הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

האורגנואידים התלת-ממדיים משכו תשומת לב ליכולתם ללכוד את הvivo באדריכלות, הפונקציונליות התאית והחתימה הגנטית של הרקמות המקוריות שלהם^1,2,3,4,5. החשוב ביותר, 3d אורגנואידים הוקמה מרקמות סרטן החולה או המטופל נגזר מבע (pdx) מודלים לספק הזדמנויות לא יסולא בפז להבין מנגנונים של איתות סלולרי על טומגנזה וכדי לקבוע את ההשפעות של טיפול בסמים על כל אוכלוסייה תא^{6,7,8,9,10,11,12,13}. דרוסט ואח '⁵ פיתח פרוטוקול סטנדרטי להקמת אורגנואידים של האדם והעכבר, אשר אומצה באופן נרחב בתחום של אורולוגיה. בנוסף, מאמץ משמעותי הוקדש לאפיון נוסף של 3d אורגנואידים ולהבין את המנגנונים המפורטים של tuמוריגנזה ו גרורות^4,12,14,15. בנוסף לפרוטוקול שהוקם בעבר ומקובל ביותר עבור תרבויות 3D אורגנואידים, אנו מתארים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד עבור תרבות תלת-ממד של PDO באמצעות שלוש שיטות שונות doming בתנאי תרבות אופטימיזציה.

בכתב יד זה, 3D אורגנואידים הוקמו כמודל vivo ex של סרטן הערמונית גרורתי העצם (BMPC). התאים המשמשים עבור תרבויות אלה הגיעו מסרטן הערמונית סן דייגו (pcsd) סדרה ונגזר ישירות החולה סרטן הערמונית העצם גרורות רקמות גידולים (PCSD18 ו PCSD22) או החולה נגזר מבע (pdx) מודלים סרטניים (דגימות בשם PCSD1, PCSD13, ו PCSD17). מכיוון גרורות עצם ספונטנית של תאים סרטניים בערמונית נדיר במודלים מהונדסים גנטית העכבר¹⁶, השתמשנו ישירה הירך (IF) הזרקה של תאים סרטניים האדם לתוך זכר Rag2^-/-γc^- עכברים להקמת מודלים pdx של סרטן הערמונית גרורתי עצם¹⁷.

ברגע שאורגנואיד 3D הוקמו תאים סרטניים הטרוגנית החולה או המטופל נגזר xenografts, זה חיוני כדי לאשר את זהותם כמו תאים סרטניים בערמונית כדי לקבוע פנוטיפים שלהם בתרבויות 3D אורגאיד. אימונולובורנציה כימיה (IFC) מאפשר הדמיה של ביטוי החלבון באתרו בכל תא, לעתים קרובות מציין את הפונקציות הפוטנציאליות עבור אוכלוסיות תאים ספציפיות^2,4. באופן כללי, פרוטוקולים IFC עבור רוב המכריע של דגימות כולל רקמות ותאים פשוטים וממוטבים לחלוטין. עם זאת, צפיפות התא ומספר האורגנואידים יכולים להיות נמוכים באופן משמעותי מזו של התרבות המקובלת. לכן, פרוטוקול IFC עבור אורגנואידים דורש צעדים נוספים כדי להבטיח עיבוד תקין והטבעה של פרפין עבור כל אורגנואידים בדגימות. אנו מתארים שלבים נוספים עבור תהליך הטמעה מראש וטיפים כדי לתייג את המיקום של האורגנואידים מנות בשקופית המגביר את שיעור ההצלחה של IFC על אורגנואידים במיוחד כאשר דגימות של האורגנואידים יש צפיפות תא נמוכה יותר מאשר הרצוי.

מחקר זה נעשה בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך עבור אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו (UCSD) סקירה מוסדית (IRB). IRB #090401 אישור התקבל מהלוח סקירה מוסדית UCSD (IRB) כדי לאסוף דגימה כירורגית מחולים למטרות מחקר. הסכמה מושכלת הושגה מכל מטופל ובעל עצם ניתוח סרטן הערמונית גרורות התקבל תיקון אורתופדית של שבר פתולוגי בעצם הירך. פרוטוקולי בעלי חיים בוצעו תחת אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו (UCSD) בעלי חיים רווחה מוסדית טיפול בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC) שאושרו פרוטוקול #S10298. תאים מתוך רקמת הסרטן של החולה מכנית ואנזימטי היתה פנים-מוסרית הוזרק לתוך 6 עד 8 גברים בן שבוע Rag2^-/-γ_c-^/- עכברים כפי שתוארה בעבר¹⁷. נפח גידול xenograft נקבע באמצעות מערכת הדמיה vivo biלומינסנציה ו קליבר מדידות. עם גידול גידול של עד 2.0 ס מ (הגודל המקסימלי המותר אושרה על ידי IACUC), הגידול נקצרו עבור מוסד אורגנואידים תלת-ממד.

הערה: איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ומספר פרוטוקול עבור כל שלב של ההליכים הניסיוניים.

1. עיבוד של רקמות נגזרות מבע (pdx) החולה

הערה: זהו צעד התחלתי עבור הממסד אורגאיד עבור הגידול שנגזר דגם העכבר מבע. פרוטוקול זה מותאם מפרסום קודם על-ידי Drost ואח '⁵ ושמנו את תנאי המדיה כוללים תוספי סרום למדיה ארגונית.

1. לעבד את הדגימה הגידול כפי שמתואר להלן.
   1. הומי הגידול דגימות כדי 1-3 mm³ חתיכות בגודל לעכל את הדגימות עם 10 מ ל של פתרון דיסוציאציה של תא עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. כדי לסיים את העיכול, הוסף 20 מ ל של המדיה המלאה של DMEM לדגימות.
   3. לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 70 יקרומטר. השתמש בבוכנה סטרילית כדי לדחוף כל שאריות הרקמה בחלק העליון של 70 יקרומטר תא מסננת.
   4. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
   5. שטוף את הגלולה הסלולרית שלוש פעמים עם מדיה חדשה מלאה. התאם את נפח המדיה לכביסה והשעיה מחדש עם נפח המדיה המוצע בטבלה 3. לדוגמה, עבור המצב התרבותי של 24 הצלחות, נפח הכביסה צריך להיות 500 μL.
      הערה: כפי שמוצג בטבלה 3, הפרוטוקול חל על תנאי תרבות שונים.
   6. קבע ספירת תאים סופיים באמצעות הצבע הכחול של טריקון ומכשיר הומוטומטר.
   7. לאחר קבלת ספירות תאים, להשעות מחדש את הגלולה תא ב 80 μL של 2% FBS ב PBS לכל 2 x 10⁶ תאים סרטניים.
   8. הוסף 20 μL של תא העכבר מחסור קוקטייל לכל 2 x 10⁶ תאים סרטניים. מערבבים היטב ומשלבים במשך 15 דקות ב 2-8 ° c.
   9. כוונן את אמצעי האחסון ל-500 μL עם 2% FBS במאגר PBS לכל 2 x 10⁶ תאי גידול.
      הערה: עד 1 x 10⁷ תאים סרטניים ב 2.5 מ ל של השעיית תא ניתן לעבד על עמודה LS אחת.
   10. טען את עמודות ה-LS על מפריד העמודות המגנטי והניחו צינורית חרוט של 15 מ ל בארון מתחת כדי לאסוף את הזרימה.
   11. לשטוף כל עמודה עם 3 מ ל של 2% FBS במאגר PBS. השמט את צינורית החרוט עם השטיפה והחלף בצינור האוורור החדש והסטרילי של 15 מ"ל.
   12. הוסף את ההשעיה התא (עד 2.5 mL של 1 x 10⁷ תאים סרטניים) על העמודה. לאסוף זרימה-דרך כי יהיה מועשר בתאי הגידול האנושיים.
   13. שטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ ל של 2% FBS במאגר PBS.
       הערה: חשוב לבצע שטיפת שלבים ברגע שהעמודה ריקה. כמו כן, נסה להימנע מיצירת בועות אוויר.
2. מחלק את הנפח המתאים של השעיית התא לצינור 1.5 mL עבור התרבות הרצויה להגדיר (שולחן 3).
3. צנטריפוגה את שפופרת 1.5 mL ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
4. הסר והשמט בזהירות את הסופרנטאנט.

2. עיבוד של רקמות החולה העיקרי הסרטן

הערה: זהו צעד התחלתי עבור מוסד אורגנואיד.

1. בצע את כל שלב 1 למעט את התהליך המחסור של תא העכבר, אשר אינו נחוץ לעיבוד רקמות הגידול העיקרי של המטופל.

3. יצירת כיפה עגולה צמודה על הצלחת

הערה: כתב יד זה מתאר שלוש דרכים ליצור כיפה מתערובת של הגלולה התא ואת קרום המרתף (למשל, מטריצות) כפי שמוצג באיור 1 ואיור 2. בשלבים 2-4, את התאים ואת קרום המרתף יש לשמור על הקרח כדי למנוע מיצוק של קרום המרתף.

1. השהה מחדש את הגלולה בתא בנפח המתאים של קרום המרתף (g., 40 μL) עבור צלחת 24 להגדיר למעלה (שולחן 3).
2. פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לוודא שהתאים מושעים מחדש היטב בקרום המרתף.
3. פיפטה את הכרך המתאים (שולחן 3) של תערובת קרום התא מרתף (ו אופציונלי 10 μl של המדיה המלאה) לתוך מרכז של לוחית טרום העור רקמות רקמה.
4. להפוך את הצלחת ומיד למקם את הצלחת הפוך בחממה₂ התרבות תאים להגדיר ב 5% co₂, 37 ° c עבור 15 דקות. זה מונע מתאים להתיישב ולדבוק לוחית התחתונה תוך התרת קרום המרתף כדי לגבש.
5. פיפטה את הכרך המתאים (שולחן 3) של מדיום מחומם מראש המכיל 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון לתוך כל באר.
6. מניחים את הצלחת בצד ימין בתוך חממה₂ התרבות תאים (5% co₂, 37 ° c).
7. . להחליף את התקשורת כל 3-4 יום לאחר 5-7 ימים, השתמש במדיום תרבות ללא 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון כדי לשמור על התרבויות.

4. יצירת כיפה צפה מכיפה עגולה צמודה על הצלחת

1. לאחר שלב 3.7, לנתק את הכיפה באמצעות מגרד התא.

5. יוצרים חרוזים צף

הערה: פרוטוקול זה נקרא חרוזים צף מאז התערובת של קרום המרתף, מדיה, ו אורגנואידים נראים כמו חרוזים.

1. חותכים 2 אינץ ' x 4 אינץ פיסת הסרט פרפין.
2. מניחים את הסרט פרפין על החלק העליון של גושים של מתלה החזקת הקצה ריק מ-1000 μl צנרת פלסטיק מתוך תיבת טיפ.
3. בעדינות ללחוץ על הסרט פרפין כדי לעקוב אחר גושים באמצעות האצבע באמצעות המדד כפפה, אבל בלי לפרוץ את הסרט פרפין.
4. רסס את הסרט פרפין עם 70% אתנול ולהפעיל את מנורת UV במכסה התרבות התא כדי לעקר את הסרט פרפין מוכן לפחות 30 דקות.
5. להכין תערובת של תאים 20 μL של קרום המרתף. צפיפות הזריעה יכולה להיות 50,000-250,000 תאים לכל כיפה.
6. פיפטה את התערובת של תאים מעובד משלב 1 או 2, ו 20 μl של קרום המרתף לתוך התבנית של דיבוט נוצר בסרט פרפין מוכן.
7. השהה מחדש את הגלולה התא בקרום המרתף ואת הצינורות ההשעיה התא בתוך הכנת הפרפין שצולמו divots.
8. מניחים את החרוזים המוצק ואת הסרט פרפין לצלחת 6-היטב. אחד טוב בצלחת 6-היטב יכול להכיל עד 5 חרוזים.
9. פיפטה 3-5 mL של מדיום טרום מחומם המכיל 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון לתוך כל טוב תוך צחצוח בעדינות חרוזים מתוך הסרט פרפין.
   הערה: כאמצעי אחסון מינימלי, מומלץ לעשות שלושה מ"ל. עבור מספר מירבי של חרוזים (N = 5) לבאר, 5 מ ל בינוני מומלץ.
10. מניחים את הצלחת בתוך אינקובטור CO₂ (5% co₂, 37 ° c).
11. שנה את המדיה של האורגנואיד כל 3-4 ימים. לאחר 5-7 ימים, השתמש במדיום תרבות ללא 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון כדי לשמור על התרבויות.

6. בתפרים תמונה vivo אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ⁸

הערה: מיקרוסקופים מסוימים אינם יכולים להגיע להיקף החיצוני של לוחית התא (קיר קצה); לכן, אנו מציעים באמצעות הבארות קרוב היקף לוחית הטלפון כאשר התמונה תפרים.

1. מניחים את צלחת תרבות התא בתנוחה כלפי מעלה לתוך מחזיק הצלחת במיקרוסקופ Keyence.
2. מניחים את העדשה על מרכז כיפת היעד.
3. הגדר את תהליך התפירה האוטומטי על-ידי בחירת מספר המסגרות. לדוגמאות, 3 x 3 או 5 x 5 ניתן לבחור כדי ליצור 9 תמונות או 25 סך כל התמונות.
4. לחץ על לחצן הלכידה כדי ליזום תהליך הדמיה.
5. פתח את תוכנת מציג התמונות וטען קבוצה של תמונות שצולמו בשלב 4.
6. לחץ על תפירת תמונות כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה בתפירה.
   הערה: ניתן לבצע לכידה של 9 או 25 תמונות טוריות באמצעות הגדרת ידנית או אוטומטית כדי למקד את התאים.

7. עיבוד אורגנואיד עבור היסטולוגיה: שיטת הספין למטה

הערה: פרוטוקול זה מותאם מפרסום קודם על ידי ולכוגיאניס ואח '⁷. הוספנו צעד מעורב agarose הטבעה כדי להטביע בהצלחה את כל האוכלוסיות של אורגנואידים.

1. הסר את המדיה הקיימת מתוך הבאר. להיזהר לא לאכול את הכיפות קרום המרתף.
2. הוסף שווה (שווה לאמצעי האחסון של המדיה שהוסרו משלב 1) של פתרון שחזור התאים והדגירה עבור 60 דקות ב-4 ° c.
3. לחסל את כיפת קרום המרתף באמצעות פיפטה ולמחוץ את הכיפה קרום המרתף באמצעות טיפ pipet. לאסוף את כיפת הנתק ואת פתרון שחזור התא בצינור 1.5 mL.
4. צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
5. הסר את הסופרנטנט (פתרון שחזור תאים). שמור את כל הסופרנטנים בצינורות נפרדים עד הסוף כאשר הנוכחות של האורגנואידים מאושר בשלב הפלטינג הסופי.
6. הוסף את אמצעי האחסון הרצוי (שולחן 3) של PBS קר ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להפריע מכנית גלולה.
7. צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
8. הסר את הסופרנטנט (PBS).
9. לתקן את הגלולה בכרך בהתאמה (למשל, 500 μL עבור גלולה אחת מ 24 מצב התרבות צלחת הבאר, שולחן 3) של 4% התחתית עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.
10. בעקבות קיבעון, צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
11. הסר את הסופרנטנט (בליגת העל).
12. לשטוף עם נפח מתאימים (למשל, 500 μL עבור גלולה אחת מ 24 מצב התרבות צלחת הבאר, שולחן 3) של PBS ו צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
13. הכינו מעלה חם (2% צמח ב-PBS).
    הערה: כאן, כדורי תא עבור מקטעים קפואים יכול להיות מחדש ישירות מושעה ב 200 μL של מתחם OCT ללא שלבים נוספים בפרוטוקול 7.
14. להשעות מחדש את הגלולה תא ב 200 μL של agarose (2% ב PBS).
    1. מיד לאחר הוספת agarose, לנתק בעדינות את הגלולה התא מהקיר של שפופרת 1.5 mL באמצעות מחט 25 גרם מוצמד 1 מזרק mL. כפי שמוצג באיור 3, אם הגלולה תא אינה מנותקת פיזית מהקיר של שפופרת 1.5 mL, אז יש סיכון לאבד את כל או חלק של הגלולה התא במהלך תהליך הטבעה agarose.
15. חכה עד ששני% האחוזים בערוץ הPBS. יהיה מתחזק לגמרי
16. נתק את הבלוק המתחזק מצינור 1.5 mL באמצעות מחט של 25 גרם המצורפת מזרק 1 mL.
17. להעביר את הבלוק agarose הפרטי המכיל את הגלולה התא לצינור 1.5 mL חדש.
18. ממלאים את הצינור עם 70% אטוח ולהמשיך הלאה באמצעות פרוטוקול קונבנציונאלי להתייבשות רקמות ו פרפין הטבעה.

8. היסטולוגיה ומאימונולואוציטוכימיה (IFC) של אורגנואידים

1. בחר את השקופיות עבור היסטולוגיה או IFC.
2. לפני שתחיל את תהליך ההכתמים, גלה היכן התאים ממוקמים בשקופית וצייר עיגול סביב התאים בשקופית באמצעות סמן.
3. צייר את המערכת סביב הקצה או הגבול של השקופית וכאשר עיגולים ממוקמים בשקופית במחברת מעבדה כדי לתעד את מיקומם.
4. בצע כתמים רצויים.
   הערה: במהלך תהליך זה, מסומנים עיגולים נעלמים מאז הבורא הרגיל אינו חסין לכימיקלים. אפילו כמה סמנים קבועים היסטולוגיה ניתן למחוק במהלך תהליך הצביעת.
5. לאחר תהליך הצביעת, הצב את השקופית על הציור במחברת המעבדה כדי לאתר את מיקומי התאים בשקופית.

אורגנואידים 3d הוקמו בהצלחה מן החולה נגזר מבע (pdx) מודל של סרטן הערמונית גרורתי העצם (bmpc), כמו גם ישירות מרקמת סרטן הערמונית גרורתית העצם (איור 4). בקצרה, מודלים pdx שלנו של bmpc הוקמו על ידי פנים הירך (IF) הזרקה של תאים סרטניים לתוך Rag2 זכר-/- c-/- עכברים ולאחר מכן הגידולים pdx נקצרו ועובדו כמתואר בכתב יד זה. כפי שמוצג באיור 4, ברקמות הגידול pdx מן הסדרה pcsd הביא אורגנואידים 3d עם פנוטיפים דיפרנציאלי כי התבטא כמו ציסטות, spheroids ומורכבות גבוהה יותר אורגנואידים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה.

תמונה תפור מ 25 תמונות ברזולוציה גבוהה 10x הגדלת הראה כיפת שלמה של קרום המרתף ואורגנואידים (איור 5). באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, לאחד יש את האפשרות למיין את התאים או אשכולות התא כי הם גדולים יותר מגודל מסוים או לבחור ידנית spheroids או ציסטות.

השלבים עבור הטבעה של התרבויות האורגנואיד והטיפים כדי לתייג את המיקום של אורגנואידים מנות בשקופית להגדיל את ההצלחה של ביצוע IFC על האורגנואידים במיוחד כאשר דגימות של האורגנואידים יש צפיפות תא נמוכה יותר מאשר הרצוי. איור 6 מראה דוגמה של IFC על מקטע פרפין בעובי של 5 יקרומטר של מיקוד של אורגנואידים המיקוד 5 (CK5, תא האפיתל בסיס הסמן), ציטוקרטין 8 (CK8, מסמן תא אפיתל לומיאל) ו dapi.

איור 1: הקמת ואפיון של אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם ברקמות הסרטן החולה או החולה הנגזר מבע (pdx) רקמות הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מתודולוגיות ליצירת תערובת של כדורי תא וקרום מרתף. כיפה צמודה (א), כיפה צפה (ב) וחרוזים צפים (c). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צעד מפתח עבור הטבעה מוצלחת של agarose. תהליך לנתק את הגלולה תא מהקיר של צינור 1.5 mL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פנוטיפים הדיפרנציאלי של אורגנואידים מסדרה של גידולים PCSD PDX, הכולל תאים בודדים, ציסטות, spheroids ומורכבות יותר אורגנואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: דוגמה לתמונה בעלת התפר הגולמי מסכום כולל של 25 תמונות ברזולוציה גבוהה ויישומו עבור ניתוח מעקב כדי לספור את מספר התאים או למדוד את האזור של תאים/אשכולות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: התמונה המציגה CK5 ו CK8 IFC מוכתם PCSD1 אורגנואידים (5 יקרומטר עובי של פרפין בסעיף). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הוספה/F12 +/+/+ הכנה. הטבלה הזאת פורסמה בעבר על ידי דרוסט ואח '5.

טבלה 2: רכיבים עבור מדיית האדם C/S + 10% FBS. הטבלה הזאת פורסמה בעבר על ידי דרוסט ואח '5.

שולחן 3: זריעת צפיפות, נפח מרתף האחסון, נפח בינוני הדרושים עבור כיפת אחד. טבלה זו משתנה מפרסום קודם על-ידי Drost et al.5.

המלון הינו עורכי האורח של אוסף שיטות יופיטר.