מאמר שיטה

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

DOI:

10.3791/60415

⸱

13 באוקטובר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים משנים דפוסי הגירה בתגובה לגירויים כימיים, כולל מעברי הצבע של הגירויים. הגירה סלולרית בכיוון של מעבר הדרגתי כימי, המכונה כימוטקאס, ממלא תפקיד חשוב בפיתוח, התגובה החיסונית, הפצע ריפוי, וגרורות סרטן. בעוד כימוטקסיס מודולים את הגירה של תאים בודדים, כמו גם אוספים של תאים בvivo, במחקר מתורבת מתמקד כימווניות תא יחיד, בחלקו בשל העדר הכלים הניסיוניים הנכונה. כדי למלא את הפער, המתואר כאן הוא מערכת ניסיונית ייחודית המשלבת מיקרופלואידיקה ו מיקרופלנינג כדי להדגים את ההשפעות של מעברי כימיים על הגירה תא קולקטיבי. יתר על כן, מיקרוסקופ המתיחה ומיקרוסקופ הלחץ דופלקס משולבים במערכת כדי לאפיין שינויים בכוח הסלולר על מצע, כמו גם בין תאים שכנים. כהוכחה-of-קונספט, הגירה של האיים העגולים של מיקרותבנית של דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) התאים נבדק תחת הדרגתי של גורם הצמיחה hepatocyte (HGF), גורם פיזור ידוע. הוא נמצא כי תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של HGF להגר מהר יותר מאשר אלה בצד הנגדי בתוך האי תא. בתוך אותו האי, המתיחה הסלולר דומה משני הצדדים, אבל הלחץ הבינתאי הוא הרבה יותר נמוך בצד של ריכוז HGF גבוה. מערכת זו הניסיונית הרומן יכול לספק הזדמנויות חדשות ללמוד את המכניקה של הגירה כימוטקטיק ידי הקולקטיבים הסלולריים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגירה סלולרית במערכות ביולוגיות היא תופעה יסודית הכרוכה בהיווצרות רקמות, התגובה החיסונית, וריפוי הפצע1,2,3. הגירה סלולרית הוא גם תהליך חשוב בכמה מחלות כמו סרטן4. תאים לעיתים קרובות עוברים כקבוצה במקום בנפרד, המכונה העברת תאים קולקטיבית4,5. כדי שתאים יזוזו באופן קולקטיבי, חישת המיקרו-סביבה תהיה חיונית ב-6. למשל, תאים תופסים גירויים פיזיקליים ומגיבים על ידי שינוי תנועתיות, אינטראקציות תאים ואינטראקציות תאים, והתוצאה היא הגירה כיוונית לאורך מעבר צבע כימי7,8, 9,10. בהתבסס על הקשר הזה, נעשו התקדמויות מהירות בטכנולוגיות מעבדה על שבב שיכולות ליצור מיקרוסביבות כימיות מבוקרות היטב כגון הדרגתי של כימוסטנט11,12,13 . בעוד המעבדה-on-a-שבב מבוססי מיקרופלואידיקה שימשו בעבר כדי ללמוד כימוטקוניות של האנסמבל הסלולר או spheroids הסלולר14,15,16,17, הם היו בשימוש בעיקר בהקשר של הגירה תא יחיד18,19,20,21. מנגנונים הנמצאים בבסיס תגובה קולקטיבית הסלולר למעבר מעבר כימי עדיין לא מובנים היטב14,22,23,24,25,26 . לפיכך, פיתוח פלטפורמה המאפשרת השליטה הרקתית הטמפורלית של גורמים מסיסים, כמו גם התבוננות באתרו של תאים ' ביופיזיקלי יסייע לפענח את המנגנונים מאחורי הגירה תא קולקטיבי.

פיתח ותיאר כאן הוא מערכת מיקרופלואידיג multi-מנותבת המאפשרת את הדור של הדרגתי ריכוז של גורמים מסיסים, כי הגירה מודולים של אשכולות תאים בדוגמת. במחקר זה, מקדם צמיחה hepatocyte (HGF) נבחרה כדי לווסת את התנהגות הנדידה של דין-דארבי כליה כליות (MDCK) תאים. Hgf ידוע להחליש את התאים התא התא ולשפר את תנועתיות התאים27,28. במערכת המיקרופלואידיג, מיקרוסקופ המתיחה של פורייה ומיקרוסקופ מונאולייר משולבים גם הם, המאפשר ניתוח של התנועתיות, כוח כריתת הגוף, והמתח הבינתאי הנגרם על ידי התאים המרכיבים בתגובה ל HGF עבר צבע. בתוך האי זהה, תאים הממוקמים בקרבת ריכוז גבוה יותר של hgf להעביר מהר יותר ולהראות נמוך יותר התרבות רמות הלחץ מאשר אלה בצד עם ריכוז hgf נמוך. התוצאות מרמזות על כך שהמערכת הניסיונית החדשה הזאת מתאימה לחקור שאלות אחרות בתחומים הכרוכים בהעברה סלולרית קולקטיבית תחת מעברי מדרגות כימיים של גורמים מסיסים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ליתוגרפיה של SU-8 תבניות עבור סטנסילים (עובי = 250 μm) ו-microchannel חלקים (עובי = 150 μm), תחריט זכוכית (עומק = 100 μm), וייצור יצוק היו מיקור חוץ על ידי שליחת עיצובים באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב ליצרנים.

1. הייצור של הסטנסיל מיקרומיתיל (PDMS) ו-microchannel

  1. עיצוב המיקרו-תבנית של סטנסיל ומיקרוערוצים.
  2. הרכיבו או מיקור חוץ SU-8 תבניות (עובי של ~ 250 יקרומטר עבור סטנסילים ו ~ 150 יקרומטר עבור מיקרוערוצים) על וופלים סיליקון (4 "קוטר).
  3. הכינו את התערובת PDMS על ידי ערבוב של אלסטומר בסיס וריפוי סוכן ביחס של 10:1.
    1. מקום 15 מ ל של אלסטומר בסיס בצינור 50 mL ולהוסיף 1.5 מ ל של ריפוי סוכן. . הכן שניים כאלה
    2. מערבולת התערובת PDMS עבור 5 דקות. צנטריפוגה את תערובת PDMS ב 196 x g עבור 1 דקות כדי להסיר בועות.
  4. כדי להמציא סטנסיל PDMS, יוצקים ~ 1 מ ל של התערובת PDMS על וופל, תוך הימנעות באזורים בדוגמת SU-8, כך PDMS נוגע בצד של העמודים SU-8 אבל לא החלק העליון של תבנית SU-8.
    1. מניחים את הפרוסת וופל על משטח שטוח למעלה מ -30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לרפא את PDMS בתנור יבש ב 80 ° c עבור מעל 2 h.
    2. בזהירות לקלף את PDMS מ-SU-8 עובש לקצץ את קרום PDMS דק באמצעות אגרוף חלול 14 מ"מ. הסר את האבק על פני החלקים של PDMS באמצעות סרט דביק ולאחר מכן לחיטוי הסטנסילים של PDMS.
  5. כדי להמציא מיקרוערוץ PDMS, יוצקים ~ 30 מ ל של תערובת PDMS על העובש SU-8.
    1. דגה עבור 30 דקות בחדר ואקום ולרפא PDMS בתנור יבש ב 80 ° c עבור מעל 2 h.
    2. בזהירות לקלף את PDMS מ-SU-8 עובש וחותכים את PDMS לגודל של 24 מ"מ x 24 מ"מ. בכל בלוק pdms, ליצור שקע אחד ושלושה אינלטס באמצעות אגרוף ביופסיה 1 מ"מ.

2. הכנת הזכוכית התחתונה עם הג'ל פוליאקרילאמיד (PA)

  1. ייצור או מיקור חוץ מלבני משקפיים השקופית (24 מ"מ x 24 מ"מ x 1 מ"מ) עם מיקרו מלבני (6 מ"מ x 12 מ"מ, 100 יקרומטר עומק29) על ידי גזירה וחריטה משקפיים.
  2. Silanize המשטח של הזכוכית התחתונה30.
    1. להכין פתרון silane לאגד על ידי ערבוב 200 מ ל של מים מיועמים (DIW), 80 μL של חומצה אצטית, ו 50 μL של 3-(trimethoxysilyl) פרופיל מתיונין (TMSPMA) עבור 1 h.
      התראה: TMSPMA הוא נוזל דליק. בצע את ההמלצות בגיליונות נתונים של בטיחות חומרים. . תשתמש רק בתרכובת כימית
    2. להסיר את האבק מפני השטח של הזכוכית על ידי דבק דביק ולנקות את הזכוכית.
    3. לכסות את המשטח החרוט של הזכוכית התחתונה עם 100 μL של הפתרון bind silane ולהשאיר את הזכוכית ב-RT עבור 1 h.
    4. שטפו את הזכוכית בעזרת DIW 3x והרשו לזכוכית להתייבש בטמפרטורת האוויר הסביבתי או בניפוח אוויר.
  3. הכינו תמיסת ג'ל לג'ל הרשות הפלשתינית31.
    1. הכינו פתרון טרי של 0.5% (w/v) אמוניום פרסולפט (APS) על ידי המסת 5 מ"ג של APS ב 1 מ ל של DIW.
    2. הכינו את הפתרון הרשות הפלסטינית המורכב מ-138 μL של 40% אקרילאמיד פתרון, 101 μL של 2% bis-אקרילאמיד פתרון, 5 μL של פתרון חלקיקים פלורסנט (0.2 μm), ו-655 μL של DIW.
      התראה: הפתרונות אקרילאמיד וביסאקרילאמיד רעילים. לובשים כפפות מגן, ביגוד והגנה מפני עיניים. הגן על פתרון ג'ל הרשות הפלשתינית המכיל חלקיקי פלורסנט מהאור.
      הערה: מערבולת הפתרון חרוז פלורסנט לפני ליטוף כדי לקבל מספר אחיד של חרוזי פלורסנט לכל אצווה.
    3. לאחר הוספת 100 μL של הפתרון APS ו 1 μL של טטרמתיונין (TEMED), העברה 10 μL של פתרון ג'ל מעורב אל המיקרו-באר מלבני, והמקום על גבי coverslip עגול (18 מ"מ).
      הערה: כדי למלא את הזכוכית התחתונה עם ג'ל הרשות ללא בועות, המקום פתרון ג'ל מספיק על החריץ של הזכוכית התחתונה, להחליק בזהירות את הכיסויים על הפתרון ג'ל ולהסיר כל פתרון העודפים ג'ל.
      התראה: הג נרפא באיטיות במשך כ-40 דקות. ההליך הבא עבור ג'לים תפרידו צריך להתבצע בהקדם האפשרי.
    4. להעיף את ההרכבה של זכוכית אישית, הפתרון ג'ל, ואת coverslip, ואז צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 96 x g כדי להביא חלקיקי פלורסנט לשכבה העליונה של ג'ל הרשות.
    5. הסירו את ההרכבה מהצנטריפוגה והניחו אותה על המשטח השטוח עם הכיסויים הפונים כלפי מטה.
      הערה: החל משלב 2.3.6, טפל בדגימות בארון בטיחות.
    6. לאחר 30 דקות, להפוך את ההרכבה ולמקם אותו בצלחת פטרי 35 מ"מ, למלא עם 2 מ ל DIW, ו (באמצעות מלקחיים) בעדינות להסיר את הכיסויים על ידי הזזת אותו לצד אחד.
      הערה: ג'ל נרפא הרשות ניתן לאחסן DIW עבור 1 חודש. עם זאת, הקולגן מצופה על ג'ל הרשות הפלסטינית, יש להשתמש בו בניסוי בתוך יום אחד.
  4. . מעיל קולגן על ג'ל הרשות הפלשתינית
    1. התמוססות 1 מ"ג/mL sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-ניטרופניאמינו) הקסאנואט (sulfo-SANPAH תוך) חם 50 mM מאגר HEPES. ירידה 200 μL של הפתרון על פני השטח ג'ל ולהפעיל על ידי אור UV (365 באורך גל ננומטר) עבור 10 דקות.
      הערה: הגנה על הסולפו-סאח מהאור.
    2. לשטוף את הג עם 0.1 M [4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה; HEPES] מאגר 2x ו-PBS 1x.
    3. המעיל הרשות הפלסטינית עם פתרון קולגן (100 μg/mL ב PBS, עכברוש זנב החולדה סוג I) ב 4 ° c הלילה. , ביום שלמחרת. תשטוף עם הערוץ השלישי

3. מיקרופנינג של איי התאים

  1. הכינו F-127 (טבלת חומרים) פתרון [2% (w/v) ב PBS] ולטבול את הסטנסיל האוטומטי pdms ב-f-127 פתרון. שמור אותו באינקובטור 37. מעלות צלזיוס במשך 1 שעות
  2. הכנת פתרון תא (2 x 106 תאים/mL) בתקשורת התרבות תאים המורכב: בינונית של הנשר שונה של Dulbecco (dmem) עם 10% סרום של שור עוברי (fbs) ו 1% אנטיביוטי-ANTIMYCOTIC (AA).
  3. שטוף את הסטנסיל PDMS עם PBS 3x ולהסיר נוזל הן סטנסיל PDMS ו-ג'ל הרשות הפלסטינית. הצב את סטנסיל PDMS על ג'ל הרשות הפלסטינית והוסף את ה-PBS לסטנסיל.
  4. הסר בועות בחורים של סטנסיל PDMS על ידי ליטוף בעדינות. לאחר הסרת בועות, הסר את ה-PBS מהמשטח של הסטנסיל PDMS.
  5. לאחר הצבת 200 μL של פתרון התא על סטנסיל PDMS, לשמור על ג'ל הרשות הפלסטינית בחממה עבור 1 h כך תאים לצרף את ג'ל הרשות הפלסטינית.
  6. שטוף בעדינות את פתרון התא עם מדיית תרבות התא, הסר את סטנסיל PDMS והוסף עוד מדיית תרבות תאים. תבדקו את היווצרות איי התאים. מתחת למיקרוסקופ

4. הרכבה של ג'ל הרשות הפלסטינית עם מיקרוערוץ PDMS

  1. להסיר אבק על מיקרוערוץ PDMS באמצעות סרט דביק, ולאחר מכן החיטוי.
  2. לטפל במשטח של מיקרוערוץ PDMS עם פלזמה חמצן (80 W, 50 kHz) עבור 30 s.
  3. לאחר הסרת כל נוזל על הזכוכית התחתונה מלא ג'ל ממולא, למקם את מיקרוערוץ PDMS על גבי הזכוכית התחתונה ולשים את ההרכבה על מחזיק הזכוכית המותאמת אישית.
  4. מלא את המיקרו-ערוץ עם מדיום תרבות התאים.
    התראה: הקפד להסיר את כל הבועות הלכודים בערוצים על ידי שטיפה בעדינות מדיה חמה עם פיפטה. כמו כן, תוך הסרת בועות, הקפד לא לנתק את האיים התא מיקרותבנית.

5. מערכת מיקרופלואידיג משולבת

  1. חבר את הטאבוליגים.
    1. הכן מחברים על-ידי גזיזת קצה המחטים (18 גר') וכיפוף אותו 90 °.
    2. הכינו קווי אבובים לשלוש מבוא ולשקע אחד.
      1. עבור אבובים מפרץ, לחבר את המחט גזוז ו 30 ס מ מיני קו הכרך עם stopcock לושה כיוון. . הכינו שלושה כאלה
      2. עבור אבובים לשקע, לחבר את המחט גזוז ו-75 ס מ מיני קו הכרך עם stopcock לושה כיוון. . תכין אחד מאלה
      3. מלא את קווי האבובים עם המדיום שחומם מראש במשך 1 שעות.
        התראה: הקפד להסיר את כל הבועות לכודים בקווים אבובים על ידי שטיפה בעדינות מדיה חמה עם מזרק.
    3. להכין מאגרים על ידי הסרת הפלאנגרים מזרקים וחיבור קווים צינור מפרץ.
    4. חבר את מחברי המחט של כל קו אבובים לתוך שלוש אינלטס ומשקע אחד של המכשיר microfluidic.
  2. ממלאים את המאגרים עם 3 מ ל של בינוני טרי או ממוזג כל אחד.
    1. עבור הבדיקה מעבר צבע, למלא את מאגר המים השמאלי עם 20 ng/mL HGF במדיום תרבות התא.
    2. עבור ויזואליזציה של מעבר ריכוז, הוסף צבע פלורסנט 200 μg/mL (rhodamine B-dextran, 70 kDa) אל מאגר המים השמאלי.
    3. חבר את קו צינורות השקע למשאבת מזרק.
      הערה: מצב הפעולה של משאבת המזרק הוא "נסיגה". קצב הזרימה משתנה בהתאם לקיבולת המזרק ומהירות ההפעלה של משאבת המזרק.
  3. מניחים את מערכת microfluidic משולבת על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלוראני קונבנציונאלי.
    התראה: כדי ליצור מעבר עדין של HGF בערוץ microflu, שיעור הזרימה צריך להיות איטי כמו 0.1 μL/min. זה רגיש מספיק כדי שיהיה צורך בייצוב עבור 2 שעות, והטיפול חייב להילקח כדי למנוע הפרעה פיזית במהלך הניסוי.

6. רכישת תמונה

  1. לקחת תמונות כל 10 דקות עד 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי שוכנו בחממה. בכל פעם, לקחת קבוצה של תמונות באמצעות עדשת המטרה 4x בשלושה ערוצים שונים, כולל תמונת שלב כדי להמחיש הגירה התא, תמונת פלורסנט ירוק להמחיש חרוזים פלורסנט מוטבע ג'ל הרשות, ותמונת פלורסנט אדום כדי להמחיש את ה ריכוז של כימיקל.
  2. לאחר נטילת תמונות בזמן, להחדיר 0.25% טריפסין-EDTA פתרון למיקרו ערוצים כדי לנתק את התאים מהג הרשות הפלסטינית. לאחר הסרת לחלוטין תאים מהג, לקחת תמונת פלורסנט ירוק לשמש כתמונת ייחוס עבור מיקרוסקופ המתיחה.

7. ניתוח נתונים

הערה: קוד מותאם אישית לניתוח נתונים פותח באמצעות MATLAB, ופרטים תוארו במקומות אחרים32,33,34,35,36.

  1. לניתוח התמונה הפאזה, לחשב displacements בשני תמונות בשלב רציף באמצעות ולוסימטריה תמונה חלקיק36.
  2. לצורך המתיחה פורייה מיקרוסקופ, להשוות כל תמונת פלורסנט ירוק עם תמונת הייחוס ולחשב את displacements בכל תמונה באמצעות ולוסימטריה התמונה חלקיקים36. מ displacements, לשחזר המתיחה שנעשו על ידי תאים על האבא ג'ל באמצעות שינוי פורייההמתיחהמיקרוסקופ 33,34,37.
  3. מתוך נתוני המתיחה, לחשב מתח בתוך המונאולייר של האי תא באמצעות מיקרוסקופ מונאולייר לחץ מבוסס על שיטות האלמנט הסופי32,34,38.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור הגירה קולקטיבית תחת מעבר הדרגתי כימי, מערכת microfluidic שולבו עם מיקרוסקופ המתיחה (איור 1). כדי לבנות את המערכת המשולבת, אלקטרופורזה (PA) ג'ל היה יצוק על זכוכית מותאמת אישית, ו-mdck תאים הופרה בתוך האיים מיקרותבנית שנעשו על ידי סטנסיל pdms. עבור ניסוי זה, 12 איים של תאים MDCK (ארבע שורות על ידי שלוש עמודות, קוטר של ~ 700 μm) נוצרו. לאחר שתאים המחוברים ל-ג'לים של PA, סטנסיל PDMS הוסר כדי ליזום העברה קולקטיבית. הערוץ המיקרו-פלואידיסי שנוצר מראש הוצב על גבי ג'ל הרשות הפלשתינית כדי לב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגירה קולקטיבית של תאים בוחרים הוא תהליך חשוב במהלך פיתוח והתחדשות, וכיוון הנדידה מודרך לעתים קרובות על ידי הדרגה הכימית של גורמי גדילה4,23. במהלך הגירה קולקטיבית, התאים ממשיכים לקיים אינטראקציה עם תאים שכנים ומצעים המשמשים כבסיס. אינטראקציות מכניות כאלה מעלות לתופעות מתהווה כגון: durotaxis42, פליטומוניות33, וקנואומוניות43. עם זאת, מחקר זה נעשה באמצעות ריכוז אחד של גורמי גדילה, כמו אלה בסרום ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) המענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (לא. NRF-2017R1A1A01075103), מענק אוניברסיטת קוריאה, ותוכנית BK 21 פלוס. זה היה גם נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M תמיסת חיץ HEPESGibco15630-056
1 מ"מ ביופסיה אגרוףאינטגרה Miltex33-31AA-P/25
100 מ"מ צלחות פטריSPL10100מ"מ קוטר 100 מ"מ, גובה 15 מ"
מ 14 מ"מ אגרוף חלולILJIN124-0571
18 מ"מ Ø CoverslipMarienfeld-Superior111580עגול 18 מ"מ, עובי מס' 1 (0.13 עד 0.16 מ"מ)
2% תמיסת ביס-אקרילאמידBio-Rad1610142ללבוש כפפות מגן, ביגוד והגנה על העיניים.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
3-way stopcockHyupsungHS-T-61Nזהירות: אין להשתמש אם נפתח קודם לכן. אין לבצע חידוש או לעשות שימוש חוזר
בקו נפח מינימלי של 30 ס"מ (לילדים)HyupsungHS-MV-30זהירות: אין להשתמש אם נפתח קודם לכן. אין לחדש או לעשות שימוש חוזר
בצלחת תרבית תאים 35 מ"מCorning
40% תמיסת אקרילאמידBio-Rad1610140ללבוש כפפות מגן, בגדים והגנה על העיניים.
קו נפח מינימלי של 75 ס"מ (לילדים)HyupsungHS-MV-75אזהרה: אין להשתמש אם נפתח קודם לכן. אין לחדש או לעשות שימוש חוזר
בחומצה אצטיתJ.T. BakerJT9508-03
אמוניום פרסולפט (APS)Bio-Rad1610700
אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתGibco15240-062
שבב זכוכית תחתוןMicroFIT24 x 24 x 1 מ"מ, חריץ מלבני בהתאמה אישית (6 x 12 מ"מ, עומק: 100 μ m)
קולגן typeI, זנב עכברושקורנינג354236
מחזיק זכוכית מותאם אישיתHan-Gug Mechatronicsבהתאמה
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)BiowestL0615-500w/o מגנזיום,
סידן סרום בקר עוברי (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres מיקרוספירות שעברו שינוי אמיןInvitrogenF87640.2 ומיקרו; m, פלואורסצנט צהוב-ירוק (505/515)
גורם גדילת הפטוציטים (HGF)סיגמא-אולדריץ'H1404-5UGרקומביננטי,
מערכת הדמיית תאים חיים אנושית בשלב JuLINanoEnTek בשלבXYZ אוטומטי והדמיה פלואורסנטית תואמת חממה (37 & deg; C ו-5% CO2)
כליות כלבים (MDCK)סוג II
מערכת פלזמת חמצןFemto ScienceCUTE-MPR
פלורוניק F-127סיגמא-אולדריץ'P2443-250G
רודמין B איזותיוציאנט – dextranSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, המשמש להערכת התפלגות מרחבית-זמנית של HGF בתעלה המיקרופלואידית
היפודרמית סטרילית 18 GKOVAXחתוך את קצה המחט וכופף אותה ב-90 מעלות לחיבור יציאות כניסה/יציאה עם קו נפח
סרט דביק3M/Scotch810D33 מ' x 19 מ"מ
תבניות מאסטר SU-8MicroFIT4 אינץ' קוטר, בהתאמה אישית
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589חנות ב-20°C. יש לאחסן מוגן מפני לחות ואור.
ערכת אלסטומר Sylgard 184Dow CorningPDMS
משאבת מזרקChemyx Inc.דגם Fusion 720מזרקי נוזל משיכה
KOVAX1, 3, 5, 10 או 50 סמ"ק לשימוש במאגר כניסה או משאבת מזרק יציאה
tetramethylethylenediamine (TEMED)Bio-Rad1610800ללבוש כפפות מגן, ביגוד והגנה על העיניים.
מנורת אולטרה סגול (UV)UVP LLC95-0248-02אורך גל 365 ננומטר
430165אישיתMadin-Darby מחט

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617(2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515(2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918(2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844(2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426(2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172(2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microfluidic ChipChemotactic MigrationCollective Cell MigrationMonolayer Stress MicroscopyHepatocyte Growth FactorMadin Darby Canine Kidney CellsPDMS StencilPolyacrylamide GelFluorescent Beads

מאמרים קשורים