מאמר שיטה

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

DOI:

10.3791/60329

⸱

25 באוקטובר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא טכנולוגיה מתפתחים במערכות ובביולוגיה סינתטית לייצור מתורבת של חלבונים. עם זאת, אם CFPS הולך לנוע מעבר למעבדה ולהיות מקובל וסטנדרטי רק בטכנולוגיית ייצור הזמן, אנחנו חייבים להבין את גבולות הביצועים של מערכות אלה. לקראת שאלה זו, פיתחנו פרוטוקול חזק כדי לכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה משתמשת בתקנים פנימיים המתויגים עם 13ג-אנילין, ואילו תרכובות במדגם הן ללעג עם 12ג-אנילין. הסטנדרטים הפנימיים והמדגם היו מעורבים ונותחו על-ידי כרומטוגרפיה ברמה הפוכה-ספקטרומטריה (LC/MS). שיתוף של תרכובות הדיכוי יון מסולק, המאפשר כימות מדויקת של ריכוזי מטבוליט מעל 2-3 הזמנות של גודל שבו מקדם המתאם הממוצע היה 0.988. חמישה מתוך 40 תרכובות לא היו מתוייגות עם אנילין, עם זאת, הם עדיין זוהו במדגם CFPS וכימות עם שיטת עקומה סטנדרטית. לרוץ כרומטוגרפי לוקח בערך 10 דקות להשלים. יחד, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי להפריד ומדויק לכמת 40 תרכובות מעורבות CFPS בריצה LC/MS אחת. השיטה היא גישה מקיפה ומדויקת לאפיון חילוף חומרים ללא תא, כך שבסופו של דבר, אנו יכולים להבין ולשפר את התשואה, הפרודוקטיביות ויעילות האנרגיה של מערכות ללא תא.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא פלטפורמה מבטיחה עבור ייצור של חלבונים וכימיקלים, יישום שהיה שמור באופן מסורתי עבור תאים חיים. מערכות ללא תא נגזרות מתמציות תאים גולמי ומבטלות את הסיבוכים המשויכים לצמיחת התאים1. בנוסף, CFPS מאפשר גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא הפרעה של קיר התא. עם זאת, חסרה הבנה בסיסית של מגבלות הביצועים של תהליכים ללא תא. שיטות תפוקה גבוהה עבור הקוונט מטבוליזם הם יקרי ערך לאפיון של חילוף החומרים והם קריטיים לבניית מודלים מטבולית חישובית2,3,4. שיטות נפוצות המשמשות לקביעת ריכוזי מטבוליט כוללות תהודה מגנטית גרעינית (nmr), התמרת פורייה-ספקטרוסקופיית אינפרא אדום (FT-IR), assays מבוסס אנזימים, וספקטרומטר המסה (MS)5,6,7 ,8. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת שלהם למדוד ביעילות תרכובות מרובות בבת אחת ולעתים קרובות דורשים גודל מדגם גדול יותר מאשר התגובות הרגילות ללא תא. לדוגמה, בחני המבוססת על אנזימים יכולים לעתים קרובות לשמש רק כדי לכמת מתחם אחד בהפעלה, ומוגבלים כאשר גודל המדגם קטן, כגון תגובות סינתזה של חלבון תא (בדרך כלל הפעלה בקנה מידה של 10-15 μl). בינתיים, NMR דורש שפע רב של מטבוליטים לאיתור וכימות הכמת5.  לגבי חסרונות אלה, שיטות כרומטוגרפיה במשולב עם ספקטרומטר מסה (LC/MS) מספקות מספר יתרונות, כולל רגישות גבוהה ויכולת למדוד מינים מרובים בו9; עם זאת, המורכבות האנליטית גדלה במידה ניכרת עם המספר והמגוון של המינים הנמדדים. לפיכך, חשוב לפתח שיטות הממש את פוטנציאל התפוקה הגבוהה של מערכות LC/MS. תרכובות במדגם מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. האות של המתחם תלוי הריכוז שלה ויעילות האינון, שבו האינון יכול להשתנות בין תרכובות יכול להיות גם תלוי במטריצה לדוגמה.

השגת אותו יעילות אינון בין המדגם והתקנים הוא אתגר בעת שימוש LC/MS לכמת מנתחי. עוד, הקוונפיקציה הופכת מאתגרת יותר עם גיוון מטבוליט בשל פיצול האות ו טרוגניות באהדה פרוטון וקוטביות10. לבסוף, מטריצת שיתוף הפעולה של המדגם יכול גם להשפיע על היעילות יינון של תרכובות. כדי לטפל בנושאים אלה, מטבוליטים יכול להיות לריקי כימית, להגדיל את הרזולוציה ואת הרגישות של מערכות LC/MS, ובמקביל להקטין את האות פיצול במקרים מסוימים10,11. העבודה הכימית עובד על ידי תיוג קבוצות פונקציונליות ספציפיות של מטבוליטים כדי לכוונן את המאפיינים הפיזיים שלהם כמו תשלום או hydrophobicity כדי להגדיל את יעילות יינון11. סוכני תיוג שונים יכולים לשמש כדי למקד קבוצות פונקציונליות שונות (למשל, amines, הידרוקסילס, פוספטים, חומצות קרבוקסילית וכו '). אנילין, אחד הסוכנים האלה ללעג, מטרות קבוצות פונקציונליות מרובות בבת אחת, ומוסיף רכיב הידרופובי למולקולות הידרופילית, ובכך מגדיל את רזולוציית ההפרדה שלהם ואת האות12. כדי לטפל באפקט הדיכוי המיני-מטריצות של המטריצה, יאנג ועמיתים פיתחו טכניקה המבוססת על התווית הפנימית של התקן הפנימי (GSIST) לתיוג שבו התקנים מתויגים עם 13ג אנילין איזוטופים ומעורבב עם המדגם 12,13. החומרים הפנימיים של המטאווליט והתקן הפנימי הם בעלי היעילות האינון מאז שהם שותפים, ויחס האינטנסיביות שלהם יכול לשמש לכמת את הריכוז במדגם הניסיוני.

במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול לזהות ולכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה מבוססת על הגישה GSIST, שבו השתמשנו 12ג-אנילין ו -13ג-אנילין לתייג, לזהות, ולכמת מטבוליטים באמצעות היפוך-שלב LC/MS. הטווח הליניארי של כל התרכובות המקיפות 2-3 הזמנות של סדר גודל עם מקדם מתאם ממוצע של 0.988. לכן, השיטה היא גישה איתנה ומדויקת לחקור חילוף חומרים ללא תא, ואולי תמציות תאים שלמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים לתיוג אנילין

  1. הכינו תמיסה של 6 מטרים ב-pH 4.5. עבודה בשכונה, לשלב 550 μL של אנילין עם 337.5 μL של מים LCMS כיתה ו 112.5 μL של 12 M חומצה הידרוכלורית (HCl) בשפופרת צנטריפוגה. הבאר מערבולת ולחנות ב 4 ° c.
    הערה: אנילין יכול להיות מאוחסן ב -4 ° c במשך חודשיים.
    התראה: אנילין הוא רעיל מאוד ויש לעבוד איתו בתוך מכסה. חומצה הידרוכלורית היא מאוד מאכל
  2. להכין פתרון אנילין 6 M 13C ב-pH 4.5. לשלב 250 מ"ג של 13ג6-אנילין עם 132 μl של מים ו 44 μl של HCl 12 מ '. ומערבולת היטב ולחנות ב 4 ° c.
  3. הכינו 200 מ"ג/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-אתנוקרבודיוידאיתיההידרוכלק (EDC) פתרון. התמוססות 2 מ"ג של EDC ב 10 μL של מים עבור כל מדגם להיות מתויג ומערבולת היטב.
    הערה: הפתרון EDC צריך להיות מוכן באותו יום כמו התגובה. EDC משמש זרז ללעג של תרכובות עם אנילין12.

2. הכנת תקנים

  1. הפוך פתרונות מניות נפרדים של כל התרכובות המומסים ב-LC/MS מים כיתה (שולחן 1).
  2. הכנת פתרון מניות פנימי סטנדרטי
    1. לשלב את כל התרכובות למעט ניטינאמיד אדנוינה (NAD), הניאודאמיד אדנולין הז פוספט (nadp), הפאווין אדנין dinucleotide גאות (אופנה), מרחלקסיל co A (ACA), וגליצרול 3-פוספט (Gly3P), עם אמצעי האחסון המתאימים ל ליצור פתרון 2 מ"מ מניות של כל התרכובות.
  3. לשלב NAD, NADP, אופנה, ACA, ו Gly3P עם אמצעי האחסון המתאימים כדי ליצור פתרון 2 מ"מ מניות.

3. הכנת דגימה (איור 1)

  1. כיבוי ומזרז את החלבונים בתגובת סינתזה של חלבון ללא תא על ידי הוספת נפח שווה של קרח קר 100% אתנול לתגובה. צנטריפוגה את המדגם ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להעביר את הסופרנטאנט. לצינורית צנטריפוגה חדשה
    הערה: ניתן לאחסן דגימות ב-80 ° c בשלב זה ולנתח במועד מאוחר יותר

4. תגובת תיוג

  1. הוספת תוויות למדגם עם 12ג-תמיסה אנילין
    1. העברה 6 μL של מדגם לתוך צינור צנטריפוגה חדש ולהביא את עוצמת הקול ל 50 μL עם מים.
      הערה: גודל דגימת אמצעי אחסון עשוי להיות תלוי בתגובת CFPS הספציפית.
    2. הוסף 5 μL של 200 mg/mL EDC פתרון.
    3. הוסף 5 μL של 12C-פתרון אנילין.
      הערה: פתרון אנילין מפריד בין שני שלבים. מערבבים היטב לפני הוספת התגובה.
    4. מערבולת התגובה עם טלטול עדין עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 2 h, להסיר את הצינורות מן השייקר ולהוסיף 1.5 μL של triethylamine (תה) לתגובה במנוע.
      הערה: טריאתיאמילין מעלה את ה-pH של הפתרון העוצר את תגובת התיוג של אנילין ומייצב את התרכובות.
      התראה: טריאתילאמין רעיל וגורם לגירוי בעיניים ובדרכי הנשימה.
    6. צנטריפוגה ב 13,500 x g עבור 3 דקות.
  2. הוספת מענה לתקנים פנימיים באמצעות 13ג-פתרון אנילין
    1. לדלל פתרון מניות פנימיות כדי 80 μM עם נפח סופי של 50 μL.
      הערה: ניתן לכוונן את ריכוז התקנים הפנימיים לרמות הקרובות למדגם הנסיוני.
    2. הוסף 5 μL של 200 mg/mL EDC פתרון.
    3. הוסף 5 μL של 13ג-פתרון אנילין.
    4. מערבולת התגובה עם טלטול עדין עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 2 h, להסיר את הצינורות מן השייקר ולהוסיף 1.5 μL של תה לתגובה במנוע.
    6. צנטריפוגה ב 13,500 x g עבור 3 דקות.
  3. שילוב מתויג תקן פנימי ו מתויג לדוגמה
    1. מערבבים 25 μL של 12c-מדגם אנילין עם 25 μl של 13ג-אנילין מסומן כסטנדרט.
    2. העבר למבחנה עם דוגם אוטומטי ונתח לפי הליך LC/MS.
  4. יצירת עקומה סטנדרטית עבור מטבוליטים לא מתויגים
    1. לדלל פתרון מניות של מטבוליטים לא מתויגים (NAD, NADP, אופנה, ACA, ו Gly3P) לריכוזים הסופי של 320 μM, 80 μM, 20 μM ו-5 μM עם נפח של 50 μL.
    2. הוסף 5 μL של 200 mg/mL EDC פתרון.
    3. הוסף 5 μL של 12C-פתרון אנילין.
    4. מערבולת התגובה עם טלטול עדין עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 2 h, להסיר את הצינורות מן השייקר ולהוסיף 1.5 μL של תה לתגובה במנוע.
    6. צנטריפוגה ב 13,500 x g עבור 3 דקות.
    7. העבר supernatant לבקבוקון דוגם הרכב ולנתח על-ידי הליך LC/MS.
      הערה: מטבוליטים לא מתויגים מבצע את אותו ההליך כמו המדגם כדי לשכפל את המטריצה לדוגמה כדי לשמור על יעילות האינון דומה.

5. הכיוונון של הליך LC/MS

  1. הכנת ממיסים
    1. הכינו 5 מ"מ מימית הפתרון (יפורסם) המותאם ל-pH 4.75 עם חומצה אצטית.
      הערה: יפורסם בשלב הנייד מסייע לאנליטים להשיג רזולוציה טובה והפרדה14.
    2. הכינו 5 מ"מ משנת יפורסם ב-acetonitrile (ACN).
    3. להכין לשטוף את הממס עם 5% מים ו 95% ACN.
    4. להכין לטיהור הממס עם 95% מים ו 5% ACN.
  2. הכיוונון של תנאי MS
    1. הגדר את ספקטרומטר המסה למצב יון שלילי עם טמפרטורת החללית של 520 ° c, מתח נימי שלילי של-0.8 kV, מתח קפילר חיובי של 0.8 kV, ולהגדיר את התוכנה כדי לרכוש נתונים ב 5 נקודות/s.
    2. הגדר הקלטות יון נבחרות (SIR) עבור כל מטבוליט עם מתח חרוט שצוין והמסה על חיוב (m/z) ערכים. ראה שולחן 1.
  3. מאתחל LC/MS על פי הוראות היצרן
    1. קווי הממס העיקריים של מנהל הממס עבור 3 דקות.
    2. ממיס הממשלה לשטוף (5% מים, 95% ACN) ו לטהר את הממס (95% מים, 5% ACN) עבור 15 s עבור 5 מחזורים.
    3. הגדר את מנהל הדוגמה ל-10 ° c.
    4. התקנת סי18 (1.7 μm, 2.1 mm x 150mm) עמודה ולאתחל עמודה עם 100% ACN ב 0.3 mL/min עבור 10 דקות.
    5. מצב את העמודה ב 95% מים ו 5% ACN ב 0.3 mL/min עבור 10 דקות לפני היכרות עם ממיסים עם מאגרים.
    6. תנאי העמודה ב 95% ממס A (5mM יפורסם מימית, pH 4.75) ו 5% ממס B (5 מ"מ יפורסם ב ACN) ב 0.3 mL/min עבור 10 דקות.
    7. הגדרת פרוטוקול מעבר צבע עם הימנעות החל 95% ממס A ו 5% מומס B, העלה ל 70% הממס B ב 10 דקות, העלה 100% ממס B ב 2 דקות והחזיק ב 100% מומס B עבור 3 דקות. חזרה לתנאים הראשוניים (95% ממס A , 5% מממס B) מעל 1 דקות ולהחזיק עבור 9 דקות כדי לשחזר את העמודה.
    8. החלת העמודה באמצעות פרוטוקול מעבר הצבע 3 פעמים לפני ההזרקה על העמודה.
  4. הזרקת דגימות ותקנים
    1. הכנס 5 μL של המדגם לתוך העמודה ורכוש את העוצמות המתאימות של כוונת ה-m/z עבור המדגם של 12C-אנילין.
    2. הכנס 5 μL של אותו מדגם שוב, אך הפעם השג את עוצמות היון m/z עבור התקנים המתויגים 13C-אנילין.
      הערה: מערכת ה-LC/MS שלנו אינה מסוגלת לרכוש הן 12c ו -13כוונות מז/ת' בחלונות הזמן המצוינים של האדון, מאחר שהוא מהווה יותר מדי נתונים לרכישה בחלון הזמן שצוין. לכן, אנחנו מזריקים. את אותה דוגמית פעמיים
    3. הכנס תקני מטבוליט לא מתויגים מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר והקלט את עוצמות היון המתאימות של m/z.

6. כמת

  1. יצירת שיטת ייצוא
    1. בתוכנת רכישת נתונים, בחר קובץ > שיטה חדשה > שיטת ייצוא.
    2. ציין שם קובץ, כגון AnilineTagging_Date.
    3. בדוק את קובץ ASCII ייצוא ובחר ספרייה לייצא את קובץ הטקסט.
    4. בסוג דוח, בחר סיכום לפי הכל.
    5. במפרידים, עבור עמודה בחר א ,. עבור שורה, בחר [cr] [אם].
    6. בטבלה, בחר באפשרות ייצוא ולאחר מכן ערוך טבלה כדי לכלול את samplename, אזור, גובה, כמות ויחידות.
    7. שמור שיטת ייצוא.
  2. בדיקת מטבוליטים עם תקנים פנימיים באמצעות תוכנת רכישת נתונים
    1. תחת הכרטיסיה ערכות לדוגמה , לחץ לחיצה ימנית על ההפעלה LC/MS המתאימה ובחר באפשרות תצוגה כ> ערוצים.
    2. בחר את כל ערוצי SIR על 13C-הסטנדרטים הפנימיים של אנילין של זריקה אחת, לחץ לחיצה ימנית ובחר סקירה.
    3. אם חלון פריסת שיטת העיבוד של LC אינו מופיע באופן אוטומטי, עבור לתצוגה ≫ פריסת שיטות עיבוד.
    4. בעיבוד שיטה, עבור אל הכרטיסיה שילוב והגדר את apextrack כאלגוריתם.
    5. עבור אל הכרטיסיה החלקה והגדר את הסוג כממוצע ורמת ההחלקה על 13.
      הערה: ניתן לבחור כל רמת החלקה, כל עוד היא עקבית בכל הדגימות.
    6. בכרטיסיה ערוץ ms, בטל עיבוד תלת-ממד של ms .
    7. בחלון הערוץ SIR, לשלב כל שיא, ערוץ אחד בכל פעם. לאחר שהשיא משולב, עבור לאפשרויות > מילוי מהתוצאה ופרטי השיא ימולאו בכרטיסיה רכיבים . שנה את שם השיא לשם המורכב המתאים.
    8. לאחר כל ערוצי סיר כבר הוערכו, לשמור את שיטת העיבוד ולסגור את החלון.
    9. בחר את כל ערוצי SIR של 13ג-אנילין ו 12ג-אנילין מתויג לדוגמה, קליק ימני ובחר תהליך.
    10. בדוק את תיבת התהליך , בחר באפשרות השתמש בשיטת עיבוד שצוינהובחר בשיטת העיבוד שנשמרה. כמו כן, בדוק את תיבת הייצוא , בחר באפשרות השתמש בשיטת ייצוא שצוינה ובחר בשיטת הייצוא שנשמרה שנוצרה מוקדם יותר. לחץ על אישור.
    11. פתח את קובץ הטקסט המיוצא ב-Excel וחשב את הריכוז של המתחם הלא ידוע באמצעות:
      figure-protocol-1
      כאשר Cx, אני הוא הריכוז של המדגם לא ידוע עבור מטבוליזם אני,x, אני הוא האזור המשולב של מטבוליט לא ידוע אני,std, אני הוא האזור המשולב של התקן הפנימי של מטבוליזם אני, Cstd, אני הוא ריכוז של התקן הפנימי של מטבוליט i, ו D הוא גורם הדילול.
  3. כימות מטבוליטים לא מתויגים עם עקום סטנדרטי
    1. תחת הכרטיסיה ערכות לדוגמה , לחץ לחיצה ימנית על ההפעלה LC/MS המתאימה ובחר באפשרות תצוגה כ> ערוצים.
    2. בחר את כל ערוצי SIR לתקנים לא מתויגים של זריקה אחת, לחץ לחיצה ימנית ובחר סקירה.
    3. אם חלון פריסת שיטת העיבוד של LC אינו מופיע באופן אוטומטי, עבור לתצוגה ≫ פריסת שיטות עיבוד.
    4. בפריסת שיטות עיבוד, עבור אל הכרטיסיה שילוב והגדר את apextrack כאלגוריתם.
    5. עבור אל הכרטיסיה החלקה והגדר את הסוג כממוצע ורמת ההחלקה על 13.
      הערה: ניתן לבחור כל רמת החלקה, כל עוד היא עקבית בכל הדגימות.
    6. בכרטיסיה ערוץ ms, בטל עיבוד תלת-ממד של ms .
    7. בחלון הערוץ SIR, לשלב כל שיא, ערוץ אחד בכל פעם. לאחר שהשיא משולב, עבור לאפשרויות > מילוי מהתוצאה ופרטי השיא ימולאו בכרטיסיה רכיבים . שנה את שם השיא לשם המורכב המתאים.
    8. לאחר כל ערוצי סיר כבר הוערכו, לשמור את שיטת העיבוד ולסגור את החלון.
    9. תחת הכרטיסיה ערכות לדוגמה , לחץ לחיצה ימנית על ערכת המדגם ובחר בדוגמה אלטר.
    10. בחר סכום בחלון החדש.
    11. בחרו ' עותק משיטת התהליך ' ובחרו בשיטת התהליך שנשמרה.
    12. הזן את הריכוז של כל מטבוליט לכל בקבוקון והזן את היחידה כ< μM עבור כל רכיב (או היחידה המתאימה) ובחר אישור.
    13. בחר שוב את ערכת הדגימה, לחץ לחיצה ימנית, הצג כ> ערוצים.
    14. בחר את כל ערוצי SIR של מטבוליטים לא מתויגים עבור הסטנדרטים, קליק ימני ובחר תהליך.
    15. בדוק את תיבת התהליך ובחר באפשרות השתמש בשיטת עיבוד שצוינה. בחרו בשיטת העיבוד המתאימה ולחצו על הלחצן ' אשר'.
    16. בחר ערוצים סיר עבור כל מטבוליטים לא מתויגים עבור דגימות, קליק ימני ובחר תהליך.
    17. בדוק את תיבת התהליך , בחר באפשרות השתמש בשיטת עיבוד שצוינה ובחר בשיטת העיבוד שנשמרה. כמו כן, בדוק את תיבת הייצוא , בחר באפשרות השתמש בשיטת הייצוא שצוינה ובחר בשיטת הייצוא שנשמרה שנוצרה מוקדם יותר. לחץ על אישור.
    18. לכמת את מטבוליטים לא מתויגים עם עקומת רגיל ולייצא את התוצאות לקובץ טקסט לספרייה שצוין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כהוכחה-of-קונספט, השתמשנו בפרוטוקול כדי לכמת מטבוליטים ב -E. coli מבוסס cfps מערכת המבטא חלבון פלורסנט ירוק (gfp).  התגובה CFPS (14 μL) היה מוכן ומלא עם אתנול. דגימת CFPS הייתה מתויגת עם 12ג-אנילין, ואילו התקנים תויגו עם 13ג-אנילין. המדגם והתקנים המתויגים שולבו והוזריקו לתוך ה-LC/MS (איור 1). הפרוטוקול זוהה וככמת 40 מטבוליטים מעורב בחילוף החומרים פחמן ואנרגיה מרכזית באמצעות תקנים פנימיים, בעוד עקומת סטנדרטי עבור 5 מטבוליטים שלא תויגו עם אנילין פותחה גם (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות ללא תא יש קיר תא, ולכן יש גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא צורך הכנה לדוגמה מורכבת. עם זאת, מעט מאוד עבודה נעשתה כדי לפתח פרוטוקולים יסודיים וחזקים כדי כימות לחקור מערכות התגובה של התא ללא. במחקר זה, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי לכמת מטבוליטים בתערובות התגובה של התא חינם, פוטנציאל בתמציות תאים שלמים. כימות הפרט של מטבוליטים בתערובות מורכבות, כגון אלה שנמצאו תגובות לתא ללא תא, או תמציות תא שלם, הוא מאתגר מכמה סיבות. המרכז בין הסיבות הללו הוא מגוון כימי. מערך הקבוצות הפונקציונליות הנמצאות בו בתערובות אלה (...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה שתוארה נתמכת על ידי המרכז על הפיסיקה של מטבוליזם הסרטן באמצעות הפרס מספר 1U54CA210184-01 מהמכון הלאומי לסרטן (https://www.cancer.gov/). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומיים לבריאות. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12C אניליןסיגמא-אולדריץ'242284אנילין 12C
13C תווית אניליןסיגמא-אולדריץ'485797אנילין 13C6
3-חומצה פוספוגליצריתסיגמא-אולדריץ'P88773PG
חומצה אצטיתFisherScientificAC222140010ACE
אצטוניטריל, LCMSJT BAKER9829-03ACN
אצטיל-קואנזים ASigma-AldrichA2056ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μ M, 2.1 x 150 מ"מ עמודמים186002353עמוד
אדנוזין דיפוספטסיגמא-אולדריץ'A2754ADP
אדנוזין מונופוספטסיגמא-אולדריץ'A1752AMP
אדנוזין טריפוספטסיגמא-אולדריץ'A2383ATP
אלפא-קטוגלוטראטסיגמא-אולדריץ'K1128aKG
ציטראטסיגמא-אולדריץ'251275CIT
ציטידין דיפוספטסיגמא-אולדריץ'C9755CDP
ציטידין מונופוספטסיגמא-אולדריץ'C1006CMP
ציטידין טריפוספטסיגמא-אולדריץ'C9274CTP
D-גליצרלדהיד 3-פוספטסיגמא-אולדריץ'39705GAP
אריתרוז 4-פוספטסיגמא-אולדריץ'E0377E4P
אתנולסיגמא-אולדריץ'EX0276EtOH
פישר מדעי accuSpin מיקרו 17 צנטריפוגהפישרצנטריפוגה מדעית
פלבין אדנין דינוקלאוטידסיגמא-אולדריץ'F6625FAD
פרוקטוז 1,6-ביספוספטסיגמא-אולדריץ'F6803F16P
פרוקטוז 6-פוספטסיגמא-אולדריץ'F3627F6P
פומראטסיגמא-אולדריץ'F8509FUM
גלוקונאט 6-פוספטסיגמא-אולדריץ'P78776PG
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270GLC
גלוקוז 6-פוספטסיגמא-אולדריץ'G7879G6P
גליצרול 3-פוספטסיגמא-אולדריץ'G7886Gly3P
גואנוזין דיפוספטסיגמא-אולדריץ'G7127תמ"ג
גואנוזין מונופוספטסיגמא-אולדריץ'G8377GMP
גואנוזין טריפוספטסיגמא-אולדריץ'G8877GTP
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ'258148HCl
איזוציטראטסיגמא-אולדריץ'I1252ICIT
לקטטSigma-AldrichL1750LAC
MalateSigma-Aldrich02288MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix KitArborBiosciences507024סינתזת חלבון נטולת תאים
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-אתילקרבודימיד הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'03449EDC
ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטידסיגמא-אולדריץ'43410
NAD ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספטסיגמא-אולדריץ'N5755NADP
ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט מופחתסיגמא-אולדריץ'481973NADPH
ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד מופחתסיגמא-אולדריץ'N8129NADH
אוקסלאצטטסיגמא-אולדריץ'O4126OAA
פוספואנולפירובטסיגמא-אולדריץ'P0564PEP
פירובטסיגמא-אולדריץ'P5280PYR
ריבוז 5-פוספטסיגמא-אולדריץ'R7750R5P
ריבולוז 5-פוספטCarboSynthMR45852RL5P
סדוהפטולוז 7-פוספטCarboSynthMS07457S7P
סוקסינטסיגמא-אולדריץ'S3674SUCC
TributylamineSigma-Aldrich90780TBA
TriethylamineFisherScientificO4884TEA
מים טהורים במיוחדFisherScientific10977-015מים
אורידין דיפוספטסיגמא-אולדריץ'U4125UDP
אורידין מונופוספטסיגמא-אולדריץ'U6375UMP
אורידין טריפוספטסיגמא-אולדריץ' U6625UTP
VWR מערבולת כבדהVWRמערבולת
מים, LCMSJT BAKER9831-03מים
מים Acquity H UPLC Class מנהל ממס רבעונימיםLCMS
מים Acquity H UPLC Class מנהל מדגם FTNמיםLCMS
מים Acquity Qda גלאימיםLCMS
מים להעצים 3מיםתוכנה
מים LCMS שחזור כולל בקבוקוןמים186000384cLCMS בקבוקון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012(2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LC MSLC MS

מאמרים קשורים