בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

סיכום

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

תקציר

בקטריה, כולל שחפת של פטרת (Mtb), הסוכן סיבתי של שחפת האדם, שחרור באופן טבעי ושלפוחיות (EVs) המכיל מולקולות פעילות חיסונית. ידע בנוגע למנגנון המולקולרי של שלפוחית הביוגנזה, התוכן של שלפוחיות, והתפקודים שלהם בממשק מארח הפתוגן הוא מאוד מוגבל. טיפול בשאלות אלה דורש הליכים קפדניים לבידוד, טיהור ואימות של EVs. בעבר, הפקת שלפוחית הייצור היתה משופרת כאשר M. שחפת נחשף הגבלה ברזל, מצב שנתקל Mtb בסביבה המארחת. מוצג כאן הוא פרוטוקול מלא ומפורט כדי לבודד ולטהר EVs מן הברזל מלקוי של ברזל. שיטות כמותיים ואיכותניות מוחלות על אימות EVs מטוהרים.

מבוא

מסחטות של פטרת שלפוחיות (MEVs) הם חלקיקים מאוגדים קרום, 60-300 ננומטר בגודל, באופן טבעי שוחרר על ידי מהיר-ו-לאט גדל בקטריה מפטרת¹. Mevs שוחרר על ידי חיידקים פתוגניים מהווים מנגנון לאינטראקציה עם המארח באמצעות חלבונים פעילים חיסוני, שומנים, ו גליקולפידים מופרש באופן מרוכז ומוגן^2,3,4. כדי לאפיין MEVs ולהבין הביוגנזה שלהם פונקציות, שיטות קפדניות ויעילות של שלפוחית השמש והאימות הם קריטיים. עד כה, mevs מבודדים מן filtrates תרבות של פטרת גדל בינוני עשיר ברזל^1,5,6,7,8.

עם זאת, העבודה הקודמת הוכיחה כי מגבלת ברזל מעוררת במידה רבה שחרור שלפוחית ב Mtb, אולי כדי ללכוד ברזל דרך פטרת, siderophore מופרש MEVs⁹. למרות ההליכים עבור MEVs בידוד מ Mtb תרבותי בינוני ברזל גבוה תוארו, מתודולוגיה יעילה להשיג MEVs מתרבויות ברזל נמוך לא דווחו. לכן, המטרה של שיטה זו היא לבודד, לטהר, ולכמת mevs שהתקבלו מתרבויות ברזל נמוך, כך שהם יכולים לשמש עבור בחני הביוכימי ופונקציונלי לניתוח של דטרמיניזם גנטי של ייצור שלפוחית לפוחית ב בקטריה.

פרוטוקול

1. הכנת ברזל מוגדר מידי המדיום

1. להכין 1 L של בינונית מינימלית (MM) על ידי המסת 5 גרם של KH₂PO₄, 5 g של L-אספרגין, 20 מ ל של גליצרול, ו 2 גרם של דקסטרוז ב 900 ml של מים מוהים במיכל פלסטיק. להימנע זכוכית כדי למנוע זיהום ברזל. כוונן את ה-pH ל 6.8 עם 5 N NaOH ונפח ל 1 L עם מים.
2. הוסף 50 g של שרף מתכת הכלף (MCR) ומתפרעים בעדינות באמצעות משחק מגנטי בר עבור 24 שעות ב 4 ° c. חטא והסר את mcr באמצעות סינון באמצעות יחידת סינון של 0.22 יקרומטר עם מקלט פלסטי. כדי להאיץ את הסינון ולמנוע סתימת מסננים, הנח לשרף לעבור כ -30 דקות לפני הסינון.
   הערה: מדיום זה מכיל פחות מ 2 μM שיורית ברזל, כפי שנקבע על ידי ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית.
3. תוספת MM עם 0.5 mg/L של לאוסול₂, 40 Mg/l של mgso₄, ו 0.1 Mg/l של mgso₄. בנפרד, להכין מניות מרוכז (1, 000x) של כל אחד מתוספי מתכת במים המזים ולעקר על ידי סינון לפני תוספי MM. ברזל התרוקן, מתכת בתוספת MM יהיה התייחס כאן ברזל נמוך MM (LIMM).
4. מתוך 50 מ"מ מלאי של פוריות₃ מומס 10 מ"מ, להוסיף 1 מ ל 1 L של limm (50 משנת הריכוז הסופי) כדי להכין ברזל גבוה mM (הימלM).

2. גידול בקטריה ברזל-תנאים מוגבלים

1. להפשיר את 50 μL של מלאי קפוא 15% גליצרול של Mtb ו פס לצלחת אגר שיושלם עם 10% ADN העשרה (5 g/L אלבומין, 2 g/L דקסטרוז, ו 0.85 g/L נתרן כלוריד, 0.2% גליצרול ו 0.05% יצירת רצף-80)¹⁰. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עד מושבות גלויים.
2. איחסן מושבה אחת של Mtb¹⁰ ב 2 מ ל של בינונית של ציר של פטרת (שולחן חומרים) שיושלם עם העשרה adn. מודטה עם עצבנות ב 37 ° c.
3. ניתן לתרבות Mtb לצמוח לשלב המאוחר לוגריתמי (OD₅₄₀ הוא ~ 0.8). כדי לבדוק את זה, למדוד את OD₅₄₀ באמצעות ספקטרוסקופיה.
4. התפשטות 200 μL של התרבות לוגריתמית מאוחר על לוחותהלוח של החיידק של החומר (טבלה של חומרים) שיושלם עם 0.2% גליצרול, 0.05% רצף-80, ו-adn. מחסן לפחות 5 צלחות. מודמת את הצלחות ב-37 ° צ' עד שהגידול החיידקי נראה כשכבה שוטפת. זה לוקח ~ 1 שבוע עבור Mtb.
5. להרטיב מנקי כותנה סטרילית ב LIMM. השתמש בספוגית זה כדי לאסוף חיידקים מלוחות אגר ו חסן mL של limm להכין הבולם חיידקי מרוכז עם OD₅₄₀ של ~ 1.0.
6. לדלל את ההשעיה 10 פעמים 1 L עם LIMM ולחלק אותו לשתיים, 2 L בקבוקי פלסטיק סטרילי, כל אחד המכיל 500 mL של התרבות.
7. קחו 2 מ ל של תרבות והעבירו אותו לצינור התרבות של 5 מ ל. הוסף 10 μL של 10% vol/vol tyloxapol.
8. מודפה את התרבויות ב-37 ° c בעמידה 14 יום.

3. אוסף של MEVs

1. למדוד את OD₅₄₀ של התרבות 2 מ ל בזמן איסוף. הפוך 1:10 לדילול סדרתי של התרבות והלוח 100 μL של כל דילול על צלחות אגר עם ADN ו 0.05% רצף-80.
2. העבר את התרבות כדי 5 225 mL מצינורות צנטריפוגה חרוטי ו צנטריפוגה ב 2,850 x g עבור 7 דקות ב 20 ° c.
3. לאסוף את התרבות supernatant עם פיפטה 50 mL ומסננים לעקר אותו באמצעות יחידת מסנן יקרומטר 0.22.

4. בידוד של MEVs

1. להעביר את פילטרט התרבות לתוך מערכת מעורבב האולטרסאונד תא ממוקם על 4 ° צ' ולסנן את הריכוז ב < 50 psi דרך קרום החיתוך kda 100 ~ 50 mL.
2. צנטריפוגה את פילטרט תרבות מרוכזת ב 15,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את supernatant.
3. צנטריפוגה את פילטרט התרבות בצינורות פוליקרבונט ב100,000 x g עבור 2 h ב 4 ° c.
4. השהה מחדש את כדורי הקרומי בסכום כולל של 1 מ ל של תמיסת מלח סטרילית באגירה (PBS) על-ידי ליטוף עדין.
5. מערבבים 0.5 mL של ההשעיה גלולה שהושג בשלב 4.4 עם 1.5 mL של 60% הפתרון יודיאקיול, מניב ריכוז יודיאקיול הסופי של 45% wt/vol. מערבבים את התערובת בתחתית של 13 מ"מ x 51 מילימטר ultracentrifuge שפופרת פוליפרופילן דק קירות.
6. שכבת-על של MEV-יודיקסנול 45% השעיה עם 1 מ ל של 40%, 35%, 30%, 25%, ו 20% (vol/vol ב PBS) פתרונות יודיקסנול ו-1 mL של PBS בראש.
7. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 18 h ב 4 ° c.
8. לאסוף את השברים בצפיפות 1 mL החל מלמעלה באמצעות 1 מ"ל מזרק המילטון.
9. לדלל כל שבר שנאסף ל 20 מ ל עם PBS ו צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 2 h ב 4 ° c.
10. הסר את הסופרנטנט והשהה את הגלולה ב 0.5 mL של PBS. . אחסן את הגלולה ב -4 ° c

5. קוונפיקציה של MEVs

1. למדוד את ריכוז החלבון בכל שבר על ידי שיטת ברדפורד (לוח חומרים), בעקבות הנחיות היצרן.
2. בצע ניתוח השומנים הממברנה.
   1. מודדת 10 μL של כל שבר מעבר צבע עם ממברנה פלורסנט בדיקה 1-(4-מתיונין לאמונופנקסיל) -6-פניאיל -1, 3, 5-הקספרין p-טולוט (tma-dph) בריכוז סופי של 1 μg/mL בנפח הסופי 50 μl של PBS ב 96 שחור טוב צלחות.
   2. מודקון את הצלחות ב 33 ° c עבור 20 דקות.
   3. למדוד את הזריחה ב 360 הריגוש ננומטר ו 430 הפליטה nm.

6. אנליזה איכותית של MEVs

1. לבצע אלקטרופורזה בחלבון.
   1. מערבבים כ 1 μg של דגימות MEV ב 16 μL עם 4 μL של מאגר טעינה של 5x לדוגמה (10% w/v SDS, 10 מ"מ מילימטר, 20% v/v גליצרול 0.2 M טריס-HCl, pH 6.8 0.05% w/v ברומרופנול כחול) ולחמם את דגימות במאגר לדוגמה ב 85 ° צ' עבור 5 דקות.
   2. טען ב 10% טריס/גליצין SDS-polyacrylamide ג'ל¹¹ ולהפעיל ב 10 V/cm במאגר פועל (25 מ"מ בסיס טריס, 190 מ"מ גליצין, 0.1% sds) עד החזית לצבוע כחול מגיע לתחתית של ג'ל.
   3. הכתם את הג בתמיסה בעלת רגישות גבוהה לחלבון מכתים (טבלת חומרים).
2. ביצוע הנקודה החשופה.
   1. טען 2 μL של השעיה MEVs עם ריכוז של כ 0.5 μg/μL, וכפולה מדלל סדרתי על קרום התאית ניטרוגליצרין תהליך לכתם נקודה על פי הוראות היצרן.
   2. השתמש בנסיוב חיסון הגדל עכברים נגד הכנת MEVs ב דילול של 1:5000 כמו הנוגדן העיקרי עז נגד העכבר מצמידים לחזרת peroxidase (HRP) ב 1:10000 דילול כמו הנוגדן המשני. לזהות אנטיגן-נוגדן מתחמי עם מתאים מתאימים לזיהוי המצע HRP מגיב ומערכת הדמיה.
3. בצע כתמים שליליים ומיקרוסקופ אלקטרוני.
   1. תקן 250 μL של MEVs עם 2% גלוראלדהיד ב 0.1 M cacodylate אוחר בטמפרטורת החדר עבור 2 h ו-דגירה לילה ב 4% פורמלדהיד, 1% גלוטרלדהיד, ו 0.1% PBS.
   2. הכתם את הדגימות קבוע עם 2% אוסמיום tetroxide עבור 90 דקות.
   3. מייבשים את המדגם באתנול ומטביעים את שרף האפוקסי של ספאר.
   4. התבונן ב-MEVs תחת מיקרוסקופ אלקטרוני של שידור.

תוצאות

MEVs היו מטוהרים על ידי משקעי שיפוע דיפרנציאלי במילוי צפיפות (איור 1, איור 2). תחת התנאים שתוארו, MEVs מופרדים בעיקר השבר הדרגתי 3 (F3), אשר מתאים 25% יודיקסנול. מסקנה זו מבוססת על זיהוי חלבון, השומנים הממברנה, ויזואליזציה מיקרוסקופיים של MEVs שלמים, התפלגות ננו-חלקיק size, ופעילות מחודשת חיובית עם נסיוב נגד שלפוחית (איור 2, איור 3). החלבון וריכוז השומנים המנורמל ליחידות...

דיון

שיטות מרובות כדי לטהר תא איקריוטית הנגזרות המפותחות התפתחו¹². לעומת זאת, יש מידע מוגבל על שיטות יעילות כדי לטהר חיידקים נגזר EVs⁷. בידוד יעיל של Mtb נגזר EVs צריך לשקול את הקשיים הפנימיים בגידול זה פטרת הפתוגני. Mtb יש זמן חלוקה ארוכה (~ 24 שעות) ויש לטפל ברמת בטיחות שלושה (BSL-3) תנאים. לכן, חשוב למטב את היעילות של שיטות בידוד MEV. מכיוון שהחיידקים משחררים גליקולפידים ומולקולות הידרופובי אחרות, שבהן מצטברים ומזהם בקלות את ההכנות של MEV גסה למדיום, חשוב לטהר ולאמת את Mev לפ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Amicon תא מעורבב דגם 108	EMD Milipore	UFSC40001	מערכת אולטרה-סינון תאים
BD פוליפרופילן 225 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר	05-538-61	צינורות צנטריפוגה חרוטיים
Biomax 100 kDa קרום אולטרה-סינון חתוך	EMD Milipore	PBHK07610	קרום אולטרה-סינון
שרף Chelex-100	Bio-Rad	142-2842	מתכת שרף כלאט
מידלברוק 7H10 אגר	BD Difco	262710	צלחות אגר מיקובקטריאליות
מידלברוק 7H9 מרק	BD Difco	271310	מרק מיקובקטריאלי בינוני
ניטרו תאית ספיגת קרום	GE Healthcare	10600001	ממברנת ספיגה
Optiprep	Sigma	D1556	יודיקסנול
פוליקרבונט אולטרה צנטריפוגה צינורות 25 מ"מ x 89 מ"מ	בקמן קולטר	355618	צינורות צנטריפוגה אולטרה פוליקרבונט 25 מ"מ x 89 מ"מ
צינור צנטריפוגה דק דופן פוליפרופילן 13 מ"מ x 15 מ"מ	בקמן קולטר	344059	צינור צנטריפוגה דק דופן פוליפרופילן 13 מ"מ x 15 מ"מ
בדיקת חלבון	BioRad	5000006	ברדפורד צביעת חלבון
SYPRO Ruby	בדיקות מולקולריות	S12000	כתם חלבון רגיש במיוחד
TMA-DPH	בדיקות מולקולריות	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
צלוחיות סינון ואקום	CellPro	V50022