מזהה הקמת אספקת דם משותף בעכברים Parabiotic על ידי הזרקת הסוכר קאודל וריד

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה חדשה של זיהוי הקמת מוצלח של זרימת דם משותפת של שני parabits באמצעות הזרקת וריד caudal של גלוקוז, הגורם נזק מינימלי והוא לא קטלני לתוך parabionts.

תקציר

Parabiosis היא שיטה ניסיונית לשילוב בניתוח שתי בעלי חיים מקבילים לאורך ציר האורך של הגוף. אנו מציגים פרוטוקול לגילוי הקמתה המוצלחת של כימריזם דם בפראביטס על ידי הזרקת וריד caudal של גלוקוז. . עכברים מיוטיים נבנו גלוקוז הוזרק לתוך העכבר התורם דרך הווריד הזנב, ותנודות של רמת הגלוקוז בדם נמדד בשני העכברים באמצעות גלומוטר דם בנקודות זמן שונות. התוצאות שלנו הראו כי לאחר הזרקת גלוקוז, רמת הגלוקוז בדם בעכברים תורמים גדל בחדות אחרי 1 דקות ירד לאט לאחר מכן. בינתיים, רמת הגלוקוז בדם של עכברים הנמען לשיאה 15 דקות לאחר ההזרקה. תוצאות דומות הושגו עם אוונס כחול, משמש שליטה חיובית עבור גלוקוז. התנודות הסינכרוניות של רמות הגלוקוז בדם מעידות על כך שזרימת הדם בין שני העכברים הוקמה בהצלחה.

מבוא

Parabiosis היא שיטת דוגמנות שבה שני אורגניזמים חיים מחוברים יחד בניתוח ולהתפתח כמערכת פיזיולוגית אחת עם מערכת משותפת מחזור הדם¹. דגמים כאלה שימשו באופן נרחב לחקר הפיזיולוגיה בשל היתרון כי החומרים המיוצרים על ידי אדם אחד יכולים לפעול על שתי בעלי חיים באותו זמן דרך מערכת הדם המשותפת. מאז אמצע 1800, כאשר הניסויים parabiotic היו חלוץ על ידי פול ברט², השיטות לבניית מודלים parabiotic הפכו סטנדרטיים. עם זאת, שיטה פשוטה ונוחה לאימות הקמתה המוצלחת של כימריזם דם חסר. נמסר כי מחזור הזרימה ניתן להעריך בהצלחה על ידי intraperitoneally הזרקת 0.5% הצבע הכחול אוונס באחד הפראביבטים ואחריו מדידה של בספיגת כחול אוונס בדם של שני הפראביב עם קורא מיקרולוח³. שיטה נוספת מחייבת גזע עכבר מסוים המכיל CD 45.1⁺-ו-cd 45.2⁺-מונוציטים עם התווית בכל מבנה. Cy, תא הציטונסה משמש לאחר מכן כדי לקבוע כמינות דם על ידי מדידת תדירות של שני סמנים ב מונוציטים מן הטחול או הדם⁴. עם זאת, שיטות אלה הן לעתים קרובות קטלני או מסורבל לבעלי חיים, ושיטה בטוחה ופשוטה לאימות מהיר ואמין של מודלים parabiotic הוא רצוי מאוד. במחקר זה, הקמנו שיטה חדשה למטרה זו, אשר אומתה במודל העכבר של parabiosis. הריכוז של גלוקוז בדגימות דם שנלקח מווריד הזנב נמדד באמצעות גלוקומיטר, והתבנית של שינויים ברמת הגלוקוז בעכברי התורם והנמען נחשבת אינדיקציה לצ המחזור. קראנו לשיטה זו את שיטת התנודות בגלוקוז. היישום של שיטת אימות זו אינו מוגבל לעכברים, אך ניתן להרחיב אותם למודלים פתולוגיים שונים, למעט אלה עם חוסר התקנה רציני של מטבוליזם הגלוקוז. ההליך הוא פשוט, הצלת זמן, ובטוח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים בבעלי חיים והטיפול בהם אושרו על-ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים ובוועדת הרפואה של חרבין.

הערה: הכלים והציוד הנדרשים לשיטה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים ובעלי חיים

1. סדר C57BL/6 עכברים זכרים עם משקל בין 20 g-25 גרם מספק בעלי חיים סטנדרטיים המעבדה.
2. הבית העכברים במחזור של 12 h החושך: 12 h החשיכה ב -24 עד 26 ° צ' עם גישה בליבינום למים ומזון.

2. פרביוזיס

1. באמצעות הזרקה של 20 גרם/L 2, 2, 2-tribromoethanol בריכוז של 0.1 mL/10 g. לאשר הרגעה הולמת כפי שמצוין על ידי הרפיה שריר, נשימה איטית ויציבה, אובדן רפלקס העור, היעלמות רפלקס הקרנית.
2. החלת משחה אופטלמולוגית עם טיפ-עצה כדי למנוע עיניים יבשות.
3. בצע את ההליך parabiosis כפי שמתואר בעבר⁵.
   1. מניחים את העכברים במצב פרקדן. לגלח ביסודיות את הצד השמאלי של עכבר אחד בצד ימין של העכבר השני החל כ 1 ס מ מעל המרפק ל 1 ס מ מתחת לברך עם מכונת גילוח חשמלית. השתמש קרם דפילציה כדי לנקות לחלוטין את הפרווה על העור מגולח.
   2. לנגב את האזורים המגולחים. עם שפתי-האור מניחים את העכברים על משטח מחומם מכוסה על ידי כרית סטרילי.
   3. צור חתכים בעור האורך החל מ 0.5 ס מ מעל המרפק כדי 0.5 ס מ מתחת למפרק הברך באמצעות זוג מספריים חדים על הצד המגולח של כל חיה.
   4. לנתק את העור מfascia תת עורית בעדינות לאחר החיתוך.
   5. לחבר את האוקרגון והברך של parabiont עם תפר 3-0.
   6. תפר את העור מגולח עם תפר מתמשך 5-0.
4. הכנס 0.5 mL של 0.9% התת-עורי אל כל עכבר כדי למנוע התייבשות.
5. הכנס טרמדול (10 מ"ג/25 גרם/יום) הפנימי מוברג לכל עכבר כדי להקל על הכאב.

3. ואלידציה של כימנות מחזור

1. שיטת התנודה בגלוקוז
   הערה: לוודא את הבנייה המוצלחת של הצ מחזור בין parabionts בשיטת תנודות הגלוקוז (אין צום) ביום העשירי לאחר ניתוח parabionts.
   1. באמצעות הזרקת הצפק של 20 גרם/L 2, 2, 2-טריברואואתנול לכל עכבר בריכוז של 0.1 mL/10 גרם.
   2. לתקן את עכברי התורמים בתוך. תיקון זנב של עכבר חזותי ורידי
   3. שפשף את הורידים הקאואל באגף של אחד מזנבו של הפראבונט עם כדור צמר גפן שנספג ב 70-75% אלכוהול כדי לנקות את הזנב ולהתרחב בכלי הדם.
   4. החזק מזרק 1.0 mL המכיל גלוקוז ביד ימין ולשמור את המחט במקביל הווריד (פחות מ 15 °).
   5. הכניסו את המחט לתנוחה כ-2-4 ס מ מקצה הזנב.
   6. הכנס 100 μL של גלוקוז (1.2 g/ק"ג) לתוך התורם בתוך 10 s.
      הערה: המונח תורם מתייחס לפרביונט המקבל את הזרקת הגלוקוז דרך העורק האחורי. המטופל הוא הפרבימונט השני, שאינו מקבל גלוקוז ישירות.
   7. נקה את הבהונות. עם שפתי-האור לחתוך את הבהונות של עכברים התורם והנמען עם מספריים ולאסוף טיפת דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה של גלוקוז (1 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 30 דקות, 40 דקות, 50 דקות, ו 60 דקות). הסר את קריש הדם בכל נקודת זמן איסוף כדי למנוע נזק נוסף.
      הערה: הנפח של דם שנאסף היה 10-25 ul עבור בדיקה אחת, ו 90-225 ul בסך הכל.
   8. לטפטף את הדם לתוך מרכז מבחני גלוקומיטר עבור זיהוי רמת גלוקוז.
2. תשתמש בכתם הכחול של. אוון כשליטה חיובית³
   1. הכנס 200 μL של 0.5% כחול הנוגדן של אוון intraperitoneally לתוך העכבר התורם.
   2. 2 h מאוחר יותר, המתת החסד על ידי הזרקה התוך הצפק של 20 גרם/L 2, 2, 2-tribromoethanol לכל עכבר בריכוז של 0.2 mL/10 גרם, ולאסוף דם משני parabits על ידי ניקוב לב.
   3. צנטריפוגה את דגימות הדם ב 916 x עבור 15 דקות.
   4. . אספו נסיוב מהסופרנטאנט
   5. דלל את הנסיוב עם 0.9% הנאגל בשעה 1:50.
   6. למדוד את ספיגת דגימות סרום מדולל ב 620 ננומטר עם ספקטרוסקופיה.

תוצאות

ב שישה עכברים תורמים, רמות הגלוקוז בדם עלה בחדות כדי 26.5 μm/L (173% עלייה) בממוצע של 1 דקות לאחר ההזרקה של 100 μL של גלוקוז (1.2 g/ק"ג) דרך הווריד הזנב ולאחר מכן ירד בהדרגה ל 13.3 μm/L ב 60 דקות. בעכברי הנמען, הגלוקוז בדם עלה באיטיות לאחר ההזרקה והגיע לרמת השיא הראשונה ב -15 דקות (47% הגדלה, 12.2 μm/L). בהתבסס על התוצאות הנ ל, התקן של מחזור המחזור הוגדר כדלקמן: 1) עלייה חדה ברמת הגלוקוז בדם (מינימום 100% להגדיל או > 20 μm/L) בעכברים תורמים בתוך 1 דקות לאחר הזרקת גלוקוז, ו 2) עלייה משמ...

דיון

Parabiosis מתייחס לטכניקה כירורגית של חיבור שתי חיות חיים כדי להקים מערכת כלי דם משותף על ידי ניסיוני פירושו^6,7,8. היתרון של מודל זה הוא כי החומרים המיוצרים על ידי אדם אחד יכול לפעול על שני בעלי חיים באותו זמן. לפיכך, ניתן להשתמש במודל הפרביוזיס כדי לחקור את התפקיד של חומר או גורם במחלה קשורה, תוך הפקת מסקנות משמעותיות וחדשניות רבות. לאור ערך היישום הגדול שלה, המודל הביא להבנה טובה יותר של מחלות לב וכלי דם⁸

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלקחיים מעוקלים	מכשירים כירורגיים JZ, סין	J31340
מספריים עדינים	מכשירים כירורגיים JZ, סין	WA1030
מלקחיים מחט	JZ מכשירים כירורגיים, סין	60017961
מזרקים 2.5 מ"ל	Agilent, ארה"ב	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, ארה"ב	T48402-5G
פניצילין	Solarbio, סין	IP0150
tramadol	Yijishiye, סין	YJT712520
גלוקומטר	Roche Diabetes Care, אינדיאנה	Accu-Chek Active רצועות
Counterstain הכחולות של	אוון Solarbio, סין	G1810
קרם אפילציה	Nair, ארה"ב	שמיכת חימום LL9161
( כרית חימום)	Kent Scientific Corp, ארה"ב	TP-22G
מכונת גילוח חשמלית	Codos, סין	CP-5000
3-0,5-0 תפר כירורגי	מפעל מחטי תפרים רפואיים בשנחאי, סין	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#

בדיקה