Method Article

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

DOI:

10.3791/60378

⸱

November 16th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Technology, UiT The Arctic University of Norway, 2Vascular Biology Research Group, Department of Medical Biology, UiT The Arctic University of Norway

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סה כ השתקפות פנימית השתקפויות (TIRF) משמש בדרך כלל מיקרוסקופ יחיד מבוסס לוקליזציה ברזולוציה סופר מיקרוסקופית כפי שהיא מעניקה ניגודיות משופרת עקב הפרדה אופטית. הגישה המקובלת היא להשתמש במיקרוסקופ מספריים גבוהה הצמצם יעדי TIRF עבור עירור ואיסוף, באופן חמור להגביל את שדה התצוגה ואת התפוקה. אנו מציגים גישה מקורית ליצירת עירור TIRF להדמיה עם מדריכי גל אופטיים, המכונים ננוסקופיה המבוססת על שבב. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד הדמיה מבוססת שבב מבוצעת בכיוונון שנבנה כבר. היתרון העיקרי של הננו-מבוססי שבב הוא כי את הריגוש ואת מסלולים אוסף הם ופרדים. הדמיה לאחר מכן ניתן לעשות עם עדשת הגדלה נמוכה, וכתוצאה מכך שדה גדול של תצוגת תמונות TIRF, במחיר של ירידה קטנה ברזולוציה. Sinusoidal הכבד תאים אנדותל (LSECs) היו תמונות באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטית (dסערה), מראה רזולוציה המקבילה מיקרוסקופ סופר ברזולוציה מסורתית. בנוסף, אנו מדגימים את היכולות תפוקה גבוהה על ידי דימות 500 יקרומטר x 500 יקרומטר אזור עם עדשת הגדלה נמוכה, מתן רזולוציה של 76 nm. באמצעות האופי הקומפקטי שלה, הדמיה מבוססי שבב יכול להיות מצויד בתוך מיקרוסקופ הנפוץ ביותר והוא יכול להיות משולב עם טכניקות אופטיות אחרות של שבב, כגון חישת שבב, ספקטרוסקופיה, השמנה אופטית, וכו '. הטכניקה היא אפוא מתאים באופן אידיאלי להדמיה גבוהה 2D ברזולוציה סופר, אבל גם מציע הזדמנויות נהדרות עבור ניתוח רב מודאלי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז ההפגנה הראשונית של מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת, וריאציות רבות פותחו כדי לפתור אתגרים שונים1,2,3. אתגר אחד שנשאר, עם זאת, הוא שדה גדול של תצוגת dSTORM הדמיה. רבים הגדרות הסערה dלהשתמש בעדשה אובייקטיבית זהה הן להלהיב את המדגם לדמות אותו. על מנת להגדיל את שדה הראייה, יש צורך בעדשת הגדלה נמוכה. הגדלה נמוכה וצמצם מספרי נמוך (NA) עדשות אובייקטיבי בדרך כלל יש עומק גדול של השדה, וכתוצאה מכך אות מחוץ למטוס שיפחית את דיוק הלוקליזציה. יעדי TIRF משמשים בדרך כלל כדי להגדיל את ניגוד התמונה על-ידי הפחתת הזריחה מהמטוס. דרך TIRF, עירור מוגבל עובי אופטי של כ 150 ננומטר מהמשטח באמצעות שדה אוונסי4. עדשות האובייקטיבי tirf דורשים NA גדול וכתוצאה מכך שדה קטן של תצוגה (fov) (g., 50 x 50 יקרומטר2), אשר מגביל את התפוקה באופן משמעותי. עם זאת, ישנן דרכים חלופיות. ליצירת שדה אוונ,

מדריך גל אופטי הוא מבנה אשר להגביל ולהנחות אור אם הוא מצמידים לתוך המבנה. בדרך כלל, מדריכי גל משמשים בתקשורת מבוססת סיבים. נעשה מאמץ גדול כדי לפתח מדריכי גל משולבים דו-ממדית כמרכיב העיקרי של מעגלים משולבים פוטוני. הטכנולוגיה התקדמה לנקודה שבה בדיית מדריכי-גל אופטיים בעלי הפסד נמוך מובנים ננו ניתן לעשות באופן שגרתי5. כיום, ניתן להשתמש בכמה המייסדים ברחבי העולם כדי לפתח מעגלים משולבים פוטוני. מדריכי גל מדריך אור באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת גם מציג שדה אוונקו על פני השטח. באמצעות עיצוב קפדני של מבנה מדריך גל, עוצמה גבוהה ניתן להשיג בשדה אוונקו. מדגם הממוקם ישירות על גבי משטח מדריך גל יכול להיות גם מואר על ידי שדה אוונקו עבור יישומי דימות. שדה האוונקו יופק לאורך כל אורכו ורוחבו של מדריך גל, ולכן ניתן לעשות זאת באופן שרירותי וגדול6.

אנו מציגים גישה מקורית לסופת TIRF dהמציעה שדה ראייה גדול באופן שרירותי. במקום להשתמש בעדשת TIRF לעירור ולאיסוף, אנו מלהיבות את השימוש בשדה האוונסי מכיוון מדריכי גל אופטיים. זה decouples את הריגוש ואת מסלול אור האוסף, המאפשר חופש מוחלט לאורך הנתיב אור האוסף מבלי להתפשר על האבטחה האופטית של אורך גל נתון שסופקו על ידי התאורה מדריך גל ההארה. עדשות הגדלה נמוכה יכול ובכך לשמש התמונה אזורים גדולים מאוד במצב TIRF, למרות NA קטן יותר תפחית את הרזולוציה לרוחב. יתר על כן, הדמיה ססגוניות הוא גם מאוד פשוט מאוד באמצעות מדריכי גל7, כמו כמה אורכי גל יכול להיות מונחה ומזוהה מבלי לקרוא את המערכת. זהו יתרון עבור הסערה d, כמו אורכי גל נמוך ניתן להשתמש כדי לשפר fluorophore מהבהב עבור הדמיה ססגוניות. ראוי לציין כי עומק החדירה של שדה האוונ, ישתנה כפונקציה של אורך הגל, למרות שהוא אינו משפיע על אופן הביצוע של הליך ההדמיה. השבב תואם הדמיה תא חי8 והוא אידיאלי עבור יישומים כגון שילוב של microfluidics מיקרופלואידיקה. כל שבב יכול להכיל עשרות מדריכי גל, אשר יכול לאפשר למשתמש לדמות בתנאים שונים או להחיל השמנה אופטית9 ו ספקטרוסקופיית מראמאן10.

המערכת המבוססת על שבב פועלת היטב גם עבור הדמיה מוגבלת וברזולוציה סופר באופן שווה. גישה דומה הוצגה בשנת 2005 באמצעות מנסרה כדי ליצור את עירור השדה האוונבי4. השבב הפוטוני מלהיב גם באמצעות שדה אוונטון, אבל עם טכניקות מודרניות לייצור גל, ניתן ליצור דוגמאות אור אקזוטיות עם מדריכי גל. היישום הננו מבוסס שבב הנוכחי מוגבל הדמיה 2D בלבד, כמו שדה עירור נעול בתוך משטח המדריך גל. פיתוח עתידי יכוון ליישומים תלת-ממדיים. בנוסף, טכניקות ברזולוציה סופר אחרות כגון מיקרוסקופ תאורה מובנה מפותחים באמצעות אותו מיקרוסקופ שבב מבוסס על-ידי שבבים11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת שכבת פולידימתיל (PDMS)

  1. הכינו שילוב 10:1 של סילגארד 184 מונומר ומרפא סוכן.
  2. הניחו את התערובת בחדר ואקום עד שבועות האוויר יעלמו.
  3. יוצקים 1.7 g של תערובת PDMS במרכז של 3.5 אינץ ' (קוטר) צלחת פטרי.
  4. מניחים את צלחת פטרי על שואב ואקום של מסתובב ספין.
  5. ספין מעיל צלחת פטרי עבור 20 s ב 900 סל ד, עם האצה של 75 rpm/s.
  6. מרפאת את הצלחת על פלטה ב 50 ° c לפחות 2 h.

2. הכנה לדוגמא

  1. מדריך גל לניקוי
    1. הכינו 100 מ ל של 1% דילול של תרכיז ניקוי כביסה (טבלת חומרים) במים מפוהים (DI).
    2. מניחים את השבב בצלחת פטרי מזכוכית באמצעות טוויצר וופל ומכסים לחלוטין את התמיסה עם חומרי הניקוי.
    3. מניחים את צלחת פטרי על צלחת חמה ב 70 ° c עבור 10 דקות.
    4. בזמן שהוא עדיין על הצלחת החם, לשפשף את פני השטח עם ספוגית רקמות חדר נקי.
    5. הסר את השבב מהצלחת פטרי. לשטוף עם לפחות 100 mL של מים DI.
    6. לשטוף עם לפחות 100 mL של איזופנול, לטפל כי ממס אינו יבש על פני השטח כדי למנוע כתמי אידוי.
    7. לשטוף עם לפחות 100 mL של מים DI. . לפוצץ את השבב עם אקדח חנקן
  2. הכנה קאמרית
    1. הכינו שכבה של 150 יקרומטר polydiמתיל siloxane (pdms) בצלחת פטרי (סעיף 1).
    2. השתמש באזמל כדי לחתוך מסגרת 1.5 ס"מ x 1.5 ס מ משכבת PDMS.
    3. הרם את המסגרת מצלחת פטרי עם טוויצר. הפקיד את הדירה בשבב נקי ומצוחצח. הדגימה מוכנה כעת. לזריעת תאים
  3. תיוג פלורסנט
    1. הכינו את הכימיקלים הבאים: תמיסת מלח באגירה של פוספט, תמיסתצבע (s), מאגר הדמיה של הסופה.
    2. לאחר זריעת תאים, הסר את השבב מהמדיה.
    3. השתמש בפיפטה כדי להסיר כל נוזל עודף מחוץ לחדר PDMS.
    4. להסיר את הנוזל הנוכחי מתוך החדר PDMS עם פיפטה תוך הוספת כ 60 μL של הPBS נקי באותו זמן.
      הערה: הסכום שיתווסף לחדר יהיה חייב להשתנות בהתאם לגודל החדר. היזהר שלא להסיר את כל המדיה ממשטח התא.
    5. החלף את ה-PBS עם 60 μL של הערוץ הנקי ולתת לו לעבור במשך 1 דקות.
    6. חזור על הצעד הקודם, ולתת לו לדגירה 5 דקות הפעם.
    7. הסר את ה-PBS והחלף אותו ב-60 μL של פתרון הצבע. השאירו את הדגימה לדגירה במשך 15 דקות, הגנה אותו מפני האור.
      הערה: ייתכן ששלב זה ישתנה באופן משמעותי, בהתאם לצבע הפלורסנט שבשימוש. כדי לתייג את קרום התא לניסוי הזה
    8. לשטוף את המדגם עם PBS כמו בשלבים 2.3.3-2.3.5.
    9. הסר את ה-PBS והחלף אותו ב-40 μL של מאגר ההדמיה בו.
      הערה: קיימים מספר מאגרי דימות שונים עבור צבעי פלורסנט שונים.
    10. מניחים שמיכות למעלה, מונע בועות אוויר להרכיב מתחת. לחץ בעדינות על הכיסויים נגד חדר ההדמיה כדי להסיר מדיה עודפת כלשהי.
    11. השתמש בפיפטה כדי להסיר. את כל המדיה העודפת מחוץ למסווה לנקות את האזור מחוץ coverslip עם משטח לח מים כדי למנוע גבישים שנוצרו על ידי שאריות מדיה טבילה מיובשים.

3. הליך הדמיה

  1. הגדרת רכיב
    הערה: גרסה זו של הכיוונון מורכבת משלושה מרכיבים עיקריים: המיקרוסקופ, שלב הצימוד והשלב המדגם. ראה את רשימת החומרים.
    1. השתמש במיקרוסקופ עם בעל מסנן, אור לבן מקור, מצלמה, ואת האקדח האובייקטיבי.
    2. השתמש בשלב צימוד שלושה צירים עם לייזר בשילוב סיבים ועדשת צימוד.
    3. השתמש בשלב לדוגמה ידנית של ציר אחד עם טיפ והטיה ומחזיק ואקום.
    4. הצמד את הצימוד וגם את השלב לדוגמה בשלב 2-ציר ממונע עבור תרגום לדוגמה.
  2. מצמד מדריך גל
    1. מניחים את השבב על צ'אק ואקום עם פן צימוד לכיוון היעד צימוד. ודא שהשבב נמצא במרחק של אורך מוקד אחד בקירוב ממטרת הצימוד.
    2. . תדליק את משאבת הוואקום
    3. הפעל את הלייזר ל-1 mW. כוונן בערך את גובה השבב כך שהקרן תפגע בקצהו. . תכבה את הלייזר
    4. . תדליק את מקור האור הלבן בחר בעדשת יעד בהגדלה נמוכה (לדוגמה 10x). למקד את המיקרוסקופ על מדריך גל.
    5. תרגם את המיקרוסקופ לאורך מדריך גל כדי לראות אם הוא מיושר היטב עם הנתיב האופטי. הזיזו את המיקרוסקופ לקצה הצימוד.
    6. הפעל את הלייזר ב-1 mW או פחות. תרגם את המיקרוסקופ לאורך הקצה צימוד למצוא את אור הלייזר. . למקד את הקרן על קצה השבב
    7. כוונן את שלב הצימוד לאורך הנתיב האופטי בכיוון המפחית את גודל נקודת האור של הלייזר עד שהוא ייעלם. הקרן עכשיו מעל או מתחת. למשטח השבב
    8. התאימו את גובה שלב הצימוד עד שנקודת האור מופיעה שוב ומוגדלת.
    9. חזור על שני השלבים הקודמים עד שלייזר יוצר נקודה ממוקדת.
    10. הזיזו את המקום הממוקד למדריך העניין.
    11. תרגם את המיקרוסקופ במרחק קצר מהקצה, כך שנקודת הקרן המתמקדת אינה גלויה עוד. . כבה את האור הלבן
    12. כוונן את הניגודיות. אם מדריך גל מנחה, האור הפזורים לאורך מדריך גל צריך להיות גלוי בבירור.
    13. כוונן את צירי שלב הצימוד כדי למקסם את עוצמת האור המתפזרת. . תכבה את הלייזר
    14. . תדליק את האור הלבן התאימו את הניגוד במידת הצורך.
    15. נווט לאזור הדימות.
  3. הדמיה מוגבלת של עקיפה
    1. התמקד במטרת ההדמיה הרצויה. . תכבה את האור הלבן
    2. הכנס את מסנן הזריחה והפעל את כוח הלייזר ל-1 mW.
    3. הגדר את זמן חשיפת המצלמה כ-100 ms. כוונן את הניגודיות לפי הצורך. ודא כי הצימוד עדיין ממוטב.
    4. אתר אזור מעניין לדימות. הפעל לולאה של הבמה piezo למצב ממוצע החוצה.
      הערה: טווח סריקה של 20 יקרומטר עם גודל שלב של 50 ננומטר מתאים לרוב מבני מדריך גל.
    5. לכידת לפחות 300 תמונות.
    6. טען את ערימת התמונות שנלכדה לפיג באמצעות מחסנית וירטואלית. מתפריט התמונה בפיג, בחרו ' ערימות ' ו'פרוייקט z'.
    7. חישוב התמונה TIRF על-ידי בחירה בעוצמה ממוצעתשל סוג הקרנה.
  4. ד הדמיית סערות
    1. הפעל את הלייזר ל-1 mW וקבע את זמן חשיפת המצלמה ל-30 אלפיות הראשונה.
    2. כוונן את הניגודיות והמיקוד.
    3. להגדיל את כוח הלייזר עד להבהב הוא נצפתה.
      הערה: ייתכן שפעולה זו עשויה להימשך זמן מה, בהתאם לעוצמת שדה האוונ,.
    4. התקרבות לאזור קטן בדוגמה.
    5. כוונן את הניגודיות.
    6. לכוד כמה תמונות כדי לראות אם הבהובים מופרדים היטב.
    7. כוונן את זמן חשיפת המצלמה להבהוב האופטימלי.
      הערה: מיטוב מהבהב היא משימה מורכבת, אבל הרבה ספרות מתאימה זמין12.
    8. הפעל את הלולאה בשלב הפיזו.
    9. הקלט מחסנית תמונה של לפחות 30,000 מסגרות, בהתאם לדחיסות המהבהב.
  5. ד שחזור תמונת סופה
    1. פתח את פיג'י וטען את מחסנית הסערה dכתמונות וירטואליות.
    2. כוונן את הניגודיות, במידת הצורך.
    3. השתמש בכלי המלבן כדי לבחור את האזור לשחזור.
    4. פתיחת ניתוח הפעלה בסופת רעמים13 תוסף בפיג.
    5. קבעו את הגדרות המצלמה הבסיסיות במטרים המתאימים למכשיר. פרמטרי ברירת המחדל הנותרים הם בדרך כלל משביע רצון.
    6. . התחל בשחזור
      הערה: עבור שדה התצוגה המלא, ייתכן שיהיה צורך לחלק את הנתונים בערימות משנה, עקב גודל הקובץ הגדול.
    7. סנן את רשימת הלוקליזציה שסופקה על-ידי תוכנת השחזור כדי להסיר לוקליזציה לא ספציפית. אפל תיקון הסחף נוסף אם יש צורך בכך.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ TIRF היא טכניקה פופולרית כפי שהיא מסירה החוצה של מטוס פלואורסצנטית, מגביר את הניגודיות ובכך משפר את איכות התמונה, והוא פחות פוטוטוקסילעומת אחרים מבוססי קרינה מיקרוסקופית טכניקות. בהשוואה לגישה המסורתית מבוססת המטרה, שבב מבוסס מיקרוסקופ מציע עירור TIRF ללא תפוקה מוגבלת המלווה בדרך כלל עם עדשת TIRF. סקירה של הכיוונון המוצג ניתן למצוא באיור 1א. אנו מציגים עקיפה מוגבלת, כמו גם הסערה dתמונות של תאים sinusoidal אנדותל כבד (lsec) שחולצו מעכברים. שדה גדול של תמונת השקפה של LSECs עם הmicrotubulin המסומנת גם מוצג, הוכחת את היכולות של הדמיה תפוקה גבוהה. ההתקנה קונבנציונאלי dסערה באמצעות שמן טבילה tirf עדשה (או 60x או 100x ההגדלה) בדרך כלל תמונות באזור של 50 יקרומטר x 50 יקרומטר, אשר 100 פעמים קטן יותר מאשר התמונה מבוסס שבב באיור 2, התמונות עם 25x, 0.8 היעד NA.

בשיטה זו, אנו משתמשים מרובי מוסיביות Si3N4 מדריכי גל עבור עירור. שבבי מנוצל מורכב רצועת-חרוט המנחה שכבה של 150 ננומטר Si3N4 הופקד על 2 יקרומטר שכבה תחמוצת של שבב סיליקון. תרשים סכימטי של השבב ניתן למצוא באיור 1ב. רוחב גל מדריך יכול להשתנות בין 200 ו 1000 μm. ניתן למצוא את פרטי הייצור במקום אחר8. באמצעות הפרעה בין מצבי הפצת האור עירור לא תהיה התפלגות עוצמה הומוגנית, אלא דפוס משתנה מרחב. איור 2A מציג תמונה עם דפוסים ברורים של מצב גלוי. תבנית הפרעה זו תשתנה בהתאם למיקום קרן הלייזר בקצה מדריך הגל. על מנת להשיג עירור הומוגנית בתמונות הסופיות, אנו משתמשים בשלב piezo כדי נדנוד לאורך ההיבט מצמידים. במהלך תהליך הדימות, מספיק וריאציה של דפוסי ההפרעות קיימים, כך שניתן יהיה להגיע לממוצע, תוך הסרת תנודות בעוצמה בתמונה. מחסנית התמונה תכלול מספר תמונות כגון באיור 2A, אם כי עם דפוסים שונים, אך כאשר ממוצעים, המחסנית תניב תמונה עם עירור הומוגנית כגון איור 2ב. גישה חלופית היא להשתמש בהחדקות מתיקות כדי להשיג רחב, מדריך גל יחיד מודגש8,14, אשר מסיר את הצורך במצב ממוצע. עם זאת, מספר מילימטרים של אורך הזמן הכרחי כדי לשמור על תנאי במצב אחד כדי להשיג רוחב מדריך 100 יקרומטר גל. מדריכים גל רב-מוכווני לעקוף את הצורך המלא לעשות ולהשאיר הגבלות על רוחב המבנה. מעבר לתבנית התאורה, מדד השבירה היעיל ביותר של המצבים מאפשר אפשרויות חסרות תקדים לקראת מיקרוסקופ תאורה מובנה מיקרוסקופיה מובנית11 ותנודות7.

הצעד הראשון בהדמיה הוא לאסוף תמונה מוגבלת עקיפה. הניסוי התוצאות בערימה של סביב 300 תמונות והתמונה הסופית מיוצר על ידי לקיחת ממוצע של המחסנית. באיור 2, אנו מציגים עקיפה מוגבלת והדמייתסופת הסערה של lsecs מתויג עם cellmask אדום עמוק באמצעות 60X, 1.2 NA מטרת טבילה מים. איור 2מראה התאורה הומוגנית נגרמת על ידי ממוצע במצב לא מספיק. חישוב ממוצע במצב מוצלח מוצג באיור 2B. איור 2ג הוא תמונת סערה dשל אותו אזור, עם האזור המסומן המוצג באיור 2ד. בתאי הכבד sinusoidal אנדותל יש נקבוביות ננו בגודל בקרום פלזמה15, אשר ניתן לראות כאן. מתאם הטבעת פורייה לניתוח סיפק רזולוציה של 46 ננומטר.

איור 3 מציג תמונה הסערה dשל 500 יקרומטר x 500 יקרומטר אזור, הדגמת יכולות תפוקה גבוהה של הטכניקה. תמונה מוגדלת של איור 3A, המתאים לשדה הסערה האופייני d-of-view, מוצג יחד עם תמונה מוגבלת עקיפה באיור 3ב. טבעת פורייה מתאם להערכת ההחלטה בוצעה, מניב ערך של 76 ננומטר.

figure-results-1
איור 1: מערכת הדמיה ומדריך גל. (א) תצלום של מערכת ההדמיה. המדגם ממוקם על צ ' אק ואקום על הבמה לדוגמה, עם פן צימוד של מדריך גל לקראת המטרה צימוד. סיבים מצמידים לייזר מטרה צימוד ממוקם על גבי הבמה piezo 3D. עדשה צריח עם עדשות הדמיה לוכדת את התמונה מלמעלה ומעביר אותו למצלמה. (ב) סכמטי של מדריך גל עם עדשות הדמיה וצימוד. הצמד העדשות אור לתוך מדריך גל. הדגימות (חרוזים כתומים) נשמרות בתוך תא PDMS אטום. שדה אוונקו לאורך מדריך גל יהיה להלהיב את המדגם ואת מטרת ההדמיה ללכוד את הזריחה הנפלטת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: עקיפה-תמונות סערה מוגבלת ו -d. (A) התמונה של תאים sinusoidal אנדותל הכבד עם ממוצע במצב מספיק, וכתוצאה מכך ברור לעין התבנית עירור. (ב) אותו אזור כמו ב (א), אך עם מצב מספיק ממוצע, והתוצאה היא עירור הומוגנית. (ג) עקיפה תמונה מוגבלת של הכניסה פנימה (ב); (D) הסערה התמונה של האזור אותו. (ה) הזחה של (ד), בבירור מראה את הפנומנות בקרום הפלזמה של התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הסערה dתמונה של החולדה lsecs. (א) שדה גדול של השקפההסערה של התמונה של אלקסה 647 מוכתם טובולין ב החולדה lsecs. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב) אזור מסומן גדול מ (א) השוואת עקיפה-מוגבלת (משמאל למטה) ו -dהסערה (למעלה מימין). (ג) אזור קטן יותר המסומן מ-(א). סרגל קנה מידה = 1 μm. התמונה יש רזולוציה של 76 ננומטר. מותאם להיתר מ-Helle et al. 20196. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה מבוססת שבב דומה הדמיית הסערה dקונבנציונאלי. איכות התמונה יכול ובכך להיות מגויח באמצעות אותן גישות כמו עבור הדמיה מסורתית הסערה d. ההבדל העיקרי בפני המשתמש הוא ששקופית הזכוכית השקופה מוחלפים באמצעות כופל בורדו. למרות שהם נראים שונים מאוד, הטיפול במדגם הוא למעשה אנלוגי לשקופית זכוכית. השבבים הם חזקים למדי והוא יכול בקלות להיות מטופלים באמצעות מלקחיים וופל. הליך ההדמיה ושחזור התמונה זהה לניסוי בסערה רגילה. הגדרת מיקרוסקופ מבוסס שבב פונקציונלי לא דורש רכיבים מיוחדים, למעט שבבי פוטוני. פרטים נוספים על הגדרת ניתן למצוא בעבודה הקודמת6,7. השבבים המשמשים בעבודה זו הפוברק באמצעות פוטוגרפיה סטנדרטית8.

הכנת הדוגמא מקיפה את הכנת חדר הדגימה. בעת חיבור מסגרת PDMS לשבב, זה חיוני כדי למנוע כל קפלי קטן או קורע איפה האוויר יכול להיכנס. אם pdms קפלי בעת הצמדת אותו, פשוט להסיר אותו בזהירות עם פינצטה ולחבר אותו. כאשר המדגם מוכן בתוך התא PDMS, הcoverglass יש ללחוץ עליו, איטום האזור. חשוב להימנע כל בועות אוויר שעשוי להיווצר בעת חיבור הcoverglass. אם נוצר בועת אוויר, להסיר בעדינות את שמיכות ולהוסיף PBS לחדר לדוגמה כדי להבטיח כי המדגם מכוסה. ההכנה וההחזקה של שובר הכיסוי יכולים פשוט להיות משופץ.

האור הצימוד לתוך מדריך הגל הוא פשוט באמצעות הפרוטוקול המוצע בנייר זה. עם זאת, ישנם כמה אתגרים נפוצים שיכולים להגביל את הצימוד. ראשית, אם השבב לא נוקה כראוי, כל שאריות PBS הוסרו לחלוטין, יכול להיות לכלוך או מגובש PBS על מדריך גל. זה יכול להציג הפסדים גדולים, וכתוצאה מכך מעט מאוד כוח באזור ההדמיה. שימוש בספוגית לח כדי לנקות את האזור מחוץ לזכוכית המכסה יכול לשפר את הכוח באופן משמעותי. שנית, אם ההיבט הצימוד של מדריך גל ניזוק (למשל, על ידי טיפול לא נאות), אובדן הצימוד יכול להגביר באופן דרסטי. בדיקה אופטית של הקצה יגלה בדרך כלל נזקים בקלות. ההיבט הצימוד כולו של השבב יכול להיות מלוטש בזהירות, בדומה סיבים אופטיים, והוא ייתן פן צימוד חלקים, אשר לאחר מכן מגביר את הכוח ביחד.

לאחר שהאור משולב, הליך ההדמיה זהה לכל הגדרות הסערותהרגילות. אם התמונה היא בעלת עירור הומוגניות, כפי שמתואר באיור 2A, סביר להניח שהמצב בממוצע לא עבד היטב. שתי הסיבות השכיחות ביותר לכך הן: 1) מעט מדי תמונות שנתפסו כדי ליצור מחסנית ממוצעת 2) קצר מדי של מרחק תנודה/גדול מדי של גודל השלב. איסוף מעט מדי תמונות יכול להשאיר כמה דפוסי עירור והממוצע יהיה ובכך להיות הומוגנית. ניתן לפתור זאת בקלות על-ידי הגדלת מספר התמונות במחסנית הממוצעת. קצר מדי של מרחק תנודות יכול גם לגרום לתמונה לא הומוגנית, כמו לא מספיק דפוסי מצב מתרגשים. ניתן גם לפתור זאת בקלות על-ידי הגברת מרחק התנודה ו/או הקטנת גודל השלב. בעבודה זו השתמשנו בשלב piezo כדי לסרוק את קרן לייזר קלט מעל 20 יקרומטר ולרכוש לפחות 300 תמונות. גישה אחרת יכולה להיות להשתמש galvo מהירות גבוהה כדי לסרוק את האור על פני ההיבט מדריך גל קלט בתוך זמן הרכישה בודד, כגון 10-30 ms. אפשרות זו מתאימה ליצירת הדמיה של TIRF בשידור חי, היכן שהאורגלים הסלולאריים בתנועה מתמדת.

מבוסס שבב dסטורם מציע אזור גדול חסר תקדים tirf עירור, מה שהופך אותו אידיאלי מתאים לדימות תפוקה גבוהה. הדמות הקומפקטית מאפשרת התאמה למערכות מסחריות, שם ניתן למקם את השבב למטה עבור הגדרות הפוך או מצעים שקופים ניתן לפתח. האסימונים הם מפוברק המוניים ניתן לשנות כדי להתאים לצרכים רבים. כיום, ההגבלה העיקרית היא שהוא מוגבל ל-2D. שדה אוונקו זמין רק כ 200 ננומטר הרחק משטח המדריך גל, אז רק fluorophores בתוך אזור זה יהיה נרגש. לגמרי, תחום האופטיקה המשולבת מציע הזדמנויות רבות עבור מיקרוסקופ מבוסס שבב בעתיד הקרוב, על ידי התמודדות עם שאלות הדמיה חדשות, כמו גם מתן אפשרויות חדשות הקיימות.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסיס הרפואה החלה עבור 1606268.9 בזיכרון הפטנטים עבור ננוסקופיה אופטית מבוססת שבב. המחברים האחרים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מתבקשים להכיר במועצת המחקר האירופאית (למענק מס ' 336716 לB.S.A.). המחברים גם רוצה להודות Irati Lagfragua על הסיוע שלה יסולא בפז עם הקלטה ועריכה של וידאו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שלב דגימה 1 צירStanda7T173-20
שלב תרגום דוגמאות דו-ציריMad City Labsהזמנה מותאמת אישית
שלב NanoMax 3 ציריםThorlabsMAX311D
גוף מיקרוסקופ BXFMאולימפוסOLY-LSM-037018
CellMask אדום עמוק, טכנולוגיות חייםThermoFisherC10046
ספוגיות כיתה לחדר נקיMRC TechnologyMFS-758
לייזר מצמד סיביםפלמנקו
תוצרת בית
Hellmanex III, Hellma GmbhSigma-AldrichZ805939ניקוי תרכיז חומר ניקוי
איזופרופנולסיגמא-אולדריץ'563935-1L
KL 1600 LEDאולימפוסOLY-LSM-E0433314
עדשת צימוד אולימפוסאולימפוסLMPLFLN 50x/0.5
Orca פלאש 4.0 V2טבליות PBS
'P4417-50TABמיקס לפי תיאורים
SYLGARD 184 סיליקון אלסטומר 1.1 ק"ג ערכתDow1673921
Tip-tilt stageThorlabsAPR001
מחזיק ואקוםThorlabsHWV001
פינצטה רקיק מסוג 2WAgar AGT5051
מחזיק מסנן סיגמא-אולדריץ מדעי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
  2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  3. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  4. Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
  5. Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
  6. Helle, ØI., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
  7. Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
  8. Tinguely, J. C., Helle, ØI., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
  9. Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
  10. Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
  11. Helle, ØI., Dullo, F. T., Lahrberg, M., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV. , https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019).
  12. Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  13. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  14. Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
  15. Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1(2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Photonic ChipTIRF MicroscopydSTORM ImagingWaveguide ExcitationHigh Throughput ImagingSuper Resolution MicroscopyLiver Sinusoidal Endothelial CellsOptical WaveguideEvanescent WavesChip Based Nanoscopy

Related Articles