אנו מתארים את גישת ההדמיה לקביעת המצב oligomeric הממוצע של megfp-מתויג-קולטן מתויגים oligomeric הנגרמת על ידי ליגנד קשירה ממברנה פלזמה של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות
במאמר זה
סיכום
תקציר
למרות החשיבות והייתה של הקולטן, שיטות מעטות ישימות לגילוי אירועים באשכולות ומדידת מידת הקיבוץ. כאן, אנו מתארים גישה להדמיה כדי לקבוע את המצב oligomeric הממוצע של mEGFP-מתויג-קולטן הומוקומפלקסי בקרום של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B). N & B היא שיטה דומה ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS) והיסטוגרמה ספירת פוטון (PCH), אשר מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של fluorophores מפזרת פנימה והחוצה של תאורה אמצעי אחסון במהלך זמן התבוננות. בפרט, N & B הוא פישוט של PCH כדי להשיג מידע על המספר הממוצע של חלבונים בתערובות oligomeric. תנודות אינטנסיביות המוני מתוארים על ידי בהירות מולקולרית של fluorophore ואת המספר הממוצע של fluorophores בתוך עוצמת התאורה. כך, N & B רואה רק את הרגעים הראשונים והשני של התפלגות משרעת, כלומר, את העוצמה הממוצע ואת השונות. זה, באותו זמן, את הכוח והחולשה של השיטה. כי רק שני רגעים נחשבים, N & B לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל זה רק מעריך את מצב oligomeriטיזציה הממוצע של התערובת. עם זאת, זה יכול להיות מיושם על סדרת זמן קטן יחסית (לעומת שיטות רגע אחר) של תמונות של תאים חיים על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות הזמן של עוצמת הקרינה. זה מפחית את הזמן האפקטיבי לפיקסל לכמה מיקרו שניות, המאפשר רכישה בטווח הזמן של שניות לאלפיות השניה, אשר הכרחי עבור הקינטיקה מהירה של oligomerization. לבסוף, שטחי תאים גדולים כמו גם תאים תת סלולריים ניתן לחקור.
מבוא
אנו מתארים כולל השתקפות פנימית מספר ובהירות (TIRF-N & B) גישה להדמיה לקביעת מצב oligomeric הממוצע של מולקולות הקולטן בקרום פלזמה של תאים חיים, מכוון בקישור הרכבה הקולטן דינמיקה לתפקוד הביולוגי של החלבונים (איור 1).
עם ליגתאי ומחייב, קולטנים ליזום את האות תאיים התמרה האותות בהתאם הקונפורמציה שלהם, oligomerization, שיתוף הפוטנציאלי קולטנים והרכב קרום. למרות החשיבות והייתה של קולטן oligomerization, מוכר כאירוע מפתח באיתות סלולרי1,2,3,4,5,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה לדוגמא
- . היום הראשון זרעים הלה התאים בינוני מלא בריכוז של 100,000-200000 cell/mL במנות התחתון זכוכית. . זרע 6-8 משכפל מנות
הערה: בדוגמה זו, המדיום הוא שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל סרום שור העוברי (FBS), 1 mM נתרן פירובט, 100 U/100 μg פניצילין/סטרפטומיצין. מספר מנות שכפול מוכנות. - . היום 2-3 כאשר התאים הם בשטף משנה, מחצית מנות הכלים עם הפלסמיד החלבון והמחצית השנייה עם התייחסות פלמידים (מונומר ו dimer), במדיום ללא סרום.
הערה: החצייה מורכבת מסרום בינוני בחינם בתוספת אנטיביוטיקה, 0.1% מאגר העור של סרום והוא 25 מ"מ, ללא פנול אדום. - . היום 3-4 בדוק כי תאים מזוהמים הם מחסיד לתחתית הכלים ואת קרום התא ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות עבור שני תאים מייצגים הלה-mEGFP-FGFR1 שנזרע באותה צלחת תרבות מוצגים באיור 5 ו טבלה משלימה 1. שני התאים נלכדו בזמן 0 דקות (איור 5א, למעלה) ו -7 דקות (איור 5א, למטה) לאחר הוספת FGF2 ligand.
איור 5 גם מראה את התוצאות של שני תאי הלה מייצגים ביטוי או מונומר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
N & B דורש מספר אמצעי זהירות בבחירת דגם התא ואסטרטגיית התוויות. ניתן להחיל אותו רק על תאים חיים שנשארים ללא הפסק בזמן לכידת התמונה. תנודות נוספות בשל העקירה הנוקשה של התא כולו עשוי להיות מטופל עם גישות שחזור התמונה המתאים38. עם זאת, בדרך כלל כאשר התא זז, קרום התא גם deforms, ואת מבנה דפורמציה, הפקת שונות נוספת גדולה, מציג מגבלה רצינית ניתוח של חלבונים ממברנה. בעבודה זו, המבנה הפלורסנט מתבטא בקו התאים של הלה, משום שFGFR1 החוקתית היא זניחה. הנוכחות של חלבון קונסטיטוטיבי הוא מצב להימנע, אחרת אוכלוסיו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
CNIC נתמך על ידי משרד של Ciencia, מרכז האוניברסיטה והקרן הפרו CNIC, והוא המרכז המרכזי של אוצ'ואה מצוינות (צב-2015-0505). אנחנו גם נתמכים על ידי הקרן האירופית לפיתוח האזור (פדר) "אונה סון נרה דה האג אירופה". אוניברסיטת קליפורניה מכירה בתמיכה של האגודה לחקר הסרטן הבינלאומי (הידוע כיום כ מחקר הסרטן העולמי), ומשרד הבריאות האיטלקי. א. ש. מכירה בעמותת "פוננדאלקה דל מונטה די לומברדיה" לתמיכה חלקית בעבודתו עם מלגת PV "המקצוענים בצ" 2011-2012.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיקרוסקופ הפוך מהיר TIRF Leica AM TIRF MC בעל 3 צבעים, עם יישור TIRF אוטומטי SMI. המיקרוסקופ מצויד בלייזר דיודה 488 ננומטר, מטרת TIRF שמן 100x 1.46, מסנני פס פס Ex/Em ב-490/20 ו<-525/50, חממת טמפרטורה/CO>2 ומצלמת Andor DU 8285 VP EMCCD. המיקרוסקופ מופעל על ידי תוכנת Leica LIF. | Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה | ||
| אלבומין מסרום בקר 98% minimun | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מישיגן, ארה"ב | A7906-100G | |
| DMEM ללא פנול אדום עם 25 מ"מ hepes | gibco Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב | 21063029 | בשימוש בסרום ללא למיקרוסקופיה |
| DMEM גלוקוז גבוה GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב | 10566-016 | משמש למדיום שלם |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| מערכת פיצול פליטה פוטומטריה DV2 | TeledynePhotometrics, טוסון, אריזונה, ארה"ב | ||
| סרום בקר עוברי, מוסמך, ברזיל | GIBCO Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב | 10270106 | תוסף 10% מומת למדיום שלם |
| תחתית זכוכית 35 מ"מ סטרילית 1.5 כלים | MatTek, אשלנד, MA, ארה"ב | P35G-0.170-14-C | לא מצופה, עובי זכוכית 0.17 מיקרון |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב | ||
| קרצינומה של צוואר הרחם האנושי (HeLa), תאי רכיב מן החי (AC) ללא סרום | Millipore-Sigma ECACC, דרמשטדט, גרמניה | CB_08011102 | |
| מצלמת ANDOR iXonEM+ 897 EMCCD (עם תאורה אחורית) נשלטת על ידי תוכנת ANDOR Solis | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | מצלמה זו, המותקנת ביציאה נוספת של המיקרוסקופ, משמשת לרכישת ה-N& סדרת זמן B | |
| Matlab Executable N & שגרת B | יחידה למיקרוסקופיה והדמיה דינמית, CNIC, מדריד, ספרד | הורד ב https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| פניצילין: סטרפטומיצין לתרבית רקמות 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, ארה"ב | LONZA 17-602E | למדיום בפניצילין/סטרפטומיצין 100 U/100&g. |
| וקטור ביטוי pN1-mEGFP-FGFR1 | יחידה למחקר אונקולוגיה גינקולוגית, המכון האירופי לאונקולוגיה IRCCS, מילאנו, איטליה | Zamai et al., 2019 | |
| וקטור ביטוי pN1-N-Gly-mEGFP-GPI | יחידת מיקרוסקופיה והדמיה דינמית, CNIC, מדריד, ספרד | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI וקטור ביטוי | יחידת מיקרוסקופיה והדמיה דינמית, CNIC, מדריד, ספרד | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., לונדון, בריטניה | פתרון ליגנד: 20 ננוגרם/מ"ל של FGF2 ב-PBS בתוספת 0.01% BSA. | |
| נתרן פירובט GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | תוסף 1 מ"מ |
| למגיב טרנספקציה בינוני TransIt-LT1 | MirusBio LLC, מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב | MIR 2300 | |
| טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום | GIBCO Thermo Fisher Scientific, וולת'ם, MA, ארה"ב | 25200056 | |
| נוזל טבילה מסוג F 10 מ"ל | Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 מ"ג/מ"ל)ThermoFisher | Scientific | AM2618 | תוסף 0.1% למדיום ללא פנול אדום המשמש לטרנספקציות |
מקורות
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
