מאמר שיטה

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

14.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60419

⸱

3 בדצמבר 2019

 ,  ,  , 
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, Korea University of Science and Technology (UST)

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.

תקציר

באורגניזמים חיים, היפרסטרוביליות מעיים היא סימפטום רציני המוביל למחלות מעיים דלקתיות רבות (IBDs). האלגיה היא מודל בעלי חיים שאינו מדיה , המשמש רבות כמערכת שיטת שיטה, בשל תוחלת החיים הקצרה, השקיפות, העלות והאפקטיביות, והיעדר בעיות באתיקה בעלי ממון. במחקר זה, פותחה שיטה כדי לחקור את ההשפעות של חיידקים שונים 3, 3 '-diindolylmethane תאן (עמום) על חדירות המעיים של C. אלגיה עם מערכת ניתוח תמונה בתפוקה גבוהה. התולעים נדבקו בחיידקים שונים או מטופלים עם DIM עבור 48 h וניזון עם fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran לילה. לאחר מכן נבדק חדירות המעי על ידי השוואת הדימויים הפלואורסצנטית ועוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בתוך גופי התולעת. שיטה זו עשויה להיות גם הפוטנציאל לזהות פרוביוטיקה וחיידקים מעיים פתוגניים המשפיעים על חדירות המעי במודל החי והוא יעיל לבדיקת ההשפעות של מזיקים או בריאות לקידום הכימיקלים על חדירות המעי ובריאות המעיים. עם זאת, פרוטוקול זה יש גם כמה מגבלות משמעותיות ברמה הגנטית, במיוחד לקביעת אילו גנים משתנים לשלוט במחלות, כי שיטה זו משמשת בעיקר להגדרה פנוטימית. בנוסף, שיטה זו מוגבלת לקביעת בדיוק איזה מצעים פתוגניים לגרום לדלקת או להגדיל את החדירות של המעיים של התולעים במהלך הזיהום. לכן, מחקרים מעמיקים יותר, כולל חקירה של המנגנון הגנטי המולקולרי באמצעות חיידקים מוטציה, נמטודות, כמו גם ניתוח מרכיב כימי של חיידקים, נדרשים להעריך באופן מלא את התפקוד של חיידקים וכימיקלים בקביעת חדירות המעי.

מבוא

חדירות המעי נחשב אחד המחסומים העיקריים הקשורים המעי microbiota וחסינות רירית והוא צפוי להיות מושפע על ידי מספר גורמים, כגון שינויים microbiota בטן, ליקוי אפיתל, או שינוי שכבת ריר1. העיתונים האחרונים דיווחו על פרוטוקולים יעילים כדי למדוד את חדירות המעי של תאי מעיים אנושיים על ידי ניתוח שיעורי השטף הזריחה על פני שכבת התא מעיים2, אבל מחקרים פחות להציג הליך מתאים למדידת חדירות הבטן ב nematodes, במיוחד ב -C. אלגיה, על ידי שימוש בצביעת fitc-dextran.

קיימים שני פרוטוקולים מייצגים למדידת חדירות הבטן ב -C. אלגיה באמצעות הנילוס האדום3 ואריאולאוצין דינתרן (או שיטת הדרדס)4,5. בפרוטוקול זה, השתמשנו FITC-dextran (משקל מולקולרי ממוצע 10,000), אשר יש משקל מולקולרי הרבה יותר גבוה מאשר הנילוס אדום (MW = 318.37) ו-dioglaucine דינתרן (MW = 792.85). Fitc-dextran דומה יותר הנילוס האדום או erioglaucine ניתרן חומרי מזינים macromolecular בפועל כגון פחמימות, אשר נספגים דרך שכבת המעי. ניתן להעריך בקלות את חדירות המעיים של מערכת המזון המומנת של המעי הקיסרי . עם זאת, בתוך שיטת הדרדס, ניתוח כמותי של חדירות המעי קשה עקב חוסר סטנדרטיזציה ויש להעריך ידנית4,5. במקרה של הסדר האדום של הנילוס, אדום הנילוס כתמי גם טיפות שומנים בתאים, אשר עלול להפריע להגדרה המדויקת של חדירות הבטן בג6. הפרוטוקולים הנוכחיים מאפשרים ניתוח כמותי מהיר ומדויק של חדירות המעיים ב -C. אלגיה המטופלת בחיידקים וכימיקלים שונים תוך הימנעות מהכתמים שומנים בלתי ספציפיים.

ג. אלגיה הוא מודל אופייני בתחומים ביולוגיים בשל מחירו הסביר, מניפולציה קלה, בעיות מוגבלות בבעלי חיים, ותוחלת חיי קצר, המועילה לניסויים מהירים7. בפרט, לאחר הוצאת הגנום c. אלגיה , כמעט 40% מהגנים בגנום c. אלגיה הינם אורתוולוגי לגנים הגורמים למחלות אנושיות8. יתר על כן, הגוף השקוף מאפשר התבוננות בתוך האורגניזם, אשר יתרון עבור מחקר אירועים סלולריים ליישומים הפלואורסצנטית בביולוגיה התא, למשל, תא גזע מכתים עם DAPI או אימונוהיסטוכימיה9. ג. אלאנים משמשים לעתים קרובות כבעל חיים ניסיוני כדי ללמוד את האינטראקציה בין מיקרוביוטה הבטן לבין הפונדקאי; בנוסף, C. אלגיהns משמש למסך בריאות לקידום חיידקים פרוביוטיקה10,11,12 , כמו גם כימיקלים תזונתיים לקידוםבריאותהמעיים 13,14.

פסאודומונס aeruginosa ובידור faecalis הם חיידקים ידועים הבטן כי לרעה להשפיע על מערכת העיכול, במיוחד את התאים האפיתל חוקן של בדרכי המעיים15,16. לכן, מדידת חדירות הבטן המופעל על ידי חיידקים אלה הוא הכרחי להקרנה ופיתוח של תרופות חדשות שיכולות להתאושש ולהפחית את הנזק שנגרם על ידי דלקת בקטריאלי וזיהום. בפרוטוקול זה בדקנו את ההשפעות של חיידקי המעי האלה על חדירות המעיים של הג.

כמו כן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי לבדיקת כימיקלים על חדירות המעיים של הג. למטרה זו, השתמשנו 3, 3 '-diindolylmethane תאן (DIM) כמו מודל כימי משום עמום הוא מתחם אקטיביים מטבוליט נגזר של אינדול-3-carbinol, אשר קיים בצמחי מזון הבהקרוסי, ו דווח כי יש השפעות טיפוליות על ibd בעכברים17,18. בנוסף, גילינו לאחרונה כי DIM משפר את התפקוד הלקוי של חדירות המעי בתאי מעיים אנושיים, כמו גם את מודל נמטודות C. אלגיה19.

במחקר זה, השתמשנו בשלושה תנאים ניסיוניים שונים. ראשית, מדדנו את ההשפעות של החיידקים השונים, P. aerginosa ו -E. faecalis, על חדירות מעיים (איור 1). שנית, מדדנו את ההשפעות של P. aeruginosa בשידור חי וחום על חדירות המעי (איור 2). שלישית, מדדנו את ההשפעות של הדים (מודל כימי) על חדירות המעיים של ס. ל. פ . (איור 3).

מטרת מחקר זה היתה לפתח פרוטוקולים ממוטבים המודדים את חדירות המעיים של ה -C. אלגיה, אשר משתנה על ידי טיפול עם חיידקים מעיים שונים, כמו גם עם כימיקלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת P. aerginosa PAO1 ו es coli OP50 תרבות

  1. הכינו 500 מ ל של לוריא-ברדילי (ליברות) בינונית (שולחן 1) ואיחסן מושבה אחת של P. aerginosa לתוך המדיום. דגירה את התרבות עבור 14 עד 15 h ב 37 ° c עם מהירות לרעוד של 150 סל ד.
  2. באותה מידה להפיץ את התרבות החיידקית לצינורות צנטריפוגה 2 500 mL ו צנטריפוגה את הצינורות ב 3,220 x g ב 4 ° c עבור 30 דקות.
  3. הסר את הסופרנטאנט עד שאמצעי האחסון הוא 50 mL (עשירית מאמצעי האחסון הראשוני) והשהה מחדש את הגלולה החיידקית.
  4. אחסן את התרבות החיידקית המרוכז ב-4 ° צ' עד לשימוש. תקופת האחסון של התרבות P. aeruginosa יכולה להיות עד חודש אחד, אבל התרבות הטרייה טובה יותר לגרימת נזק למעיים.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. בנוסף על כל החיידקים החי, הסופרנטאנט של התרבות החיידקית ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות של חיידק המעי19.
  5. כדי להכין את e. coli OP50, התרבות e. coli OP50 ב-dyt בינונית (שולחן 1) ולאחר מכן להחיל צעדים דומים לאלה המתוארים לעיל אבל להקטין את עוצמת הקול לשישית של הנפח המקורי. לדוגמה, אם אמצעי האחסון ההתחלתי הוא 500 mL, לאחר הסרת סופרנטאנט, אמצעי האחסון הנותר הוא כ-83 mL.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

2. הכנת בידור faecalis kctc 3206 תרבות

  1. הכינו 500 mL של מרק המוח החוטא (BHI) ציר (שולחן 1).
  2. איחסן מושבה אחת לתוך 500 mL של ציר BHI ו לדגירה את התרבות עבור 14-15 h בחממה רועד ב 37 ° צ' ו 150 rpm.
  3. באותה מידה להפיץ את התרבות החיידקית לצינורות צנטריפוגה 2 500 mL ו צנטריפוגה את הצינורות ב 3,220 x g ב 4 ° c עבור 30 דקות.
  4. הסר את הסופרנטאנט עד שאמצעי האחסון הוא 50 mL (עשירית מאמצעי האחסון הראשוני) והשהה מחדש את הגלולה.
  5. אחסן את התרבות החיידקית המרוכז ב-4 ° צ' עד לשימוש. התרבות הטרייה טובה יותר לבדיקת ההשפעות על חדירות המעי.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

3. הכנת החום-inactivated E. coli ו-חימום מופעל P. aeruginosa PAO1 תרבויות

  1. תרבות וקציר החיידקים כמתואר לעיל (שלבים 1.1 – 1.3).
  2. חום הפעלה של E. coli OP50 או P. aeruginosa PAO1 תרבות כמתואר בעבר20,21,22. עבור הפעלה החום, החיידק הושעה מחדש ב 65 ° צ' (אמבט מים) עבור 30 דקות.
  3. מצננים את התרבות החיידקית המרוכז בטמפרטורת החדר ואחסנו אותה ב -4 ° c עד השימוש. תקופת האחסון יכולה להיות עד חודש אחד.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

4. הכנת לוחית גידול בינונית (NGM) צלחות לבדיקת ההשפעות של חיידקים שונים על חדירות המעיים של ס. אלגיה

  1. מקום 1.25 g של peptone, 1.5 g של הנאל, 8.5 g של אגר, מערבב מגנטי ו487.5 mL של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית ב500 mL (שולחן 1).
  2. מערבבים היטב את התערובת ומדליקים את התערובת ל -15 דקות ב-121 ° c ומצננים את התערובת ל-55 ° c באמבט מים במשך 30 דקות.
  3. להסיר את המדיום מן האמבטיה מים, להוסיף את הרכיבים (0.5 mL של 1 M CaCl2, 0.5 ml של כולסטרול, 0.5 Ml של MgSO4, 12.5 ml של kpo4) (שולחן 1) כדי ngm, ומערבבים היטב.
    הערה: כל הרכיבים הבודדים חייבים להיות אוטוקלבד למעט כולסטרול (מומס אתנול מוחלט), וכל צעד ניסיוני חייב להתבצע על ספסל נקי.
  4. הפץ 20 מ ל של NGM לכל 90 x 15 מ"מ צלחת פטרי ולאפשר אגר לגבש על ספסל נקי בטמפרטורת החדר (כ 20 ° c). לוחות NGM ניתן לאחסן עד חודש אחד ב -4 ° c.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. הצלחות NGM המשמש לצביעת FITC-dextran הוכנו על ידי אותו ההליך (משלבים 4.1-4.3). 10 מ ל של NGM הופץ כל 60 x 15 מ"מ צלחת פטרי מותר לגבש על ספסל נקי בטמפרטורת החדר (כ 20 ° c).
  5. להסיר את התרבות החיידקית מהמקרר 4 ° c ומערבולת התרבות היסודיות לפני הפצת התרבות על צלחות NGM.
  6. הוסף סך של 800 μL של התרבות החיידקית לכל לוחית NGM טרייה, ואפשר ללוחות להתייבש בחממה של 20 ° c בלילה.
    הערה: עבור הניסוי הראשון (איור 1), שני צלחות Ngm עם E. coli OP50, צלחת Ngm אחד עם P. aeruginosa PAO1, ולוחית ngm אחד עם E. faecalis KCTC3206 היו מוכנים. עבור הניסוי השני (איור 2), שני צלחות ngm עם חי E. coli OP50, צלחת ngm אחד עם לחיות p. aeruginosa PAO1, וצלחת ngm אחד עם החום מופעל p. aeruginosa PAO1 היו מוכנים.

5. הכנת צלחות NGM לבדיקת ההשפעות של כימיקל (DIM) על חדירות המעיים של הג.

  1. הוסף 0.5 g של peptone, 0.6 g של הנרוג, 195 מ ל של מים מזוקקים, מערבב מגנטי, ו 6.8 g של אגר בקבוק זכוכית ב500 mL (NGM אגר).
  2. להוסיף 0.5 g של peptone, 0.6 g של הנרוג, 195 מ ל של מים מזוקקים, ומערבב מגנטי ללא אגר לאחר 500 בקבוק זכוכית mL (ציר NGM).
  3. האוטוקלבים את שני הבקבוקים (מתוך שלבים 5.1 – 5.2), אחד ריק 100 mL בקבוק זכוכית, ואחת ריקה 500 mL זכוכית בקבוק עבור 15 דקות ב 121 ° c. אז, לאפשר את המדיום המכיל בקבוקים להתקרר עד 55 ° c באמבט מים 30 דקות. לשמור על מדיום אגר באמבט מים ולהסיר את הבקבוק המכיל ציר (משלב 5.2) לשלב הבא.
  4. הוסף את הכימיקלים התוסף לציר NGM: 0.4 mL של 1 מ ' CaCl2, 0.4 מ ל של כולסטרול באתנול (ml), 0.4 mL של 1 m MgSO4 ו 10 מ ל 1 m kpo4 (כל הרכיבים האלה חייב להיות מעוקר מלבד הכולסטרול באתנול). לאחר מכן, מערבבים את התערובת ביסודיות עם מערבב מגנטי ב55 ° c.
  5. סמן את התווית אוטומטית בקבוק זכוכית 500 mL עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) והאוטומטית הריקה 100 mL בקבוק זכוכית עם DIM.
  6. העבר 50 mL של ציר NGM לתוך בקבוק התווית העמומה 100 mL. הוסף 500 μL של 20 מ"מ מניות DIM לתוך הבקבוק ומערבבים היטב.
    הערה: עמום מומס ב-DMSO (מלאי עמום של 20 מ"מ).
  7. במהירות להסיר את בינוני NGM אגר מן האמבטיה מים, להוסיף 50 mL של בינוני NGM אגר לתוך בקבוק התווית עמום ולערבב ביסודיות.
  8. מקום 20 mL סדרת מחלקים של מדיום מכיל ngm בינוני לתוך כל 90 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי. בערך חמישה צלחות מוסיביות NGM ניתן לעשות משלב זה.
    הערה: הריכוז הסופי של עמעום בכל צלחת NGM יהיה 100 μM.
  9. כדי להכין את הצלחת המכילים DMSO מכיל, להעביר 150 mL של ציר NGM לתוך התווית DMSO-מתויג 500 mL. הוסף 1.5 mL של DMSO לבקבוק לערבב היטב.
  10. הוסף 150 mL של בינונית NGM אגר לבקבוק בתווית DMSO-לערבב ביסודיות.
  11. מקום 20 מ"ל סדרת מחלקים של dmso המכילים מדיום ngm בכל 90 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי. בקירוב לוחות NGM המכילים כ-15 לוחיות הזיהוי ניתן לעשות משלב זה.
    הערה: הריכוז הסופי של DMSO בכל צלחת NGM יהיה 0.5%.
  12. מחזק את הצלחות בטמפרטורת החדר לפחות 3 שעות ואחסן אותן ב -4 ° צ' עד השימוש.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
  13. הסר את ה -E. coli OP50 או P. aeruginosa PAO1 התרבות מהמקרר 4 ° c (משלב 1.4) ומערבולת התרבות כראוי לפני התפשטות על צלחות ngm.
  14. לשים 800 μL של E. coli OP50 או P. aeruginosa PAO1 התרבות החיידקית על כל לוחית חדש ngm אגר ולאפשר את הצלחות להתייבש בחממה 20 ° c בלילה.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. עבור הניסוי השלישי (איור 3), שני מכיל לוחות ngm המכילים מצופה חי E. coli OP50, אחד dmso המכיל הצלחת ngm מצופה עם לחיות p. aeruginosa PAO1, ו אחד עמום המכיל הצלחת Ngm מצופה עם לחיות p. aeruginosa PAO1 היו מוכנים.

6. הכנת הגיל-מסונכרן על -ידי.

  1. לגדול תולעים על צלחת NGM מוצק ולהאכיל אותם עם E. coli OP50 עד האוכלוסיה הרצויה מגיע.
  2. לסנכרן את הביצים באמצעות שיטת הנחת ביצה מתוזמן או טיפול הלבנת הפתרון כפי שמתואר בעבר20,23,24.

7. טיפול בחיידקים או דים ו-FITC-דטרן הזנה

  1. דגירה הגיל-מסונכרן ביצים ב 20 ° צ' עבור 64 h על לוחות NGM שיושלם עם חי E. coli OP50 כמו מזון.
  2. לשטוף את הגיל-סינכרון L4 הזחל עם S-מאגר ולהעביר אותם (יותר מ 500 תולעים) לצלחות NGM הטיפול המכיל חיידקים וכימיקלים שונים (מתוארים הערה לאחר שלב 4.6 ו 5.14,). מודטה אותם ב 20 ° c עבור 48 h.
    הערה: זמן הטיפול יכול לנוע בין 24 עד 72 h, על פי החיידקים והכימיקלים המשמשים. ניתן גם להעריך את ההשפעה הטיפולית או המונעת של עמעום על-ידי טיפול בתולעים באמצעות פתוגנים ולאחר מכן טיפול בתולעים באמצעות עמעום (האפקט הטיפולי) או על-ידי טיפול מקדים בתולעים באמצעות עמעום ולאחר מכן טיפול בפתוגנים (אפקט המניעה)19.
  3. כדי להכין את הצלחות FITC-dextran, מערבבים 2 מ ל של החום-inactivated E. coli עם 4 מ ג של fitc-dextran. אז, לחלק 100 μL של FITC-dextran ו- E. coli OP50 תערובת לתוך עשרים טרי לוחות ngm אגר (60 מ"מ x 15 מ"מ) ולאפשר את הצלחות להתייבש 1 h על ספסל נקי.
    הערה: הריכוז הסופי של FITC-dextran בכל צלחת NGM יהיה 20 μg/mL.
  4. הכן חמישה E. coli OP50-המכיל צלחות ngm ללא fitc-dextran עבור הטיפול בקרת הרכב. למטרה זו, לחלק 100 μL חום-inactivated ופעל E. coli OP50 לכל לוחות ngm אגר טריים (60 מ"מ x 15 מ"מ) ולאפשר לוחיות להתייבש 1 h על ספסל נקי.
    הערה: עבור כל ניסוי עצמאי, חמש עשרה FITC-dextran שיושלם צלחות NGM וחמישה צלחות NGM ללא FITC-dextran נדרשים.
  5. לאחר 48 h של הטיפול (משלב 7.2), לשטוף את התולעים עם S-מאגר, להעביר את התולעים אל הצלחות FITC-dextran וצלחות NGM ללא FITC-dextran, ו מודיית את הצלחות לילה (14 – 15 h).
    הערה: עבור כל קבוצת טיפולים, 5 משכפל של מכתים FITC-dextran (או האכלה בקרת רכב) נדרשים.
  6. לשטוף את התולעים עם S-מאגר ולאפשר להם לזחול בצלחת הטריים של NGM אגר עבור 1 h.
    הערה: עבור כל ניסוי עצמאי, סך של 20 לוחות NGM טריים נחוצים. בשלב זה, אתה יכול להשתמש בלוח NGM בתוספת ללא או עם E. coli OP50.
  7. הוסף 50 μL של 4% פורמלדהיד פתרון לכל טוב של שחור 96 שטוח בתחתית צלחת. העברה כ 50 תולעים מכל צלחת NGM לתוך כל טוב עבור מדידות פלואורסצנטית. לאחר 1 כדי 2 דקות, להסיר ביסודיות את כל פורמלדהיד מכל באר ולהוסיף 100 μL של הרכבה בינונית כדי לחלוק את הבארות.
    הערה: תמיסת פורמלדהיד (4%) משמש כדי לשתק ולתקן את התולעים. עבור כל קבוצת טיפולים, 5 בארות (5 משכפל) משמשות לניתוח תמונה.

8. הדמיה ממוחשבת עם מערכת הדמיה אופרטה וקביעת חדירות המעיים על ידי מדידת ספיגת הקרינה הפלואורסצנטית fitc-dextran

הערה: ניתן להשתמש בstereomicroscopy פלורסנט לניתוח תמונה במקום למערכת האופרטה.

  1. לכידת תמונות של הקרינה הפלואורסצנטית ולמדוד את עוצמת הקרינה באמצעות מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה אופרטה ולנתח את התמונות עם תוכנת הרמוניה.
  2. בתוכנה הרמוניה, לחץ על המכסה הפתוח סמל לפתוח את המכסה לשים את הצלחת לתוך המכונה.
  3. . הגדר את הפרמטרים
  4. לחץ על הגדרת, בחר את סוג הלוחית (96-ובכן קורנינג שטוח-למטה) ולהוסיף את הערוצים (שדה בהיר ו-egfp ערוצים).
  5. כוונן את הפריסה. עבור אל בחירת הפריסהולאחר מכן בחר מעקב והתאם את הפרמטרים (התמונה הראשונה ב-1 μm, מספר המטוסים הם 10, מרחק הוא 1 μm).
  6. בחר באחת מבארות הטיפול ובשדה לכידה אחד ולחץ על בדוק כדי לבדוק אם התמונות משביעות רצון במקטע ניסוי ההפעלה .
  7. אם התמונות משביעות רצון, חזור למקטע הגדרת ולחץ על סמל האיפוס בסוף המסך. לאחר מכן, בחר את כל בארות היעד ומספר מתאים של שדות לכידה.
  8. עבור להפעלת ניסוי שוב והזן את שם הלוח ולאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל בעיבוד.
  9. כדי למדוד את עוצמת הזריחה, עבור למקטע ניתוח תמונה והקלט את התמונה. חפש את התא על-ידי בחירה בערוץ egfp ובפעולת השירות B. כוונן את הסף המשותף ל-0.5, שטח ל> 200 יקרומטר2, פקטור מפוצל ל-3.0, סף בודד ל-0.18 וניגודיות ליותר מ-0.18. לאחר מכן, חשב את מאפייני העוצמה ובחר את הממוצע כפלט. לחץ על הסמל החל כדי לשמור את הכיוונון.
  10. עבור למקטע הערכה כדי למדוד את העוצמה על-ידי קבלת מפת חום וטבלת נתונים. הגדר את הפרמטר בדיקה לתאים — עוצמת תא egfp ממוצע-ממוצע לכל הטוב והפעל את ההערכה.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
  11. כדי לחלץ את הנתונים מאופרטה, לחץ על לחצן ההגדרה ובחר בניהול נתונים.
  12. בחר ארכיון כתיבהולאחר מכן פתח את העיון ובחר את הקובץ.
  13. כדי לבחור את הקובץ, לחץ על האות הקטנה + בפינה השמאלית ולאחר מכן לחץ על מדידה ובחר שם צלחת.
  14. בחר את הקובץ ולחץ על הלחצן ' אשר'.
  15. בחר בנתיב לשמירת הקובץ על-ידי לחיצה על סימן הדפדוף בנתיב הפעיל.
  16. לחץ על התחל כדי לשמור את קובץ הנתונים.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

9. אנליזה סטטיסטית של הקרינה הפלואורסצנטית FITC-dextran של ס. אלגיה

  1. יבא את הנתונים וחשב את סטיית הממוצע והתקן (SD) באמצעות תוכנת סטטיסטיקה.
  2. לנתח את ההבדל המשמעותי עם ניתוח חד כיוון של השונות (ANOVA) ואחריו בדיקת השוואה מרובה של Tukey.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר הדגירה עם P. aeruginosa PAO1, ג. אלגיה הראה עלייה משמעותית בזריחה fitc-dextran בגוף התולעת לעומת הזריחה המוצגת לאחר הדגירה עם שני זנים חיידקיים אחרים (איור 1). עוצמות הזריחה של תולעים הניזונים עם E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1, ו -e. faecalis KCTC3206 היו 100.0 ± 6.6, 369.7 ± 38.9, ו 105.6 ± 10.6%, בהתאמה. הנתונים מדגישים כי P. aeruginosa גרם נזק חיוני יותר למכשול הבטן האפיתל, ולכן, התולעים הציגו גידול דרמטי בחדירות המעיים שלהם. בה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

על ידי ניצול השיטה החדשה הזאת לקביעת חדירות הבטן ב -C. אלגיה, המשלבת מיקרוסקופית קרינה אוטומטית וניתוח דימוי כמותי, ניתן לקבוע את ההבדלים הנגרמים על-ידי מיקרואורגניזמים או כימיקלים בvivo, במיוחד במעיים של מעיים. פרוטוקול זה שימושי עבור חקירות המעיים והחלים על משימות רבות, כגון מיני חמצן תגובתי (ROS) החלטה במצבי לחץ ובדיקות מורפולוגיות, בשל הנוחות שלה מניפולציה קלה. כמו-כן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את ההשפעות של שיטות טיפוליות ומונעות כנגד פתוגנים מרובים בג . בפרט, זה יכול להיות פרוטוקול י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

מחקר זה היה נתמך על ידי מכון קוריאה של מדע וטכנולוגיה מענק מחקר בתחום הציור (2E29563).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3,3'-דיינדולילמתאן סיגמאD9568
90 פעמים; צלחות פטרי 15 מ"מSPL Life Sciences, דרום קוריאה10090
60× צלחות פטרי 15 מ"מSPL מדעי החיים, דרום קוריאה10060
שחקן אגרבקטון דיקינסוןREF. 214010
תמיסת פורמלדהיד SigmaF1635
עירוי לב למוח (BHI) בקטון דיקינסוןREF. 237500
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)סוג פראי 
כולסטרולסיגמהC3045
צלחת מבחן קוסטה, 96 שחור היטב עם תחתית שטוחה שקופה לא מטופלת, ללא מכסה פוליסטירןקורנינג משולבREF. 3631
דימתיל סולפוקסידסיגמאD2650
Enterococcus faecalis KCTC 3206אוסף קוריאני לתרבית סוגKCTC מס' 3206Escherichia coli אנאירובי פלקוטטיבי
OP50המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC)
פלואורסצאין איזותיוציאנט - תוכנת dextranSigmaFD10S
Harmony PerkinElmerverson 3.5
Luria-Bertani LB בינוניMerckVM743185 626  1.10285.5000
מגנזיום גופרתי heptahydrate Fisher BioreagentsBP2213-1
Fluoromount מדיום הרכבה מימיSigmaF4680
Operetta CLS מערכת ניתוח תוכן גבוהPerkinElmer 
פפטוןMerckEMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01אוסף קוריאני לתרבית סוגKCTC מס' 1637
נתרן כלוריפישר ביו-ריאגנטיםBP358-1
מיקרוסקופ סטריאוניקון, יפןSMZ800N
תמצית שמריםבקטון דיקינסוןREF. 212750
HH16000000

מקורות

  1. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
  2. Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
  3. Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26(2018).
  4. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  5. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135(2016).
  6. Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352(2018).
  7. Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
  8. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
  9. Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
  10. Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441(2018).
  11. Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
  12. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  13. Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290(2014).
  14. Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
  15. Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
  16. Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
  17. Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
  18. Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
  19. Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
  20. Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437(2017).
  21. Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
  22. Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  25. Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227(2015).
  26. Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791(2018).
  27. Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
  28. Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
  29. Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
  30. Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
  31. Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
  32. Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
  33. Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
  34. Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegansFITC DextranDIMOperettaHarmony

מאמרים קשורים