הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

11.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60384

⸱

4 באוקטובר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Northwestern University, 2National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.

תקציר

רירית האדם האנושי הוא אחד הרקמות הורמונאלי ביותר בגוף והוא חיוני להקמת ההריון. רקמה זו יכולה גם להיות חולה ולגרום לתחלואה ואפילו מוות. מערכות מודל ללמוד ביולוגיה רירית הרחם האנושי הוגבלה במערכות תרבות מבחנה של סוגי תאים בודדים. בנוסף, התאים האפיתל, אחד מסוגי התא העיקריים של רירית הרחם, לא מופצים היטב או לשמור על התכונות הפיזיולוגיות שלהם בתרבות, ולכן ההבנה שלנו של ביולוגיה רירית הרחם נשאר מוגבל. יצרנו, בפעם הראשונה, אורגנואידים רירית הרחם המורכבים משני התאים האפיתל ו סטרומה של האנדורירית האנושי. אורגנואידים אלה אינם דורשים כל חומר הגרדום האקסוגני ובמיוחד לארגן כך תאים אפיתל להקיף את המבנה דמוי ספרואיד ולהיות מקוטב עם תאים סטרומה במרכז המייצרים ומפרישות קולגן. אסטרוגן, פרוגסטרון וקולטנים אנדרוגן מבוטא בתאי אפיתל, סטרומה וטיפול ברמות פיזיולוגיות של אסטרוגן וטסטוסטרון לקדם את הארגון של האורגנואידים. מערכת זו מודל חדש יכול לשמש כדי ללמוד ביולוגיה רירית הרחם נורמלי מחלות בדרכים שלא היו אפשריות לפני.

מבוא

רירית הרחם האנושי קווי החלל הרחמי ומשמש כאיש הקשר הראשון עבור העובר בזמן השרשה. רירית האנדויום מורכב של לומיאל ותאים אפיתל הבלוטות, מסטרומה, בתאי האנדותל ותאי החיסון התומכים. יחד, אלה סוגים תא להפוך את רקמת רירית הרחם שהיא אחת הרקמות התגובה ביותר כדי למין הורמונים סטרואידים1. השינויים המתרחשים בכל מחזור וסת מרשימים. הצמיחה המתאימה שיפוץ של רירית המוח נדרש כדי לאפשר השתלת העובר להתרחש. התגובה החריגה אסטרוגן ופרוגסטרון יכול לגרום לרירית הרחם עקשן כי אינו מאפשר הקמתה מוצלחת של ההריון והוא יכול גם לגרום למחלות כולל רירית הרחם neoplasia.

על מנת ללמוד את התגובות הורמון ושינויים חיוניים המתרחשים רירית הרחם, תאים מרקמות רירית הרחם מקבל מטופלים במהלך ניתוח או ביופסיה רירית הרחם הופץ בתרבות התא. תאים סטרומה רירית הרחם מעדיפים להתרבות ולהפיץ בקלות, ותהליך של בידול הנגרמת על ידי פרוגסטרון יכול להיות מסכם מבחנה. כתוצאה מכך, הרבה למדו בתהליך בידול זה, כינה את דצידוליזציה2,3. הסוג השני של התא העיקרי רירית העין, הלומיאל ותאים אפיתל הבלוטות, עם זאת, לא לגדול גם monolayers המסורתית, לאבד קוטביות, להיות הסנדק, ולאחר פוטנציאל מתרבים מוגבלת. כתוצאה מכך, פחות ידוע של הביולוגיה שלהם ואת תפקידם באנדורירית האנושי. כמו neoplasia רבים מקורם בתאי האפיתל, מנגנונים הקשורים היפרפלזיה או טרנספורמציה לתאי סרטן להישאר מוגדרים לחלוטין. יתר על כן, מחקרים הקימו כי תגובת הורמון כרוך פעולות הפרדרין אינטימי בין התאים אפיתל ו סטרומה של רירית האנדויום4,5.

לאחרונה, התרבות האורגאידית תלת-ממדית של תאים אפיתל רירית הרחם הוקמה על ידי שתי קבוצות עצמאיות6,7, שהן הדיווחים הראשונים של אורגנואידים שנוצרו רקמת רירית הרחם. האורגנואידים האלה היו מורכבים של תאים אפיתל רירית הרחם מוטבע בתוך מטריצת חלבון (הטבלה של חומרים) ולא כללה תא חשוב ורמונאלי תגובה של רירית הרחם רירית, סטרומה. כמו חלבונים מטריקס יכול להשתנות הרבה הרבה והוא יכול להפעיל מסלולים איתות כי לא בהכרח להתרחש ברקמה, זה יהיה אידיאלי כדי להחליף את החלבונים מטריקס עם רכיבים של רירית העור. במחקר הנוכחי, פרוטוקול לייצר לגרדום ללא האדם אורגנואידים רירית הרחם של תאים אפיתל ו סטרומה של האנדורירית האנושי מוצג. הנוכחות של תאים סטרומה לא רק מספק את התמיכה עבור תאים אפיתל אלא גם מספק את פעולות הפרפרין הדרושים אשר הוקמו להיות חשוביםעבור תגובה הורמון ריריתהרחם 4,8,9 .

אורגאיד החדש של רירית הרחם מציעה מערכת מודל של רירית הרחם כי הוא פשוט לייצר והמשלבת הן תאים אפיתל ו סטרומה. אורגנואידים אלה יכולים לשמש ללימוד שינויים הורמונליים לטווח ארוך ואירועים מוקדמים של מחלות כגון tumorigenesis בשל חוסר איזון הורמונלי או עלבונות אקסוגני. המורכבות של האורגנואידים האלה יכול בסופו של דבר להתרחב כדי לכלול סוגי תאים אחרים, כולל התאים אנדותל והחיסון עם תאים myometrial שפט באמת לחקות את הפיזיולוגיה של רקמת האדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות רירית הרחם נאספו מנשים טרום גיל המעבר שעברו כריתת רחם שגרתית לתנאי הרחם שפירים באוניברסיטת נורת'ווסטרן לנשים בבית החולים, על פי הלוח סקירה מוסדית מאושר פרוטוקול. הסכמה כתובה הושגה מכל הנשים הכלולות במחקר.

1. הכנת תבניות צמח

  1. לפני תחילת בידוד התא, הטלת ושיווי משקל 1.5% agarose תבניות מיקרו (לוח חומרים) לבית האורגנואידים על פי הוראות היצרן.

2. הדור של מארגני רירית הרחם

  1. בציר סטרומה ראשוני ותאי אפיתל
    1. ב הקבינט אבטחה טיחות באמצעות טכניקה אספטית, להכין פתרון אנזים (2.5 mg/ml כגון הסוג אני + 0.1 mg/ml dnase אני ב 10 מ ל של dispase [500 יחידות]) ב 37 ° c, וסטרילי לסנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק ב0.2 יקרומטר לתוך שפופרת חרוט 15 מ"ל.
    2. ב הקבינט אבטחה טיחות באמצעות טכניקה אספטי, לגרד את רירית הרחם מן הביופסיה ביופסיה ורקמות האוהב תחת כיסוי לתוך חתיכות קטנות מאוד עם אזמל.
      הערה: רקמת רירית הרחם היא לפחות 20 מ"מ x 10 מ"מ x 1 מ"מ נדרש כדי ליצור מספר מספיק של אורגנואידים.
    3. הכניסו את הרקמה הטרייה לתמיסת האנזים בצינור של 15 מ"ל. סגרו את המכסה ועטפו את החלק העליון בסרט שעווה (לוח חומרים) כדי למנוע זיהום.
    4. הניחו את הצינורית בעזרת רקמה באמבט מים או בחממה ב-37 ° c למשך 30 דקות עם טלטול עדין (80-100 סל ד).
    5. מחסנית מסננת של תא 100 יקרומטר על גבי מסננת תא באורך 20 יקרומטר בשפופרת מלאה של 50 mL. לסנן את הפתרון דרך שני בכיינים, ולאחר מכן לשטוף את 15 מ"ל שפופרת חרוטי עם 10 מ ל של פתרון מלח מאוזנת של האנק (HBSS; רשימת חומרים) ולשים את הכביסה דרך מסננת כדי להבטיח את כל התאים נאספים.
      הערה: נוזל הזרימה מכיל תאים סטרומה וכדוריות דם אדומות (~ 20 מ"ל בסך הכל). תאים אפיתל נאספים על מסננת 20 יקרומטר. גושים של רקמה לא מתעכל להישאר על גבי מסננת 100 יקרומטר. השמט רקמה לא מתעכלת. למיכל פסולת ביולוגית
    6. היפוך 20 יקרומטר תא מסננת משלב 2.1.5 אל צינור 50 mL חדש ולשטוף את התאים האפיתל מתוך מסננת עם 20 מ ל של מדיה אורגנואיד (טבלת חומרים) שיושלם עם 1% עט/דלקת.
    7. צנטריפוגה את צינורות חרוט משלבים 2.1.5 ו 2.1.6 ב 500 x g עבור 5 דקות.
    8. עם תאים מסטרומה שנאספו, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 10 מ ל של מאגר פירוק הדם האדום של תא דם.  מודלת ב 37 ° c במשך 10 עד 15 דקות. צנטריפוגה את צינור החרוט ב 500 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את הגלולה עם 200-300 μl של מדיה ארגונית (ראה שלב 2.2.2 לקבלת הוראות נוספות).
    9. עם התאים האפיתל שנאספו, להסיר את supernatant ו להשעות מחדש עם 100 μL של מדיה ארגונית (ראה שלב 2.2.2 לקבלת הוראות נוספות).
  2. זריעת תאים
    1. לאחר הטיית 1.5% בתבניות agarose בבארות (1 עובש לכל טוב) של צלחת 24-באר, להסיר מדיה ארגונית על החלק החיצוני של בתבניות agarose להטות את צלחת התרבות רקמה כך המדיום מן החדר הזורחת התא של מנות agarose יכול גם להיות הוסרו בקפידה.
    2. צפה האפיתל (משלב 2.1.9) ו סטרומה (משלב 2.1.8) שתלים סלולריים מתחת למיקרוסקופ.  הוספת מדיה אורגנואיד נוספים להשעיות האפיתל או השסטרומה של התא 100 μL בכל פעם, כך שהשעיות יהיו שוות בערך בצפיפות.
      הערה: תאים אפיתל יהיה לקבץ יחד, וזה לא מומלץ לעכל/טריסיזציה של תאים אפיתל לתוך השעיות תא יחיד.
    3. לשלב 1 חלק של תאים סטרומה עם 3 חלקים של תאים אפיתל על ידי נפח.
    4. פיפטה 50 μL (60,000 תאים) של השעיית התא המשולב לחדר הזריעה של התא של העובש האגקם.
    5. לאחר בתבניות agarose מלאים תאים, בזהירות להוסיף 400 μL של מדיה אורגאיד טרי לתוך הבאר של הצלחת 24.
      הערה: המדיום מגיע בדיוק מתחת לפני השטח של הצלחות והוא לא יגרום לתאים לרחף מתוך התבניות. לאחר 2-3 ימים, התאים יתייבו ויתחילו ליצור אורגנואידים.
    6. שנה בינונית כל יום שני עם 500 μL של מדיה ארגונית.
    7. לאחר 2-3 ימים, לשנות בינונית לאחד שיושלם עם 0.1 ננומטר אסטרדיול (E) ו 0.8 nm ננומטר (T) כדי לקדם ארגון של תאים אפיתל ו סטרומה.
      הערה: למרות הארגון של תאים אפיתל וסטרומה יכול להתרחש עם או בלי הורמונים, אורגנואידים יותר יהיה לארגן בנוכחות של הורמונים.

3. קציר אורגנואידים הרחם עבור ניסויים

הערה: לאחר הניסוי נעשה, אורגמנואידים רירית הרחם ניתן לעבד עבור היסטולוגיה או ניתוח RNA. השלבים הבאים מתארים כיצד לעבד את האורגנואידים.

  1. יסטולוגיה
    1. התמוססות 1.5% התעוררה בתמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) על ידי רתיחה. הניחו לנוזל להתקרר כ-50 ° c.
    2. תחת מיקרוסקופ מבתר, הטה את הצלחת 24-באר ופיפטה בזהירות את המדיום מחוץ לתבנית הצמח. פיפטה בזהירות את המדיום מתוך הפנים של עובש הצמח כדי למנוע שיבוש האורגנואידים.
    3. תחת מיקרוסקופ מבתר, פיפטה בזהירות 70-75 μL של חם (50 ° c) 1.5% agarose תעוררה לתוך החדר של הצלחת agarose. . תיזהרי לא להפריע לאורגנואידים
    4. תנו להתקרר ב -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    5. להוסיף 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) לתוך כל באר של 24 צלחת ולתקן את העובש האטום כולו המכיל אורגנואידים לילה ב 4 ° c. ואז לאחסן ב-70% אתנול ב 4 ° צ' עד מוכן לעיבוד פרפין.
  2. בידוד רנ א
    1. תחת מיקרוסקופ מבתר, הטה את צלחת 24 הצלחות ופיפטה בזהירות את המדיום מתוך החדר של העובש האגקם.
    2. פיפטה בכוח 1 מ ל של מדיום אורגאיד טרי ישירות לתוך העובש האגקם כך האורגנואידים הם לרוקן את המיקרוגל. להיזהר לא ליצור יותר מדי בועות.
    3. חזור על הליטוף שוב עם אותו מדיום משלב 3.2.2.
    4. לאסוף את כל המדיום המכילה את האורגנואידים. צנטריפוגה במהירות מקסימלית כדי לאסוף את האורגנואידים ולהמשיך לחילוץ RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תרשים שרטוט של הפרוטוקול מתואר באיור 1. רקמת הרחם הושגה מהניתוח לאחר שנבדק על ידי פתולוגים. רירית רירית הרחם הופרד מ myometrium על ידי גירוד ואת רקמת רירית הרחם היה מתעכל בהתאם לתאים כפי שמתואר בפרוטוקול. תאים אפיתל וסטרומה נוספו למיקרוגל בתבניות agarose. לאחר שבעה ימים בתרבות, טופלו בארגון E ו-T במשך 7-14 ימים נוספים.

לעיבוד היסטולוגית, התבניות המאובנת המכילות אורגנואידים של רירית הרחם נסגרו בעקבות הקיבעון באמצעות קיבוע של 4% בעלי לילה. תבניות אלה עובדו עבור הטבע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יצרנו אורגנואידים רירית האדם מורכב של תאים אפיתל ו סטרומה של רירית הרחם ללא שימוש בחומרים לגרדום אקסוגני. אמנם זה כבר הוכח כי תאים הראשי האפיתל רירית הרחם יכול ליצור אורגנואידים6,7, תאים אלה היו מוטבעים במטריצה ז'לטין של חלבונים שמופרשים על ידי תאי סרקומה של העכבר (ראה טבלת חומרים) כדי לעזור יצירת מבנים דמוי ספרואיד. בנוסף, תאים סטרומה רירית הרחם נעדרו. אנו משערים כי התאים סטרומה במערכת שלנו, שהיא מרכיב תומך חיוני של רקמת רירית הרחם, בתנאי הפיגום...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

מחקר זה מומן על ידי הUG3 מענק (ES029073) ובית הספר נורת'ווסטרן פיינברג לרפואה גשר של הקרן (JJK). היינו רוצים להכיר את מתקן ליבת הפתולוגיה הצפון-מערבי לעיבוד האורגנואידים הקבועים להטבעת פרפין. היינו רוצים להכיר בצוות הUG3 כולו, כולל מעבדות וודרוף, בורדט ואורנק לדיונים ושיתופי פעולה בתובנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Agarose HS, ביולוגיה מולקולרית בדרגהDenville ScientificCA3510-6
תבניות אגרוזSigma-AldrichZ764043(https://www.microtissues.com/)
אמוניום כלוריד (NH4Cl)Amresco0621
β-EstradiolSigma-AldrichE2257
קולגנאז, סוג II, אבקהThermo Fisher Scientific17101015
DispaseCorning354235
DNase ISigma-AldrichD4513
EDTAFisher ScientificBP120-1
כתם אוזיןVWR95057-848
קולטן אסטרוגן (SP1), נוגדן חד שבטי ארנבThermo Fisher ScientificRM-9101-S
Fluoroshield עם DAPI, מדיום הרכבה היסטולוגיSigma-AldrichF6057
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)Corning21-022-CV1x ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום
תמיסת כתמי המטוקסיליןThermo Fisher Scientific3530-32ניסוח האריס שונה,
תמיסת הפריןSTEMCELL Technologies07980נוסף למדיה של MammoCult
פתרון מלאי הידרוקורטיזוןSTEMCELL Technologies07925נוסף למדיה של MammoCult
מדיה אורגנואידית - MammocultSTEMCELL Technologies05620בתוספת 2 ומיקרו; L/mL הפרין ו-5 ומיקרו; L/mL הידרוקורטיזון
פרפורמלדהיד, תמיסה 16%Electron Microscopy Sciences15710
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר15140122
תמיסת מלח חוצצת פוספט, pH 7.4קולטן פרוגסטרון Sigma-AldrichP3813
PgR 1294, לא מצומד, תרבית סופרנטנטAgilent TechnologiesM356801-2
מטריצת חלבון - MatrigelBD Biosciences356231
נוגדן נגד E-cadherin עכבר מטוהרBD Biociences610181Clone 36
נוגדן אנטי-וימנטין רקומביננטי [EPR3776]Abcamab92547
ערכת ליזה ובידוד RNAZymo ResearchR2060
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS6014
טסטוסטרוןSigma-Aldrich86500
טריכרום כתםAbcamab150686
סרט שעווה - ParafilmVWR52858-000
ללא כספית ,

מקורות

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA
הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.