבוד במהירות ב-RT ולעולם לא להשאיר את יחידת פלואידים מחוץ לחממה לפרקי זמן ארוכים יותר.
    2. השתמש בפיפטה כדי להזריק 100 μL של 2% בתמיסה סטרילית מסוננת של הג בפתרון PBS לתוך אחד המאגרים של שקופית ערוץ טמפרטורה. מודיית את הג-פתרון עבור 1 h ב 37 ° צ' ולשטוף את הערוץ של השקופית עם 1 mL PBS בתנאים סטרילי באמצעות 1 mL מזרק Luer.
    3. הצב את שקופית הערוץ המצופה בג בקלקר דק או בצלחת קלקר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת השקופית. הוסף 100 μL של 4 x 106/Mlההשעיה HUVEC עם מזרק 1 ML luer לתוך השקופית.
      הערה: הצבת שקופית הערוץ על משטח המתכת הקר של הספסל הנקי עלולה להקטין את הטמפרטורה של תחתית השקופית, ובכך ליצור לחץ קר לתאי האנדותל. במהלך ליטוף התא ללטף את השקופית קצת למעלה כדי לתת בועות אוויר לעלות ולהיעלם מתוך השקופית.
    4. דגירה שקופית הערוץ עם HUVEC עבור 60 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ולמלא את המאגרים בינוניים בשני הקצוות של שקופית הערוץ עם 60 ΜL ecgms-בינוני כל. מודטה עבור 1 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  3. כוונן את המשאבה המיקרופלואידיג ואת הגדרות התוכנה.
    1. חבר את הפרפיוז הבינוני שנקבע ליחידת המשאבה, מילוי עם 13.6 mL של ECGMS-medium, והפעל את תוכנת בקרת המשאבה. בחר את ערכת המיזוג הנאותה ואת סוג השקופית הקאמרית באמצעות הגלילה למטה החלונות בתפריט של יחידת פלואידים להגדיר. בחר 0.007 (דינמיקה ∙ s/cm2) בתוכנה עבור צמיגות בינונית. (עיין בהגדרות התוכנה של משאבת הלחץ המסומנות בחיצים אדומים באיור המשלים 1).
    2. מחוץ לחממה, לחבר בקבוק זכוכית מלא עם מחרוזת סיליקה לייבש צינורות לחץ אוויר (להתייחס לאיור 1, שיבוץ 3). האוויר של משאבת הלחץ מסתובב בין המאגרים זלוף ואת המשאבה צריך להיות יבש לפני הכניסה מחדש למכשיר המשאבה. בחר פרמטרי זרימה בתפריט תוכנה, להגדיר את הלחץ 40 mbar, ולשטוף את צינורות המשאבה עם המדיום הנוזלי על ידי הפעלת זרימה בינונית רציפה. (הגדרות אלה מסומנות גם על ידי חיצים אדומים באיור המשלים 1).
    3. התוכנית הרצויה להטות את הלחץ מחזורים של טיפוח הזרימה. התחל עם 5 דינמיקה/cm2, בקרת מאגר מאוזנת דלעת ולהבטיח כי אין בועות אוויר במחזור במערכת המשאבה.
      הערה: הקיר להטות את המתח בשקופית הערוץ תלוי בקצב הזרימה ואת צמיגות של המדיום זלוף. אם השימוש במערכת משאבה אחרת, עיין במשוואות המתוארות במבוא לקביעת קצב זרימה היוצר את רמת הסטרס הרצויה של ההטיה. ההגדרות המתוארות מתאימות לקצב הזרימה של 5.42 mL/min. (צילום מסך למופת המציג את הגדרות הפרמטרים של הזרימה הנאותה בתוכנת משאבת הלחץ מופיעה באיור המשלים 2).
    4. להפסיק את זרימת הזרימה בתוכנת בקרת המשאבה ולהחזיק את הזרימה הבינונית בצינורות זלוף על ידי לולאה את הצינורות ליד חיבורי luer. חבר את שקופית הערוץ, ובכך למנוע בועות אוויר, ולמקם את יחידת flu, עם שקופית הערוץ המחובר ב-CO2 חממה ב 37 ° c ו 5% CO2. הפעל את לחץ ההטיה ב-5 דינמיקה/cm2 עבור 30 דקות כדי להתאים בצורה חלקה את התאים לכוחות שנוצרו על-ידי לחץ ההטיה לפני האצת רמת הלחץ ההטיה (ראה איור 3).
      הערה: לדאוג כי לא יישארו בועות אוויר במערכת הצינורית או בשקופית לאחר התחברות למערכת הצינורית, מכיוון שהתנועה של בועות אוויר בזרם עלולה להוביל לניתוק תאים.
    5. להאיץ את המתח להטות ל 10 דינמיקה/cm2 (אשר מתאים 10.86 mL/min בהגדרה זו של זרימה) ו מודקת שקופית הערוץ במתח הטיה רציפה עבור 48 h ב חממה קטנה CO2 ב 37 ° צ' ו 5% co2 כדי לאפשר בידול התא ( settinngs תוכנה בהתאמה מצוינים עם חיצים אדומים באיור המשלים 4).
      הערה: תאים HUVEC נוטים להתנתק ממשטח הערוץ אם טיפוח הזרימה החלה ישירות ב 10 דינמיקה/cm2. התאים נשארים מחוברים למשטח החדר אם טיפוח הזרימה מתחיל עם פחות מתח הטיה באמצעות 5 דינמיקה/cm2 עבור מינימום של 30 דקות ואחריו על ידי הגדלת הלחץ הטיה לאט עד הרצוי 10 דינמיקה/cm2. מתח הטיה של 10 דינמיקה/cm2 הוא הערך המינימלי בהגדרת הפרזיה הנדרשת עבור היווצרות מחרוזת vwf.
    6. לאחר 24 שעות של טיפוח תא microflu, לעצור את הזרימה בינונית עם תוכנת בקרת המשאבה בדיוק כאשר רמת בינונית מאוזנת מתמלאת בשני מאגרים בינוניים. הניחו את יחידת הפלואידיג בספסל נקי והסירו 10 מ ל של מדיום הטיפוח-תרגול של מאגרי הפרזיה בעזרת מצפטה בגודל 10 מ ל. הוסף 10 מ ל של ECGMS-בינוני לתוך המאגרים כדי לחדש את המדיום, למקם את יחידת פלואידיג חזרה לתוך החממה CO2 ב 37 ° צ' ו 5% CO2, והפעל מחדש את הטיפוח flu, באמצעות תוכנת בקרת המשאבה.
      הערה: הפונקציה של משאבת הלחץ יכול לפתע להיות מופרת על ידי מכונות מעבדה כגון צנטריפוגות גדולות, אשר עשוי ליצור הפרעה שדה חזק מגנטי. ההפרעה הפתאומית הזאת. עלולה להוביל לניתוק תאים לדאוג כי מכונות כאלה אינם פעילים ליד משאבת הלחץ במהלך הניסוי.
    7. התחילו את ההתחממות המוקדמת של תא הדגירה של הטמפרטורה המכסה את השלב של המיקרוסקופ הפלואורסצנטית ל 37 ° c עבור טמפרטורה לרמה 24 שעות לפני ההדמיה המיקרוסקופית. לאחר המיקרוסקופ הוא מראש, להתחיל את השליטה בתוכנה מיקרוסקופ ולהתאים את ההגדרות העיקריות עבור ניטור מיקרוסקופיים פלואורסצנטית על ידי בחירת הגדרות מסנן המתאים (540 nm/590 nm לאיתור של חיידקים RFP הביע 470 nm/515 ננומטר לאיתור פליטת fluorescein של נוגדנים בעלי FITC-מצופיסגור-ספציפי. לחמם תא חימום נוסף לדגירה של יחידת הפלואידיג ב 37 ° c.
      הערה: במהלך ניתוחי זיהום וניטור מיקרוסקופיים את הטמפרטורה של שקופית הערוץ ואת המדיום במחזור לא צריך להקטין באופן משמעותי, כי זה יהיה לייצר לחץ קר על התאים. באופן כללי, הגודל של תאי הטמפרטורה המכסה את המיקרוסקופ אינו מספיק כדי לכסות את כל יחידת הפלואידיג. לכן, מומלץ להשתמש בחדר חימום נוסף שחומם ל37 מעלות צלזיוס.
    8. להדמיה מיקרוסקופית, הציבו את יחידת הפלוטואידים בחדר החימום הקדם-ממדי של 37 ° c והציבו את שקופית הערוץ בשלב של 37 ° c מיקרוסקופ מראש.
      הערה: להדמיה מיקרוסקופית, יחידת הפלואידיג ושקופית הערוץ הדרושים להסרה מאינקובטור של CO2 בשל האורך המוגבל של אבובים הפרזיה. אם זמני זיהום וניטור מיקרוסקופיים יותר מ 180 דקות נדרשים מחוץ 5% CO2 האטמוספירה עבור pH אגירה, מדיום באגירה ph צריך לשמש לטיפוח מיקרופלואידיג.
    9. לשלוט על מורפולוגיה התא ואת היושרה של שכבת HUVEC לפני הזרקה של היסטמין וחיידקים למחזור זרימת לאורך זמן ניסוי הזרימה ולאחר סיום ניסוי הזרימה באמצעות מצב שדה בהיר של המיקרוסקופ.

4. אינדוקציה של VWF-שחרור והדמיה של מיתרים VWF מולטימאד

  1. לשמור על הגדרת הזרימה, כי לחץ ההטיה של 10 דינמיקה/cm2 נדרש כדי להפעיל את המולטימטיזציה של vwf למחרוזות ארוכות של עד 200 מד א. לזרז את שחרורו של vwf מ-wpb אנדותל על ידי הזרקת 136 μl של 100 mM היסטמין פתרון מניות לתוך מחזורי ecgms-בינוני בצינורות זלוף באמצעות יציאת הזרקה. הריכוז הסופי של היסטמין. במדיום הזורם יהיה 1 מ"מ אם אין יציאת הזרקה זמין, היסטמין ניתן להוסיף לחילופין על ידי ליטוף לתוך המדיום של מאגרי המשאבה.
  2. עבור האבחון של מחרוזות VWF החיסונית של multimerized, לעצור את הזרימה כאשר רמת בינונית מאוזנת במאגרים הוא הגיע, ולהזריק 20 μg של נוגדן מצומת VWF ספציפי בנפח של 200 μL PBS (pH 7.4) לתוך במחזור 13.6 mL של ECGMS-בינוני באמצעות יציאת הזרקה. אם אין יציאת זריקה זמינה, את הנוגדן ניתן להוסיף לחילופין על ידי ליטוף לתוך המדיום של מאגרי המשאבה. התוצאה היא ריכוז נוגדן הסופי של 1.3 μg/mL.
  3. עבור סריקה מיקרוסקופית של מספר שדות של תצוגה בתוך זמן קצר, השתמש ביחידת הזריחה של המיקרוסקופ עם מכשיר פלואורסצנטית קסנון ב 30% כוח מצלמה אפיפלואורסצנטית. נטר את הצורה ואת המבנה של שכבת HUVEC עם מצב שדה בהיר כדי לבחור תאים מייצגים מתאים הדמיה VWF-מיתרים.
  4. עבור ויזואליזציה של מחרוזות VWF פלורסנט ירוק, בחר מטרת שמן 63 x/1.40 ומסנן זיהוי nm 470 ננומטר בתפריט היחידה הפלואורסצנטית של תוכנת המיקרוסקופ (LasX). צור תמונות של Z-ערימות של לפחות 50 התצוגות של שדה הנציג, כל אחד המכיל כ 10 HUVEC ללא שינוי מורפולוגית. לקוונפיקציה של מחרוזות VWF פלורסנט ירוק בנקודות זמן שונות, לסרוק כמה שדות של תצוגה.

5. מיקרוסקופיים הערכה של מצורף חיידקי VWF-מיתרים זורם בזמן אמת

  1. לכמת את האביזר הפנאומטי ל-VWF-מיתרים שנוצרו על משטחי תא HUVEC באמצעות זיהוי immunofluorescence.
    1. להחזיק את הזרם ולהזריק 1.35 x 108 cfu/ML rfp-הביע פנאומטי בנפח מרבי של 1 mL לתוך ECGMS-בינונית באמצעות יציאת ההזרקה. לחילופין, פיפטה את החיידקים לתוך המדיום במאגר המשאבה. הפעל מחדש את הלחץ הטיה ב 10 דינמיקה/cm2 כדי לאפשר לחיידקים לזרום בתוך מערכת המשאבה.
    2. בחר 63 x מטרת הטבילה שמן להגדלה מיקרוסקופ ולהתאים את הגדרות מסנן הזריחה בתוכנת המיקרוסקופ ל-RFP-ערוץ (540 לזיהוי ננומטר מסנן) לאיתור של RFP-הביע פנאומטי.
    3. עבור כימות של החזקה בקטריאלי למחרוזות VWF, לעצור את הזרימה וליצור תמונות של Z-ערימות של לפחות 30 השדה הנציג תצוגות, כל אחד המכיל כ 10 מורפולוגית ללא פגע HUVEC, ולספור את כמות הפנאומטי.
    4. השתמש באלגוריתם הסטטיסטיקה של העצרת הראשונה של ANOVA כדי להעריך את הנתונים, ולאחר מכן בדיקת דגימה דו-זנבית בעלת שני הזנב לאחר השוואה סטטיסטית מפורטת. ערכי P של < 0.05 נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

6. הערכה מיקרוסקופית של בקטריאלי מצורף ל VWF-מיתרים לאחר קיבעון לדוגמה

  1. לדגום את הקיבעון לפני. הצביעת האימונולוורנציה
    1. לעצור את הזרימה, להסיר 10 מ ל של ECGMS-בינוני מתוך מאגרי המשאבה, ולהוסיף 10 מ ל של PBS שיושלם עם 5% פאראפורמלדהיד (בתחתית). תן את הפתרון הדינמיקה לזרום 10 דקות במתח הטיה של 10/cm2.
    2. נתק את שקופית הערוץ מיחידת המשאבה.
  2. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על משטח התא ובצע זיהוי חיסוני של מחרוזות VWF וחיידקים מצורפים.
    1. הכינו 4 מ ל של פתרון כביסה המכיל 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז עבור כל שלבי הכביסה. הכינו 1 מ ל של פתרון חסימה המכיל 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז ו 2% בסרום בקון אלבומין (bsa) עבור חסימת אתרי איגוד לא ספציפי.
    2. לשטוף את השקופית התחתית הערוץ 3x שקופית באמצעות 1 mL מזרק Luer להזריק 200 μL של פתרון כביסה ומארג השקופית עבור 120 דקות בשעה RT עם 200 μL חסימת פתרון.
    3. הכן 4 מ מ של פתרון חוסם אחר המכיל 100 mM Na2CO3, (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז ו 0.5% bsa עבור דילול של נוגדנים. השתמש 200 μL של פתרון חוסם זה כדי לדלל את הנסיוב האנטי-קוקוס הספציפי לארנב 1:100. השתמש ב-200 μL של פתרון חוסם זה כדי לדלל את הנוגדן VWF-ספציפי העכבר 1:50 כדי להפוך את ריכוז הנוגדן הספציפי VWF של 4 μg/mL. לדלל את הנוגדן משני AlexaFluor488 מצותת מ 2 מ"ג/mL פתרון מניות 1:100 ב 200 μL של PBS (pH 7.4) כדי ליצור ריכוז סופי של 20 μg/mL.
      הערה: ב הגדרות החיסונית המתוארת, זיהוי נוגדנים נמסר תוצאות אופטימליות כאשר הנוגדנים היו מדולל במאגר פחמתי אלקליין הנ ל. בהתבסס על תוצאות קודמות, הפתרונות החוסמים המומלצים וכמות הנוגדנים מתאימים ליישומים רבים. עם זאת, ניסויים שונים עשויים לדרוש אופטימיזציה אינדיבידואלית של שילוב הנוגדן, הנוגדן ריכוז, זמן דגירה, והחוקה של המאגר חוסם. כחלופה, מערכת פוספט באגירה עם טווח pH נייטרלי יכול להיות מתאים או אפילו מועדף כמו מאגר דגירה. במקרה של אותות זריחה חלשה, הריכוז של נוגדנים משני צריך להיות מוגבר. אם מזוהה יותר מדי רעש של רקע בלתי מוגדר, כמות חומרי החסימה צריכה להיות מוגברת.
    4. עבור VWF-אימונוofor, כתמים לשטוף את שקופית הערוץ באמצעות 1 מ"ל Luer מזרק על ידי הזרקת 200 μL של פתרון כביסה 3x ו-מודלת את השקופית 1:50 באמצעות נוגדן VWF מדולל ספציפי עבור 30 דקות ב-RT. לאחר מכן, לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של הפתרון כביסה ו-מעכלת את השקופית עם 1:100 מדולל AlexaFluor488-מעלה נוגדן העכבר עבור 30 דקות ב RT. לבסוף, לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של פתרון כביסה.
      הערה: האלכאפילואור-פלואורואופהורס רגישים ללבנה. לכן, השקופית צריכה להיות מוגנת על ידי שמירה על הבית בחדר חשוך במהלך שלבי הדגירה עם הנוגדנים מצופפור.
    5. עבור זיהוי חיסוני של הינע הפנאומטי, מודלת את השקופית עם נוגדן הארנב הספציפי 1:100 מדולל-קוקוס עבור 30 דקות ב-RT. לאחר מכן, לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μL של פתרון כביסה ו מודלת את השקופית עם 1:100 מדולל AlexaFluor568-מעלה נוגדן ספציפי לארנב עבור 30 דקות at RT. לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של פתרון כביסה.
    6. כדי להכתים את שלד אקטין הסלולר עם phalloidin, החדיר של huvec על ידי דגירה עם 120 μl של 0.1% טריטון X-100 עבור 5 דקות ב RT. לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μl של פתרון כביסה ומודלת את השקופית עם 120 μl של 1:1000 מדולל . AlexaFluor350. שלב הדגירה הזאת יהיה להמחיש את שלד ציטוטין הפילמור ולאפשר ניטור של הצורה ואת הלחץ אפשרי המושרה שינויים מורפולוגיים.
    7. לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μL של פתרון כביסה. לבסוף, לשטוף את השקופית 4x עם 200 μl ddh2O ו לדמיין את מחרוזות vwf ירוק פלורסנט, החיידק פלורסנט אדום, ואת השלד הכחול פלורסנט אקטין באמצעות הגדרות המסנן המתאים על המיקרוסקופ ניאון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Culturing הראשי huvec בזרימה חד כיווני מתמדת היווצרות שכבת התאים הקשורים וגדוש בחוזקה המקדם את הדור של wpbs הסלולר ממולא vwf המכונה הרגיש13,14. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת המבוססת על לחץ אוויר מבוסס על משאבה, לניתוח זיהום המחייב לחקות את המצב לחץ ההטיה בזרימת הדם האנושית.

מערכת זו מאפשרת הגדרה מוגדרת ומבוקרת תוכנה של תנאי זרימה. ערכת הזרימה באיור 1 ממחישה את זרימת העבודה העיקרית, החל בטיפוח-תרגול של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של אינטראקציה חיידקית עם חלבונים מארחים רגישים מכונאי כגון VWF דורש מערכת התרבות התא המכונה המאפשרת את הדור של זרימה מוגדרת, חד כיווני, רציפה של נוזלים, ובכך לייצר מאמץ הטיה אמין . כמה מערכות משאבות מיקרופלואידיסי כבר תוארו. סקירה מקיפה של ברגמן ואח ' מסכמת את ההיבטים המרכזיים של מודלים שונים של תרבות התא השני והתלת-ממדיים17.

הטכנולוגיה המיקרופלואידיסי היא טכניקה מאוד צעירה שהחלה בתחילת שנות ה-90 עם התפתחות של מיקרומטר בשליטה, הניתנת לשינוי ומיקרו-סביבות במיקרו-מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט מומן על ידי DFG (להיות 4570/4-1) כדי S.B.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל מזרק LuerFisher Scientific10303002בנפח 1 מ"ל להזרקת ג'לטין באמצעות חיבור הלואר של המגלשות
2 מ"ל מזרקLuer Sarstedt9077136להזרקה/הזרקת נוזלים לחיבורי הלואר של מגלשות תא התעלה
AccutaseeBioscience עכשיו תרמו פישר00-4555-56תערובת פרוטאז המשמשת לניתוק עדין של תאי אנדותל
AlexaFluor350-מצומד PhalloidinAbcamab176751אין ריכוז זמין מהיצרן, תמיסת המלאי מספיקה ל-300 ציצים, החברה ממליצה להשתמש ב-100 ומיקרו; L של דילול של 1:1,000, פלואורסצנציה כחולה (הגדרות מסנן DAPI)
AlexaFluor488-מצומד נגד עכברים נגד עכבריםThermo Fisher SientificA11001ריכוז מלאי: 2 מ"ג/מ"ל לצביעה חיסונית של VWF אנושי בשקופית מיקרופלואידית לאחר קיבוע PFA, פלואורסצנטי ירוק
AlexaFluor568-מצומד נגד נוגדנים נגד ארנב שמקורו בעזיםThermo Fisher ScientificA-11011ריכוז מלאי: 2 מ"ג/מ"ל לצביעה חיסונית של פנאומוקוק בשקופית מיקרופלואידית לאחר קיבוע pFA, פלואורסצנטי אדום
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210מדיום תרבית חיידקים מורכב
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gמסיס, להכנת חיץ חוסם
צלוחיות תרבית תאים עם פילטרTPP90026תת-גידול של HUVEC בצלוחיות תרבית תאים לא מצופות של 25 ס"מ2 צנטריפוגה פני השטח
Allegra X-12Rבקמן קולטר מדעי החיים392304מסתובב כלפי מטה של חיידקים (נפחים של >2 מ"ל)
צנטריפוגה אלגרה X-30בקמן קולטר מדעי החייםB06314מסתובב כלפי מטה של תאים אוקריוטיים
צנטריפוגה Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mמסתובב של חיידקים (נפחים של פחות מ-2 מ"ל)
כלורמפניקולCarl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה3886.2משמש בריכוז של 0.2 מ"ג/מ"ל לגידול פנאומוקוק שעבר טרנספורמציה עם מבנה גנטי הנושא חלבון פלואורסצנטי אדום וקלטת עמידות לכלורמפניקול
מהדק לצינורות זלוףibidi10821להחזקת הנוזל בצינור המחבר את המגלשה למערכת המשאבה
חממת CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40גודל החממה מותאם באופן מושלם לגודל היחידה הנוזלית עם מגלשת תעלה מחוברת ושימש לגידול זרימה ב-37 מעלות; C ו-5% CO2
CO2-IncubatorSanyoMCO-18 AICלדגירה של חיידקים ותאים באטמוספירה מוגדרת ב-5% CO2 ו-37 ° C
קולומביה דם אגר צלחותBecton Dickinson GmbHPA-254005.06מדיום תרבית מורכב מבוסס אגר עבור S. pneumoniae בתוספת 7% דם כבשים
מחשבDellLatitude 3440Comuter עם תוכנת משאבת לחץ
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)LeicaDMi8מיקרוסקופ הפוך עם במה המכוסה בתא מחומם ועם יחידת פלואורסצנטיות המצוידת במסנן פלואורסצנטי, מקור אור קסנון (SP8, DMi8) ו-DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 מגה-פיקסל)
Di אשלגן מימן פוספט (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה3904.1משמש למאגר PBS
חומר ייבושMerck101969חרוזי סיליקה כתומים לייבוש המשמשים בבקבוק זכוכית עם מתאם צינור
תוסף ECGM תערובתPromocellC-39215ל-ECGM -בינוני, נדרש לגידול מוקדם של תאי אנדותל: 0.02 מ"ל/מ"ל סרום עגל עוברי, 0.004 מ"ל/מ"ל תוסף צמיחת תאי אנדותל, 0.1 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי, 1 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי, 90 ומיקרו; גרם/מ"ל הפרין, 1 ומיקרו; גרם/מ"ל הידרוקורטיזון
ECGMSPromocellC-22010ECGM בתוספת 5% [w/w] FCS ו-1 מ"מ MgSO4 להגברת הידבקות התאים
מדיום גידול תאי אנדותל (ECGM, מוכן לשימוש)PromocellC-22010מדיום תרבית של HUVECs, שכבר הוסף עם כל מרכיבי תערובת התוספים
סרום עגל עוברי (FCS)ביוכרום כעת MerckS 0415תוסף לתרבית תאים, המשמש לניתוחי זיהומים
נוגדן VWF אנטי אנושי מצומד FITCAbcamab8822ריכוז מלאי: 10 מ"ג/מ"ל, לזיהוי חיסוני של VWF כדורי ומולטימרי בזרימה
יחידה נוזליתibidi10903יחידה נוזלית לגידול זרימה
ג'לטין (חזיר)Sigma AldrichG-1890-100gלציפוי מקדים של משטח תעלת מיקרו-סלייד
היסטמין דיהידרוכלורידSigma AldrichH-7250-10MGלאינדוקציה של הפרשת VWF מגופי Weibel Palade אנדותליים
תא אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042תאי אנדותל ראשוניים מתורם מאוגד, מאוחסנים בקריפקושמור בחנקן
נוזלי נוגדן ספציפי ל-VWF אנושי שמקורו בעכבר (חד שבטי)סנטה קרוזsc73268ריכוז המלאי: 200 ומיקרו; g/mL לצביעה חיסונית של VWF בשקופית מיקרופלואידית לאחר קיבוע PFA
יציאת הזרקהibidi10820להזרקת היסטמין או חיידקים לתוך צינורות המאגר במהלך זרימת הזרימה
מיקרוסקופ אורZeissAxiovert 35Mמיקרוסקופ אור הפוך לשליטה בניתוק תאים אוקריוטיים וספירת תאים באמצעות יעד מים פי 40 המאפשר הגדלה
של פי 400Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176שקופיות מותאמות פיזית לגידול פלודי (μ – שקופית I0.4Luer עם גובה תעלה של 0.4 מ"מ, נפח ערוץ של 100 μ L, שטח גידול של 2.5 ס"מ ושטח ציפוי של 25.4 ס"מ2) מתאים לכל מיני בדיקות זרימה, הטיפול הפיזי מייצר משטח הידרופילי ודביק.
מגנזיום גופרתי (MgSO4, לא מיובש)סיגמא אולדריץ'M7506-500Gלהכנת א.ק.ג. בינוני
משאבה מיקרופלואידיתibidi10905משאבת לחץ אוויר
Neubauer תא ספירת תאיםKarl Hecht GmbH& Co KG40442002תא ספירה מיקרוסקופי עבור HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)Electron Microscopy Sciences15710-Sלקישור צולב של דגימות
סט זלוףibidi10964סט זלוף צהוב/ירוק בעל קוטר צינור של 1.6 מ"מ, אורך צינור של 50 ס"מ, נפח עבודה כולל של 13.6 מ"ל, נפח צינור מת של 2.8 מ"ל וגודל מאגר של 10 מ"ל. בשילוב עם µ-slide L0.4Luer, ב-37 מעלות; C וצמיגות של 0.0072 dyn x s/cm2 ניתן להגיע לטווח קצב זרימה של 3.8 מ"ל/דקה עד 33.9 מ"ל/דקה ומתח גזירה בין 3.5 dyn/cm2 ו-31.2 dyn/cm2. באורך של 50 ס"מ עבור
פוספט (PBS)התמיסה הוכנה באמצעות הכימיקלים הבאים: 0.2 גרם/ליטר KCl, 1.44 גרם/ליטר Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
קובטות פלסטיקSarstedt67,741(2 x אופטי) למדידת OD ב-600 ננומטר
אנטי-סרום ספציפי לפנאומוקוקPinedaשגדל בארנב באמצעות Streptococcus pneumoniae NCTC10319 ו-D39, מטוהר IgG באמצעות עמודת חלבון A-sepharose.
צלחת פוליסטירן או קלקרזהו צעד זהירות כדי למנוע לחץ קר על התאים שנזרעו במגלשות התעלה. ניתן להשתמש בכל סוג של קלקר כגון חומר קופסת אריזה. עובי הצלחת עשוי להיות 0.5 ס"מ וצריך להיות בגודל 20 ס"מ2.
אשלגן כלורי (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1חיץ PBS
(PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4תוכנת מחשב לשליטה במשאבת הלחץ, קביעת תנאי הזרימה והתחלה/סיום הזרימה
צינורות תגובה 1.5/2.0 מ"לSarstedt72.706/ 72.695.500נדרש לדילול נוגדנים
צינורות תגובה עם 50 מ"ל כרךSarstedt6,25,48,004
פנאומוקוק המבטא RFPאוסף לאומי של תרבויות סוג, בריאות הציבור אנגליה10,319סטרפטוקוקוס פנאומוניה סרוטיפ 47 מבטא RFP התמזג לחלבון דמוי אהיסטון המשולב בגנום
צנרת סרולוגית 5, 10 מ"לSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025לצנרת נפחים
גדולים יותרנתרן פחמתי (Na2COsub3, ללא מים)Sigma Aldrich451614-25Gלהכנת מאגר נתרן פחמתי 100 מ"מ
נתרן דימימן פוספט (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2משמש למאגר PBS
פוטומטר ספקטרלי Libra S22Biochrom80-2115-20מדידת צפיפות אופטית (OD) של תרחיף חיידקים ב-600 ננומטר
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S0389-500Gלהכנת מאגר חוסם
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLמשמש בריכוז קצה של 0.1% מדולל ב-dH20 לחדירות תאים אוקריוטיים לאחר קיבוע PFA
תמצית שמריםאוקסואידLP0021חיידקים מעובדים בתוסף THB עם 1% [w/w] תמצית שמרים = גידול חיידקים מלא בינוני THY
תוספי תמיסת מלח מיקרופלואידית משמש לתוכנת בקרת משאבת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HUVECVWF

מאמרים קשורים