ניתוח של הקבוצה הרביעית ויראלית שימוש במבחנה ובשיטות סיליקו

עדות של העברה גנטית אופקית מווירוס לארח, או מארח לנגיף, ניתן למצוא במגוון של גנום^1,2,3,4. דוגמאות של האנדוזציה ויראלית הם רצפי מרווח crispr שנמצאו מארח חיידקי גנום⁴. לאחרונה, מצאנו ראיות של רצפי חלבון מארח מוטבע ב polyproteins שאינם מבניים של (+) ssRNA קבוצה הרביעי וירוסים. רצפים אלה בתוך אזורי הקידוד של הגנום הנגיפי ניתן להפיץ באופן כללי. הקטעים הקצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (sshhps) נמצאים בווירוס ומארח^5,6. SSHHPS הם באתר המחשוף שמרו רצפי מוטיב המוכרים על ידי הפרוטסים נגיפי כי יש הומולוגיה לחלבונים מארחים ספציפיים. רצפים אלה מכוונים את ההרס של חלבונים מארחים ספציפיים.

בפרסום הקודם שלנו⁶, הערכנו רשימה של כל החלבונים המארחים שהיו ממוקדים על ידי הפרוטסים ויראלי מצאו כי רשימת היעדים היה לא אקראי (שולחן 1). שתי מגמות היו בבירור. ראשית, רוב הפרוטסים ויראלי כי לחתוך חלבונים מארחים שייך לקבוצה הרביעי וירוסים (24 של 25 מקרים מעורבים הקבוצה הרביעית ויראלית), פרוטאז אחד שייך (+) ssRNA קבוצת השישי וירוסים (HIV, הנגיף החיסוני האנושי)⁷. שנית, מטרות החלבון המארח להיות גזור על ידי הפרוטסים נגיפי היו מעורבים בדרך כלל ביצירת התגובות החיסונית מולדים רומז כי ביקנים נועדו להרגיז את התגובות החיסונית של הפונדקאי. מחצית החלבונים המארחים ממוקדות על ידי הפרוטסים ויראלי היו רכיבים ידועים של מפלי איתות שיוצרים אינטרפרון (IFN) ו ציטוקינים proinflammatory (שולחן 1). אחרים היו מעורבים בתמלול התאים המארחים^8,9,10 או תרגום¹¹. מעניין, Shmakov ואח '⁴ הראו כי רצפי CRISPR רבים מתאים לגנים המעורבים בתוך בניין הפלבאמצע או שכפול⁴.

הקבוצה הרביעית כוללת, בין היתר, מפלאביריתיים, פיאורנרידיים, מאוזיים, כלוניים , וטוגוניים. מספר פתוגנים חדשים ומתפתחים שייכים לקבוצה IV כגון וירוס Zika (ZIKA), מערב הנילוס (WNV), Chikungunya (CHIKV), חמור תסמונת הנשימה הנשימתית וירוס (סארס) ואת תסמונת הנשימה המזרח התיכון וירוס (מרס). The (+) הגנום ssRNA הוא בעיקרו פיסת mRNA. כדי לייצר את האנזימים הנחוצים לשכפול הגנום, הגנום (+) ssRNA הראשון חייב להיות מתורגם. ב אלפא וירוסים ווירוסים הרביעי של הקבוצה, האנזימים הנחוצים לשכפול מיוצרים ב-polyprotein יחיד (כלומר, nsP1234 עבור VEEV). פוליפרוטאין שאינו מבני (nsP) הוא מעובד פרוטפוליסטי (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) על ידי פרוטאז nsP2 לייצר אנזימים פעילים¹² (איור 1). פצילות של פוליפרוטאין על ידי nsP2 פרוטאז חיוני עבור שכפול נגיפי; זה הוכח על ידי מחיקה ומוטזיס בבימויו של האתר של האתר הפעיל ציסטאין של nsP2 פרוטאז^13,14. בעיקר, את התרגום של חלבונים נגיפי לפני אירועי שכפול הגנום. לדוגמה, nsP4 מכיל rna התלוי רנ א פולימראז צורך לשכפל את (+) הגנום ssRNA. שכפול הגנום יכול לייצר dsRNA intermediates; intermediates אלה יכולים להפעיל את התגובות החיסונית מולדים של המארח. Thus, וירוסים אלה עשויים לקליב מארח מולדת תגובה חיסונית חלבונים בתחילת זיהום על מנת לדכא את השפעותיו^15,16,17.

השתקה יכולה להתרחש ברמה של דנ א, רנ א וחלבון. מה שמשותף לכל אחד ממנגנוני ההשתקה המוצגים באיור 1 הוא ה-DNA הזר הקצר, RNA או רצפי החלבונים משמשים כדי להנחות את ההרס של מטרות ספציפיות כדי להרגיז את תפקידם. מנגנוני ההשתקה הם מקבילה לתוכניות "חיפוש ומחיקה" שנכתבו בשלוש שפות שונות. רצף המחשוף הקצר הוא אנלוגי ל-"מילת מפתח". לכל תוכנית יש אנזים המכיר את ההתאמה בין הרצף הקצר ("מילת המפתח") לבין מילה ב"קובץ" שנמחק. לאחר שנמצאה התאמה, קיצוץ האנזים ("מוחק") את רצף היעד הגדול יותר. שלושת המנגנונים המוצגים באיור 1 משמשים להגנה על המחשב המארח מפני וירוסים, או כדי להגן על וירוס ממערכת החיסון של המחשב המארח.

הפרוטסים ויראלי לזהות מחשוף קצר באתר רצפי מוטיב בין ~ 2-11 חומצות אמינו; ב נוקלאוטידים, זה יתאים 6-33 בסיסים. להשוואה, רצפי מרווח crispr הם ~ 26-72 נוקלאוטידים ו rnai הם ~ 20-22 נוקלאוטידים^18,19. בעוד רצפים אלה קצרים יחסית, הם יכולים להיות מזוהים במיוחד. בהינתן מגוון גבוה יותר של חומצות אמינו, ההסתברות של אירוע מחשוף אקראי הוא נמוך יחסית עבור פרוטאז נגיפי הכרת רצפי חלבון של 6-8 חומצות אמינו או יותר. החיזוי של SSHHPS בחלבונים מארחים יהיה תלוי במידה רבה בספציפיות של הפרוטאז הנגיפי הנבדק. אם פרוטאז יש הדרישות הספציפיות רצף קפדנית הסיכוי למצוא רצף האתר מחשוף הוא 1/20⁶ = 1 ב 64,000,000 או 1/20⁸ = 1 ב 25,600,000,000; עם זאת, ברוב הפרוטסים יש אתר משנה טולרנסים (למשל, R או K עשוי להיות נסבל באתר S1). כתוצאה מכך, אין דרישה לזהות רצף בין הרצפים שנמצאו במחשב המארח לעומת הווירוס. עבור מיומנויות ויראליות כי יש דרישות רצף משוחרר יותר (כגון אלה השייכות Picornaviridae) ההסתברות למציאת אתר מחשוף בחלבון מארח עשוי להיות גבוה יותר. רבים מהערכים בטבלה 1 הם ממשפחת פיאורנריים .

&^{שכטר סימון} ברגר משמש בדרך כלל לתיאור השקעים במצע פרוטאז ולאתרי האתר שעליהם הם מאגד, אנו משתמשים בסימון זה לאורך כל הדרך. שאריות במצע כי הם N-טרמינל של scissile bond מסומנים P3-P2-P1 בעוד אלה הם C-טרמינל מסומנים P1'-P2' P3 '. אתרי האתר המתאימים בפרוטאז כי לאגד אלה חומצות אמינו שאריות הם S3-S2-S1 ו-S1'-S2'-S3 ', בהתאמה.

כדי לקבוע אילו חלבונים מארחים מיועדים, אנו יכולים לזהות את SSHHPS באתרי המחשוף הנגיפי פוליפרוטאין ולחפש את החלבונים המארחים המכילים אותם. להלן, אנו הליכי מיתאר לזיהוי SSHHPS באמצעות מחשוף הנגיפי פרוטאז האתר רצפים. השיטות הביותטיות, הפרוטאז, ובשיטות סיליקו המתוארות, מיועדות לשימוש בשילוב עם מספר מבוסס-תא.

מערכים רצף של החלבונים המארחים ממוקד על ידי הפרוטסים נגיפי חשפו מינים ספציפיים הבדלים בתוך אלה רצפי מחשוף קצר באתר. לדוגמה, וירוס דלקת קרום המוח של ונצואלה (VEEV) nsP2 פרוטאז נמצא לחתוך את TRIM14 האנושי, מוטיב ה tripartite COMMISSION (TRIM) חלבון⁶. כמה חלבונים TRIM הם גורמי הגבלה נגיפי (למשל, TRIM5α²¹), רובם נחשבים אוביקוויב E3 ליגסים. TRIM14 חסרה טבעת (גן מאוד מעניין באמת) התחום והוא אינו נחשב E3 ליגאז²². TRIM14 כבר הציע להיות מתאם בתוך הסימן האנטי ויראלי מיטוכונדריאני (MAVS)²², אבל אולי יש פונקציות אנטי ויראליות אחרות²³. היישור של רצפי TRIM14 ממינים שונים מראה כי הסוס חסר באתר המחשוף והנמל גרסה קטומה של TRIM14 כי הוא חסר את ה-C-terminal מתחם/SPRY. תחום זה מכיל אתר polyubiquitination (איור 2). בסוסים, וירוסים אלה הם קטלניים מאוד (~ 20-80% תמותה) ואילו בבני אדם רק ~ 1% למות מזיהומים VEEV²⁴. הפצילות של התחום לחטט/SPRY עשוי להיות קצר ביותר מעגל איתות מתחת ל-MAVS. מפל זה יכול להיות מופעל על ידי dsRNA ומוביל לייצור ציטוקינים אינטרפרון ו pro-דלקתיות. כך, הנוכחות של SSHHPS עשוי להיות שימושי לניבוי איזה מינים יש מערכות הגנה נגד וירוסים מסוימים הרביעי קבוצה.

בווירוסים של הקבוצה הרביעית, מנגנוני האנטוניזם של IFN נחשבים להכפלת²⁵מיותרים. מעטפת חלבון מארח עשוי להיות ארעי במהלך זיהום וריכוזים עשוי להתאושש לאורך זמן. מצאנו בתאים כי מוצרי המחשוף TRIM14 ניתן להבחין מוקדם מאוד לאחר החצייה (6 h) עם קידוד פלבמיד את פרוטאז (cytomegalovirus ירוס מקדם). עם זאת, בתקופות ארוכות יותר, מוצרי המחשוף לא זוהו. בתאים נגועים בווירוס, הקינטיקה היו שונים מוצרי המחשוף יכול להיות מזוהה בין 6-48 h⁶. אחרים דיווחו על הופעתו של מארח חלבון מוצרי מחשוף מוקדם ככל 3-6 h לאחר הזיהום^9,11.

פעילות פרוטחרדה בתאים לעתים קרובות קשה לתפוס; מוצרי המחשוף יכולים להשתנות באמצעות מסיסות, ריכוז, יציבות וחיים. בתוך תא מבוסס assays זה לא ניתן להניח כי מוצרי מחשוף יצטברו בתא או כי עוצמות הלהקה של החלבון גזור ומלא מלוטש יציג מגדילה הפיצוי ופוחתת כמו חלבון לחתוך עלול להיות מושפל מהר מאוד ולא ניתן לגילוי בכתם המערבי במשקל מולקולרי צפוי (MW) (למשל, האזור המכיל את האפירופה יכול להיות ביקע על ידי הפרוטסים מארחים אחרים או יכול להיות אוביקווילי. אם המצע של הפרוטאז הנגיפי הוא חלבון תגובה חיסונית מולדת, הריכוז שלה עשוי להשתנות במהלך הזיהום. לדוגמה, כמה חלבונים מולדים תגובה חיסונית נמצאים לפני זיהום נגיפי הם המושרה עוד על ידי אינטרפרון²⁶. הריכוז של חלבון היעד עשוי אפוא להשתנות במהלך הזיהום והשוואה של ליטים נגועים נגוע לעומת נגוע עלול להיות קשה לפענוח. בנוסף, כל התאים עשויים שלא להיות מזוהמים או נגועים בצורה אחידה. בתוך הפריה חוץ גופית פרוטאז שימוש בחלבונים מטוהרים מ -E. coli מצד שני יש פחות משתנים שעליהם לשלוט וכדומה יכול להיעשות באמצעות sds-PAGE במקום בלוק חיסוני. הפרוטסים מזהם יכול להיות מעוכב בשלבים המוקדמים של טיהור חלבון של המצע CFP/YFP, ומוטציה ויראלי הפרוטסים ניתן לטהר ונבדק כפקדים כדי לקבוע אם המחשוף נובע פרוטאז נגיפי או פרוטאז חיידקי מזהם.

מגבלה אחת של פרוטאז מחוץ לבית הספר היא שאין להם מורכבות של תא יונקים. כדי שאנזים יחתוך את המצע שלו, השניים חייבים להיות מותאמים לשיתוף. שונות ויראלית של קבוצה הרביעית במבנה ובלוקליזציה. לדוגמה, פרוטאז ZIKV מוטבע הממברנה האנדופלזמית (ER) הפנים ופרצופים ציטוסול, בעוד הפרוטאז VEEV nsP2 הוא חלבון מסיס בציטופלסמה ו גרעין²⁷. חלק מהמחשוף שנמצאו בניתוח ZIKV SSHHPS היו בפפטידים של אותות הרומזים כי המחשוף עלול להתרחש במשותף למטרות מסוימות. כך, המיקום של פרוטאז ואת המצע בתא גם צריך להיחשב בניתוחים אלה.

בחני מבוסס התא יכול להיות בעל ערך עבור הקמת תפקיד עבור חלבון מארח מזוהה (s) זיהום. שיטות שמטרתן לעצור מחשוף פרוטאז ויראלי של חלבונים מארחים כגון תוספת של מעכב פרוטאז⁶ או מוטציה ביעד המארח¹⁶ ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות שלהם על שכפול נגיפי. ביטוי יתר של חלבון ייעודי גם עלול להשפיע על שכפול נגיפי²⁸. הפלאק אומר או שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לכמת שכפול נגיפי.

1. ביואינפורמטיקה: זיהוי של SSHHPS בגנום מארח באמצעות הפיצוץ

הערה: הפיצוץ חלבון ניתן למצוא ב blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

1. קלט ~ 20 חומצות אמינו המקיפים את הקשר scissile ב polyprotein ויראלי. בחר רצפי חלבון שאינם יתירים והקלד את הגנום המארח כדי לחפש (למשל, הומו ספיינס).
   1. במידת הצורך, בחר פי-הפיצוץ. הקלד רצף תבניות (לדוגמה, עבור 25 שאריות של רובוטית v12 המוצג להלן להזין את התבנית "AG" ללא ציטוטים).
      
      
      
      הערה: ב-PHI-הפיצוץ, סוגריים מרובעים [XY] לציין כי חומצת אמינו X או Y יכול להיות במיקום אתר המשנה (למשל, AG [AC] [גיי]).
   2. בדוק את תוצאות הפיצוץ ולזהות את הלהיטים בעלי זהות רצף גבוה לשקעים הנשמרים באתרי המחשוף הפוליפוניים (למשל, חלבון מוטיב טריפרטיטה 14) (איור 3).
      הערה: עבור סרין פרוטסיס שימור גבוה יותר של שאריות P1 הוא צפוי, ואילו עבור ציסטאין הפרוטסייסים שימור גבוה יותר של שאריות P2 הוא צפוי.
   3. צבעו את השקעים הזהים לרצף של אתר מחשוף והם בסדר רציף (ללא רווחים). צבעו את השקעים הנסבלים באתר המשנה, אך הציגו באתר מחשוף אחר בצבע שני.
      הערה: שאריות המייצגים תחליפים שמרנים (למשל, מLeu vs. Val) שאינם נוכחים באתר מחשוף ויראלי ניתן למצוא, או שאינם מזוהים על ידי הפרוטאז הנגיפי.
   4. להורות על הפיצוץ להיטים בהתבסס על מספר שאריות זהים או נסבל ברציפות התואמים רצף האתר מחשוף. מתוך הרשימה, בחר את החלבונים המכילים ≥ 6 שאריות זהים או דומים לניתוח ב פרוטאז assays.
   5. חזור על ההליך עבור אתרי המחשוף האחרים (nsP2/3, nsP3/4, וכו ') ויחזק בהדרגה את החיזוי על-ידי הוספת משקעים שאינם מנוהלים יותר לתבנית פי-הפיצוץ.

2. בתוך מחוץ לספר: עיצוב והכנת מצעים פרוטאז

1. בניית פלאמיד קידוד חלבון פלורסנט ציאן (CFP), ≤ 25 חומצות אמינו של רצף האתר המחשוף, ואחריו חלבון פלורסנט צהוב (YFP, הידוע גם בשם ונוס²⁹).
   הערה: ניתן לבנות את הפלמיד באמצעות רצף ושיבוט עצמאי (SLIC)³⁰ או סינתזה גנים מסחריים. פלpet15b בינוני המכיל את הרצף המוצג באיור 4 היה מסונתז מסחרית ושימש כאן.
   1. כדי למטב את אורך המצע, לבנות באורך משתנה נוסף מצעים המכילים 12-25 חומצות אמינו של הטבעי ויראלי מחשוף מפצילות האתר באמצעות התגובה SLIC 2 קטעים. ניתוח מחשוף באמצעות שיטת SDS-דף מבוססי ג'ל או על ידי מדידת הפרמטרים של מצב יציב קינטי באמצעות שיטות להלן.
      הערה: במקרים מסוימים, אתרי המחשוף ניתן לזהות על ידי הומולוגיה לאתרי המחשוף הידועים³¹. אם המחשוף של מצעים המכילים את רצפי הצומת polyprotein לא נצפתה, ייתכן שיש דרישה עבור שאריות נוספים או מוטיב מבניים (g.,³²alpha סליל). לחילופין, פרוטאז ויראלי מטוהר יכול להיות פעיל. לאשר את המחשוף של רצפי פוליפרוטאין נגיפי לפני שרודפים SSHHPS ניתוח. מספר השקעים במצע היה מותאם עבור הפרוטאז הווייב באמצעות מצעים באורך משתנה (12 עד 25 חומצות אמינו) ולאחריו ניתוח של V_max ו-K_m^32,33. הns2B/nsb של המחשוף הנגיפי בשימוש בדוגמאות פורסמו^34,35.
2. להכין את מצעים CFP/YFP על ידי שינוי טרי 8-20 μL של BL-21 (DE3)E. coliתאים מוכשרים עם CFP-רובוטית v12-YFP פלמיד על פי הוראות היצרן ועל צלחת על לוריא ברטני (LB) אגר צלחות המכילות 50 μg/mL אמפיצילין (37 ° c).
   1. אוטוקלב ארבע 4 מבחנות L המכיל מדיה LB (1.5 L מדיה לכל בקבוקון) ו 100 mL של LB בבקבוקון 250 mL. כובע כל בקבוקון עם רדיד אלומיניום.
   2. איחסן את תרבות 100 mL עם מושבה של חיידקים טריים שעברו שינוי ולצמוח ב 37 ° צ' עם טלטול (200 rpm) לילה.
   3. כדי להפוך את המצע CFP/YFP, האיחסן ארבע ארבע מבחנות עם 25 מ ל של תרבות לילה. התחל לטלטל את התרבויות ב 37 ° צ' ולפקח על הצמיחה על ידי UV-vis ספקטרוסקופיה ב 600 ננומטר שעה.
   4. כאשר החיידק מגיע לספיגה של ~ 1.0 ב 600 nm (כ ~ 3-4 h של הצמיחה) לגרום חלבון ביטוי על ידי הוספת 0.5 mL של 1 M איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לבקבוקון. לאחר הוספת IPTG, להקטין את הטמפרטורה של האינקובטור לרעוד ל 17 ° c ולאפשר ביטוי להמשיך למשך הלילה עבור 17-20 h.
   5. גלולה החיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 7,000 x g עבור 10 דקות (4 ° c) ולשמור את כדורי. הסר והתעלם ממדיה נוזלית. אחסן את כדורי ב-80 ° c או lyse באופן מיידי.
   6. להכין 100 mL של מאגר הליזה המכיל 50 mM Tris pH 7.6, 500 mM הנאל, 35 mL של חלבון חיידקי החילוץ מגיב, 30 מ"ג של lysozyme, 25 U של DNase, ו 1 הלוח מעכב פרוטאז. השהה מחדש את כדורי במאגר הליזה עם פיפטה והעברה של ~ 25-35 mL לתוך 50 mL מנורות חרוט חד פעמיות.
   7. מניחים את הצינורות בתוך גביע פלסטיק המכיל מי קרח. הכנס את העצה sonicator לתוך הצינורות כך הטיפ הוא ~ 1 ס מ מהחלק התחתון של הצינור וsonicate lysates 10-20 פעמים ברמה 5 עבור מרווחי 15 s עד ליפוסט הופך נוזל מעובה.
      הערה: השתמש בהגנת שמיעה במהלך sonication.
   8. העבר את ליפוסט לצינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה וצנטריפוגה ב 20,500 x g עבור 30 דקות ב 4 ° c. לאחר הספין, לשמור על supernatant (~ 100 mL) ולהעביר אותו לבקבוק נקי. להיפטר כדורי.
   9. להכין 1 L של מאגר A (50 mM טריס pH 7.6, 500 מ"מ הנאל). להכין 300 mL של מאגר B (50 mM טריס pH 7.6, 500 mM הנאל, 300 מילימטר).
   10. באופן שולי מ100 עמודת ניקל mL באמצעות 3 כרכים של עמודות של מאגר A ושיעור זרימה של 5 מ"ל/min.
   11. טען את הליפוסט על עמודת הניקל באמצעות קצב זרימה של 2 עד 5 mL/min. שטוף את העמודה עם 2 אמצעי אחסון של עמודות של ' מאגר A ', ולאחר מכן על-ידי כרכים של ~ 5 עמודות של 20% מאגר B. במהלך שטיפת האגירה ב-20%, הספיגה ב-280 nm (A₂₈₀) תגדיל כמזהמים מתוך הטור במהלך השטיפה. המשך לשטוף את הטור עד_ש280 של הללויה חזרה לערכים בסיסיים.
   12. Elute החלבון עם 2-3 כרכים העמודה של 100% מאגר B באמצעות קצב הזרימה של 2-5 mL/min ולאסוף 10 מ"ל שברים. מדוד את ה-A₂₈₀ של כל שבר.
   13. לשלב ולרכז שברים המכילים A₂₈₀ > 0.1 באמצעות יחידת אולטראפילטרציה בעלת 15 מ"ל. סובב את יחידות האולטרה-סינון ב-5,000 x g עבור 15 דקות והמשך להוסיף שברים עד שעוצמת הקול הופחתה ל ~ 50-75 mL.
   14. גזור 14 פיסת אינץ ' של אבובים דיאליזה עם משקל מולקולרי לגזור (MWCO) של 6-8 kDa. מימה צינורות דיאליזה על ידי הרתיחה אותו לגמרי שקוע 300 mL של מים עבור 10 דקות. לקשור קשר מאובטח בקצה אחד של הקרום. מלא את התיק עם מאגר דיאליזה כדי לוודא שאין סדקים או דליפות. הסירו את החוצץ מהתיק ושמרו את התיק מתחת למאגר הדיאליזה.
   15. להעביר את החלבון מרוכז מ2.2.13 לתוך שקית הדיאליזה עם פיפטה פלסטיק. להסיר בועות אוויר מהתיק. סגור את השקית בקשר שני או באטב דיאליזה. Dialyze החלבון נגד 500 mL של 50 mM טריס pH 7.6, 5 מ"מ EDTA (החומצה האטיניבית של התרופה), 250 mM בשנת בשנת בשנת בשנת בשנת 4 500 מעלות גליל לילה ב -4 ° c.
   16. Dialyze חלבון פעם שנייה נגד 500 mL של 50 mM טריס pH 7.6 ב 4 ° צ' עבור 2 h.
3. עבור העמודה אניון exchange להכין 500 mL של מאגר A (50 mm טריס ph 7.6) ו 500 mL מאגר B (50 mm טריס ph 7.6, 1.0 M הנאל). באמצעות השפה 30 mL החלפת עמודה עם 3 כרכים עמודה של מאגר A (2-5 mL/min).
   1. הסירו את החלבון משקית הדיאליזה והעבירו אותו לבקבוק. . תשאיר את הבקבוק על הקרח טען את החלבון דיאליזה על העמודה (2-5 mL/min).
      הערה: החלבון CFP/YFP יהיה לאגד את העמודה יהיה צהוב במראה.
   2. שטוף את העמודה באמצעות ' מאגר A ' עד_ש280 מחזירה לתוכנית הבסיסית (5 מ"ל/דקה). Elute החלבון באמצעות מעבר צבע (0-50% מאגר B, 100 mL) ולאסוף 10 מ"ל שברים.
   3. בדוק את שברי העמודות באמצעות SDS-PAGE. שלבו את אלה ש> 95% טהורים.
   4. רכזו את החלבון ל-A₂₈₀ ~ 10-20 באמצעות יחידת בדיקת אולטרה-מדיה צנטריפוגלית 15 mL. סובב את הרכז ב 4,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c ולהמשיך להוסיף חלבון עד כל שברים המכילים חלבון שולבו.
4. הסר בזהירות את החלבון מהרכז עם פיפטה. מחלקים את החלבון לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL והקפאת הבזק בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c. המאגר מחליף את החלבון בטמפרטורת החדר באמצעות טור של PD-10 הכולל את מאגר התאים המתאים לפני השימוש.
5. השימוש בחוק בירה מחשב את ריכוז החלבון באמצעות A₂₈₀ ומקדם השמדה מחושב (למשל, עבור המצע רובוטית v12 ɛ = 47,790 M^{-1 ס מ -1)}.
   הערה: ניתן לחשב את מקדם ההשמדה (ɛ) מתוך רצף החלבונים באיור 4 באמצעות התוכנית Expasy פרוטוכאראם (https://web.expasy.org/protparam/).

3. הכנת האלפא ויראלי nsP2 ציסטאין פרוטאז

1. עיצוב ובניית פלסמיד קידוד הפרוטאז. עבור הפרוטסים ציסטאין, השתמש בpet32 פלמיד לבניית חלבון היתוך thioredoxin (trx).
   הערהPet32 באמצע מקודד באתר מחשוף הטרומבין (LVPRGS) להסרת thioredoxin ו-שלו-tag (איור 5). Thioredoxin יסייע לשמור על האתר הפעיל ציסטאין במצב מופחת במהלך הביטוי. עבור סרין פרוטסיס, thioredoxin אינו נחוץ ושלבים הכרוכים בהסרת התרומבין ניתן להשמיט. רצף הפרוטאז VEEV nsP2 שולב לתוך פלביניים pet32b כי היה מוכן מסחרית כדי למנוע טיפול סוכני בחירה.
   1. שינוי טרי ה-DNA פלמיד לתוך BL21 (DE3) החיידק של א. קולי לפי כיווני היצרן. צלחת חיידקים על LB אגר צלחות המכילות אמפיצילין.
      הערה: כלורמפאנסול משמשת רק עבור זנים E. coli הנושאים את פלאאס פלמיד והוא מושמט אם BL21 (DE3) תאים משמשים. אין צורך לכלול כלוראמאנקול על לוחית LB אגר בשלב זה.
   2. אוטוקלב ארבע 4 ליטר מבחנות של 1.5 L של LB מדיה (6 L סה כ נפח) ו 100 mL של LB בבקבוקון 250 mL. כובע כל בקבוקון עם רדיד אלומיניום.
   3. איחסן 100 mL לילה התרבות של LB/אמפיצילין עם מושבה מן הצלחת ולצמוח בחממה רועדת (200 rpm) ב 37 ° c.
   4. לחישוב 4 L מבחנות עם 25 מ ל של תרבות הלילה ולהוסיף את האנטיביוטיקה המתאימה.
      הערה: התקשורת עבור BL21 (DE3) התאים הנושאים את הפלזמה pet32 צריך להיות ריכוזי הסופי של 25 μg/mL כלורמפנול ו 50 μg/mL אמפיצילין.
   5. לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת 0.5 mL של IPTG לתרבות כאשר ספיגת ב 600 ננומטר מגיע 1.0. הנמך את הטמפרטורה של האינקובטור הרועד ל -17 ° c. אפשר לביטוי להמשיך למשך הלילה (~ 17 שעות).
   6. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (7,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c). הסר והשמט את המדיה הנוזלית.
      הערה: את כדורי ניתן לאחסן ב-80 ° c במשך חודשים או מיידית.
   7. להכין 100 mL של מאגר הליזה (50 mM Tris pH 7.6, 500 mL הנאטו, 2 מ"מ ביתא רקפטואתנול (bme), 30 מ"ג lysozyme, 5% גליצרול, 25 U dnase, 35 mL בקטריאלי חלבון החילוץ מגיב). פתח בקבוקים של BME בשכונה כימית בעת הוספת. לשמור על החיידקים למטה בקרח או ב 4 ° c עבור זה ואת כל הצעדים הבאים.
      הערה: עבור הפרוטסים ציסטאין, 2 מ"מ bme הוא כלול כדי לשמור את cystehilic ציסטטין מופחת. ניתן להפעיל את העמודות בטמפרטורת החדר באמצעות מאגרים מצוננים. יש לעשות את המאגרים עם מים קרים שעברו התקררות עד 4 ° c.
   8. השהה מחדש את כדורי החיידקי ב-~ 25 מ ל של מאגר הליזה והעבר ~ 25 מ ל של ליפוסט לתוך 4 x 50 mL שפופרות חרוט חד פעמיות. מניחים את הצינורות לתוך כוסות פלסטיק המכילות מי קרח. Sonicate the ליפוסט 10 פעמים ברמה 5 עבור מרווחי 15 s.
   9. העבר את הליפוסט לצינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה. להבהיר את הליפוסט על ידי צנטריפוגה (30 דקות, 20,500 x g ב 4 ° c).
   10. להכין 0.5 L של מאגר A (50 mM טריס pH 7.6, 500 mM הנאקל, 5% גליצרול, 2 מ"מ BME) ו להתקרר עד 4 ° c.
   11. להכין 250 mL של מאגר B (50 mM טריס pH 7.6, 500 mM הנאל, 5% גליצרול, 2 מ"מ BME, 300 מ"מ) ו להתקרר 4 ° c.
   12. באמצעות שפות של 50 mL עם שלושה כרכים של עמודות של מאגר A. טען את הליפוסט הבהיר על העמודה ב 2-5 mL/min ולמחוק את כדורי.
   13. שטוף את העמודה (2-5 mL/min) עם 2 כרכים של עמודות של מאגר A ואחריו 5 כרכים של עמודות של מאגר A המכיל 20% מאגר B (60 מ"מ הסרמדול). Elute החלבון (5 מ"ל/min) עם 100% מאגר B ולאסוף 10 מ"ל שברים.
   14. לשלב ולרכז שברים המכילים את הפרוטאז כי יש₂₈₀ ≥ 0.1 באמצעות 15 מ"ל יחידת בדיקת אולטרה-מדיה צנטריפוגלי ו 15 דקות ספינים ב 5,000 x g ב 4 ° c. לאחר שעוצמת הקול הופחתה ל-~ 5 mL, החלפת המאגר החלבון ביחידת הריכוז על-ידי הוספת מאגר דיאליזה טרי לחלבון (50 mM Tris pH 7.6, 250 מ"מ הנאטו, 5% מילימטר הדקט (DTT), 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול). ספין שוב ב 5,000 x g ב 4 ° צ' עבור 15 דקות; חזור על שלב החלפת המאגר 2-3 פעמים. הוסף את התרומבין לחלבון (20 μL של 1 יחידה/μL) לפני דיאליזה כדי להסיר את ה-thioredoxin ואת התגית שלו.
   15. להעביר את החלבון לתוך שקית דיאליזה ו dialyze נגד 500 mL של מאגר דיאליזה (4 ° c) ב 500 mL בוגר גליל לילה.
       הערה: Fplc (חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלי) המערכת ואת העמודה ניקל צריך להיות נקי ביסודיות עם מאגר להתפשט (2 M הנאל, 50 mM edta) לפני שתמשיך לטור החליפין אניון. כל ניקל שיורית בקווים FPLC תהפוך את פתרונות המאגר המכילים את החום DTT כאשר מעורבים. שטוף את עמודת הניקל ומערכת FPLC עם 4 כרכים של מים בעמודות. משאבה לשטוף את מערכת FPLC ביסודיות עם מים. את עמודת ניקל ניתן ליצור מחדש על ידי זורם 2 כרכים העמודה של 0.2 M ניקל סולפט מעל שרף עבור הפורימות הבאים.
2. עבור העמודה החלפת הטור להכין 1 L של מאגר A (50 mM טריס pH 7.6, 5 מ"מ DTT, 5% גליצרול).
   1. להכין 0.5 L של מאגר B (50 mM טריס pH 7.6, 5 מ"מ DTT, 5% גליצרול, 1.25 M הנאל).
   2. באמצעות השפה a 30 mL החלפת טור עם מאגר A (3 כרכים עמודה, 2-5 mL/min). הניחו את הצינורות באספן השברים לאיסוף הזרימה.
      הערה: פרוטאז VEEV יש נקודה איזואלקטריים מחושב (pI) של 8.7 ויהיה לאגד עמודות היון החליפין אבל יזרום באמצעות החלפת עמודות החליפין. ניתן לחשב את ה-pI מתוך רצף החלבונים באמצעות התוכנית של Expasy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/).
   3. לדלל את חלבון דיאליזה 1:3 עם מאגר A, ולאחר מכן לטעון את החלבון (5 מ"ל/min). לאסוף את הזרימה בתוך 10 מ"ל שברים.
3. הסר את העמודה אניון exchange מהמערכת fplc. חבר עמודת החלפת קטיון למערכת FPLC. באמצעות שקופיות של 30 מ ל טורים בהחלפת הקטיון עם 3 כמויות עמודות של מאגר A (5 מ"ל/min).
   1. טען את הזרימה באמצעות עמודת החליפין של אניון אל עמודת חילופי הקטיון ב-2-5 mL/min. שטוף את העמודה באמצעות ' מאגר a ' עד שהפונקציה A₂₈₀ תחזור לרמה הבסיסית. Elute חלבון עם 100 mL הדרגתי (0-50% מאגר B) ולאסוף 10 מ"ל שברים.
      הערה: פרוטאז ה-VEEV ייוט בסביבות 0.6 מ ' הנאל.
   2. בדוק את שברי העמודות באמצעות SDS-PAGE. לשלב שברים כי הם > 95% טהור ולהתרכז A A₂₈₀ ≈ 2 באמצעות 15 mL ביחידות בעלי האולטרמגלית. האנזים יכול להיות מוקפא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב-80 ° c.

4. לומר את האנזים ברציפות באמצעות קורא לוחית

1. הכינו 50 מ ל של מאגר השיטת (50 מ"מ HEPES pH 7.0).
   1. כמו מגמות אלפא ויראליות יש יחסית נמוך בערכים k_החתול , לדלל את האנזים במאגר הקושי כדי 4.7 μm (זה יהיה בערך להתאים A₂₈₀ = 0.2 על הפרוטאז Veev ללא trx).
   2. כדי למדוד את הפעילות של האנזים, להכין מלאי של מצע במאגר היכולת עם ריכוז של 185 μM; זה יהיה בערך להתאים A A₂₈₀ = 9. ב 8 מיקרוצנטריפוגה צינורות, להכין את תערובות התגובה המוצגת בטבלה 2 על ידי שילוב של אמצעי האחסון המתאימים של 185 μm מלאי המצע ומאגר. בחצי אזור שחור 96-באר pipet 45 μL של התגובה mixes ל 3 בארות (עמודות 1, 2, 3). שורה A צריכה להכיל את המיקס [S] = 5 μM, ו-H Row צריך להכיל את [S] = 140 μM ערבוב התגובה.
   3. הגדר את קורא הצלחות כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית בו בשני אורכי גל עם הגדרה קבועה של צינור הפוטוסולייר (PMT) (למשל, נמוך):
      גל 1 עירור = 434 nm, פליטה = 527 nm
      גל 2 עירור = 434 nm, פליטה = 470 nm
   4. הגדר את זמן הקריאה כ-20 דקות (מדידה 1 לקריאה בדקה) ובחר את הבארות לקריאה. הכנס את הצלחת לתוך הקורא לוחית למדוד את הקצב הספונטני של הידרוליזה עבור 20 דקות. נטר את יחסי הפליטה (פליטה ב 527/פליטה ב-470) עם הזמן.
   5. הפעל נקודת קצה שנקראה הלוח המכיל את המצע "לא מלוטש".
      הערה: ערכים אלה ישמשו בחישובי נתונים עוקבים. הממוצע של יחסי הפליטה מ 3 בארות יהיו הערכים של המצע "נימולים" ב-t = 0 בטבלה 3.
   6. הסר את הצלחת ואת pipet 5 μL של אנזים לתוך כל טוב. קרא את הלוחית שוב למשך 20 דקות עם 1 קריאה בדקה. הגדר את קורא הצלחות כך שייפלט ערכים מוחלטים.
      הערה: לצורך שיטת הפעולה הזו, המדרונות יהיו שליליים. כל טוב יכיל נפח כולל של 50 μL.
   7. בסוף הקריאה, לאטום את הצלחת עם הסרט כדי למנוע אידוי. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר לילה כדי לאפשר לאנזים לחתוך את המצע לחלוטין.
   8. לאחר ~ 24 h, הסר את הסרט איטום ובצע נקודת קצה לקרוא את הצלחת באמצעות אותו PMT כמו בלוחות הקודמים. ממוצע יחסי הפליטה והקלט לטבלה 3 תחת "גזור". לאשר את המחשוף של המצע באמצעות שיטת SDS-עמוד לא רציף המתואר להלן (שלב 5.1.).
   9. יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. פלט יחידות הזריחה בכל נקודה עבור 2 אורכי גל (שולחן 4).
   10. לחשב את nmol של מצע שנחתכו בזמן t באמצעות משוואה (1) שבו X הוא יחס הפליטה (527 ננומטר/470 ננומטר) בנקודת זמן נתונה, שלילי הוא יחס הפליטה של המצע "נימולים" ב-t = 0, ו- pos הוא יחס הפליטה של המצע "cut" לחלוטין נמדד לאחר 24 h של גזירה (שולחן
       
       
       
       הערה: נתוני הנציגה הפלואורסצנטית מוצגים עבור אחד טוב (גם E7) המכיל 80 μM המצע (4 nmol של S לכל טוב) בטבלה 4. החישובים נערכו עבור כל טוב בצלחת.
   11. עבור כל טוב, עלילה לעומת הזמן (דקות) ולהשיג את המהירויות הראשוניות (מדרונות) על ידי התאמת הנתונים y = mx + b. עבור הנתונים שנאספו ב 4.1.5, עלילה nmol לעומת זמן (דקות) עבור כל באר. השיפוע יהיה שווה למוצר הנמול המיוצר לדקה. הפחת את שיעורי ההידרוליזה הספונטניים הנמדדים ב4.1.5 משיעורי התגובה לזרז האנזימים (שולחן 5).
       הערה: ניתן לחתוך את הקריאה הראשונה מהנתונים אם היא גבוהה ביותר עקב תנועת הצלחת לתוך קורא הלוחית.
   12. לחשב את כמות האנזים ב-mg שנוספו לכל טוב (למשל, 0.0009 mg). יחידה מוגדרת כ-μm של מוצר המופק לדקה (μמול/דקות). לחלק את nmol/מינימום על ידי mg של אנזים נוכח בבאר כדי להשיג mU/mg; לחלק על ידי 1,000 כדי לקבל U/mg.
   13. מגרש [S] μM על ציר x ו-U/mg על ציר ה-y ולהתאים את הנתונים למשוואה מייקל-מנטה כדי להשיג V_max ו-K_m. ניתן לעשות זאת בתוכנה (למשל, GraFit).

5. לומר את האנזים ללא הפסקה באמצעות SDS-ניתוח עמודים

1. הכנת תגובת 50 μL המכיל 10 המצע μM ומאגר במקום אנזים ותווית כמו "לא מלוטש."
   הערה: אמצעי האחסון של המצע והמאגר מוצגים בטבלה 2. אם השימוש המתמשך הופעל, ניתן להשתמש בדגימות ישירות מלוחית 96.
   1. להכין תגובה 50 μL המכיל 10 המצע μM ו 5 האנזים μL ותווית כמו "גזור". הפעל את שעון העצר כאשר האנזים נוסף למצע.
      הערה: מעכבי ניתן להוסיף צינורות נוספים המכילים אנזים ומצע. כוונן את עוצמת הקול של מאגר נוסף כדי לפצות על נפח המעכב שנוסף. ריכוזי DMSO לא יעלה על 2%.
   2. דגירה התגובות עבור ~ 15-24 h בטמפרטורת החדר (22 ± 3 ° c). להפסיק את התגובות על ידי הוספת 50 μL של מאגר 2x Laemelli. לאחר עצירת התגובה הרתיחה, כל צינור עבור 3-10 דקות.
   3. הכנס את מיכל הג בהתאם להנחיות היצרן. הכנס מקדמה של 17% היטב לפני שחקנים בקסטה של 12% פוליאקרילמיד וסכר מאגר בצד השני. מלא את מאגר הפנים של התא עם מאגר הפעלה של 1x SDS עד שהמאגר מגיע לראש הקלטת. מלא את המאגר החיצוני חצי מלא עם אותו מאגר.
   4. כדי לנתח את המחשוף באמצעות שימוש בלתי רציף, טען 5 μL של כל תערובת התגובה לנתיב של הג SDS-עמוד מתחיל עם התגובה "נימולים". כלול סמן משקל מולקולרי בנתיב הראשון או האחרון.
   5. לצרף את האלקטרודות של הטנק ג'ל לספק כוח ולהפריד את המוצרים ב 110 V עבור 60 דקות. להסיר את ג'ל מתוך הקלטת על ידי הוספת כלי פיצוח בין לוחיות. הניחו את הג במגש פלסטיק והשקיעו את הג ב-5-10 מ ל של פתרון הצביעת ג'ל; להקות יהיו גלויות בתוך 30 דקות. לאחר 1-24 שעות להסיר את הכתם עודף, להטביע את הג במים ולהשתמש באיג'ר ג'ל לצלם את הג.

6. עגינה פפטידים למצע VEEV-nsP2 Cysteine פרוטאז

1. הורד את קובץ הקואורדינטות של ה-veev ציסטאין פרוטאז מ-PDB (https://www.rcsb.org/). . הקוד מספר 2 שבוע שמור את הקובץ כ-2H. pdb.
   1. הכן את מבנה החלבון באמצעות מו (https://www.chemcomp.com/). טען את קובץ ה-PDB בחלבון ל-מו. לחץ על בחירה והממס בצד ימין ליד הסרגל ולמחוק את הממס.
   2. פתחו את לוח ההכנה של המבנה מחלבוןשורת התפריטים העליון. לתקן באופן אוטומטי את כל הפריטים מבניים על ידי לחיצה על נכון protonate המבנה על ידי לחיצה על Protonate3D. הוסף חיובים חלקיים לחלבון על-ידי פתיחת לוח חיובים חלקיים ובחירה בענבר 99 והתאם הידרוגנים וזוגות בודדים לפי הצורך. לבסוף, שמור את קובץ המבנה כ-"2HWK_dock. pdb".
2. לבנות את המבנה של פפטידים המצע (nsP12, nsP23, nsP34) ו TRIM14 באמצעות מו. פתחו את החלונית ' בונה חלבונים ', הזינו את רצף המצע, קבעו את הגיאומטריה כמורחבת ולחצו על ' בנה '. המבנה יוצג בחלון מו.
   1. מזער את מבנה פפטיד על ידי לחיצה על מזער בלוח. שמור את המבנה כקובץ PDB (איור 6).
3. עגן את פפטידים המצע ל VEEV-nsP2 באמצעות PyRx/AutoDock 4.2 (http://autodock.scripps.edu/). פתח את הכלי PyRx, ערוך את הגדרת ההעדפה, הפעל את כל הטורסיות עבור Ligand הכנה. טענו את מולקולת המצע, לחצו לחיצה ימנית על שם המולקולה בחלונית ' ניווט ', בחרו ' הפוך לליגו'כדי להכין את קובץ העגינה. טען את החלבון 2HWK_clean. pdb, ובחר באפשרות ' בצע מקרומולקולה ' כדי להכין את קובץ העגינה pdbqt (איור 7).
   1. הפעל את אשף העיגון האוטומטי בלוח העגינה שבתחתית. בחר את קבצי הליפה והחלבון המוכנים. הגדר את כיס כריכת החלבון על ידי כוונון ידני של ממד הרשת אשר ממורכז בשאריות קטליטי Cys-477. שימוש בפרמטר הריווח המוגדר כברירת מחדל 0.375 Å. לחץ על הפעל רשת אוטומטית כדי ליצור מפות רשת.
   2. הפעל את האפשרות הפעלה אוטומטית ובחר בשיטת האלגוריתם הגנטי לאמארקקיאן (lga). לחץ על פרמטרי עגינה ולהגדיר את מספר ה-GA רץ 50. השתמש בפרמטרי ברירת המחדל עבור אחרים. לחץ על קדימה כדי להתחיל את הפעלת העגינה.
   3. פתחו את החלונית ' ניתוח תוצאות '. בדוק את כל תנוחות האיגוד החזוי. בחר את המודל הטוב ביותר עם האנרגיה הכריכה החזוי הנמוכה ביותר ואינטראקציות מחייבות סבירות בין Cys-477 ומצע באתר המחשוף. שמור את מודל האיגוד כקובץ PDB עבור סימולציות נוספות של MD.

7. MD סימולציות של מתחמי מעוגנים VEEV-מצע

1. הכן את קבצי הקלט באמצעות ענבר (http://ambermd.org/). בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי, הדמיות MD מתבצעות עבור דגמי איגוד המצע החזוי באמצעות חבילת ה-AMBER והשדה ff99SB force.
   הערה: מערכות מקבילות הם חשופים מזעור אנרגיה יסודית לפני סימולציות MD. תנאי גבול תקופתיים מוחלים על מנת לדמות מערכת רציפה. רשת החלקיקים שיטת אוואלד (PME) הועסק כדי לחשב את האינטראקציות האלקטרוסטטית לטווח ארוך. מערכת הסימולציה התחילה להיות בטמפרטורה הדרגתית להגדיל מ 0 K כדי 300 K מעל 100 ps, ולאחר מכן שיטה עבור 500 ps ב 300 K, ואחריו פועל הייצור של 2 ns אורך בסך הכל.
   1. הפעל את משימת ההדמיה במתקן מחשוב בעל ביצועים גבוהים. הסימולציות שלנו הפועלות באשכול Biowulf (https://hpc.nih.gov/) (איור 8).
   2. המחש את פלט המסלול באמצעות תוכנית VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). לנתח את האינטראקציות הקשירה ולשנות את השינויים הTRIM14 בתוך האתר הפעיל של nsP2 (איור 9).

SSHHPS ניתוח של ZIKV ns2B/3 פרוטאז מזוהה 4 מטרות חלבון מארח: FOXG1, SFRP1, יחידת משנהאלפא של G מספריית cdna רשתית, ואת מיטוכונדריאל NT5M 5 ', 3 '-nucleotidase (איור 10)6. בעיקר, אין שיטה אחרת ניבא חלבונים אלה כמטרות פוטנציאליות של פרוטאז ZIKV. מוטציות בגן FOXG1 קושרו לתסמונת מולדת המאופיינת על ידי פיתוח לקוי וחריגות המוח מבניים כגון microcephaly. SFRP1 הוא חלבון מופרש הקשור ביניהם (SFRP); אלה קולטנים מסיסים יכולים לאגד בתחרותי Wnt ליגנדס להרגיז ולעכב איתות Wnt. מסלול ה-Wnt איתות מעורב בוויסות התגובה IFN במהלך זיהום36Flavivirus. המחשוף של SFRP1 צפוי לשפר את שכפול וירוס flavivirus. SFRP1 מעורב גם ב Th17-cell בידול37. מערכים הרצף של SSHHPS הראו הבדלים ספציפיים למינים בתוך רצפי האתר מחשוף (איור 10ד). רצף המחשוף בSFRP1 היה זהה בבני אדם ותרנגולות; ZIKV יכול לגרום לתמותה ו microcephaly ב העוברים עוף38. ב מכרסמים, שאריות P1 מאוד שמרו (K/R) R ↓ G הוא הוחלף על ידי גליצין (RGG). זנים אימונומוסמכים של עכברים עמידים בדרך כלל כדי זיהום ZIKV ומחלות39.

יציב המצב הקינטי פרמטרים וקבועים עיכוב ניתן למדוד עבור רצפי פוליפרוטאין נגיפי ועבור רצפי חלבון מארח באמצעות הסדר הרציף בקורא לוחית31,40,41 (איור 11א). למידע על מחשוף איכותי, כגון מחשוף של רצף מסוים או עיכוב של הפרוטאז באמצעות תרכובות שונות, ניתן להשתמש באופן שאינו רציף (איור 11ב).

אופטימיזציה של מספר שאריות בין CFP ו-YFP עשוי להידרש. ניתן לעשות מודל מאוגד מצע באמצעות שיטות סיליקו. מודל מעוגן נציג של צומת nsP1/nsP2 מוצג באיור 9. עבור הפרוטאז VEEV nsP2, המחשוף של 12-אמינו חומצה היער הנגיף (SFV) רצף דווח (Km = 0.58 mM)33. הארכת רצף המצע ל-19, 22, ו -25 שאריות והפחתת החוזק היוני של המאגר הובילה לירידה משמעותית ב-Km. בחינת מבנה הגביש VEEV nsP2 ואריזת הגביש גם הראה שחלק מאחת הצמתים היה ארוז נגד התחום פרוטאז והיה helical. כך, מצעים VEEV ארוך יותר עשויים לאגד טוב יותר בשל הכרה של מוטיב מבניים משני.

עבור TRIM14, הצלחנו Km = 21 μm6,33. Km עבור מצע הנושאת את רצף החלבון המארח היה דומה לערכי Km של מצעים המכילים את המחשוף polyprotein מחשוף האתר (Km(רובוטית v12) = 12 μm ו-Km(V34) = 21 μm). רצפי אתר המחשוף בצמתים nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 ו-nsP3/nsP4 נחתכו ביעילות שונה. בתא, זה נחשב לאפשר מחשוף סדרתי של polyprotein42.

יש לנקוט זהירות בפענוח תוצאות שליליות. אם לא מתרחשת מחשוף, אתר המחשוף עשוי להיות קצר מדי או פרוטאז מטוהר יכול להיות פעיל. עבור מצעים מנותקים, ניסויים נוספים נחוצים כדי לאשר את המחשוף של חלבון אורך מלא או מחשוף בתאים נגועים בווירוס. יש לבחור ניסויים מתאימים למעקב. ניתן לבדוק את ההשפעות של ביטוי יתר או השתקה של חלבון היעד על שכפול נגיפי.

איור 1: שלושה מנגנונים של השתקה. השתקה יכולה להתרחש ברמה של DNA, RNA או חלבון. אלגוריתמים אלה "חיפוש ומחיקה" משתמשים במילת "מילת מפתח" כדי לכוון את המחשוף של קובץ המכיל את המילה. דמות זו השתנתה ממוריאני ואח '32 וההפניות בו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הבדלים ספציפיים למינים בתוך מחשוף ברצפי האתרים. קבוצות המחשבים של TRIM14 homologues מופיעות ביישור. ניתן לזהות את קבוצת המחשבים ' חטט/SPRY ' על-ידי המוטיבים המושמרו המסומנים באפור. האדם TRIM14 הוא נחתך ב q, ↓ G על ידי veev nsP2 ציסטאין פרוטאז. הרצף של SSHHP מוצג בצבע. השאריות הירוקות הן השאריות של P1; בכחול הוא שאריות P4, ו באדום הם שאריות שמרו אחרים בתוך המחשוף מוטיב האתר. הנמל של הסוס גרסה קטומה של TRIM14 חסר את התחום חטט/SPRY. הלויזין המסומן בציאן הוא פולי-אוביקוויל, והוא חשוב להרכבת השלטים המאסיביים. תחום ה-C-terminal לפריצה/SPRY עשוי להיחתך בחריפות על ידי nsP2 פרוטאז כדי לפגוע בתגובה האנטי-ויראלית של המארח intracellularly במהלך זיהום נגיפי חריף. בסוסים, תחום זה תמיד נעדר. זה מרמז כי התחום לחטט/SPRY של TRIM14 עשוי להיות פונקציה מגן נגד זיהומים VEEV. הדמות הזאת שוחזר ממורעזאני ואח '6אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זיהוי SSHHPS באמצעות הפיצוץ. המחשוף באתר מוטיב רצף בצומת VEEV nsP1/nsP2 מיושר עם סדרת SSHHP ב חלבון מארח TRIM14. השאריות הצבועות בירוק הוא שארית ה-P1; בכחול הוא שאריות P4 ו אדום הם שאריות שמרו אחרים של המחשוף באתר מוטיב. רוב המערכים הכילו הומולוגיה לאזורים מחוץ למוטיב החיצוני של מוטיב המחשוף או לא כללו את שאריות הקשר של P1/P1 scissile. TRIM14 הראה התאמה 6 שאריות בסדר רציפים שכללו P1 ו P1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: החלבון ורצפי ה-DNA של המצע CFP-רובוטית v12-yfp ל-veev nsP2 ציסטאין פרוטאז. אתרי ההגבלה של NdeI (CATATG) ו-XhoI (CTCGAG) מוצגים באותיות רישיות. באדום הוא רצף באתר המחשוף של polyprotein הנגיפי כי הוא בין nsP1 ו nsP2. שאריות ירוק הוא שאריות P1 ו בכחול הוא שאריות P4 של אתר המחשוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: רצף החלבונים של מבנה פרוטאז של trx-veev-nsP2 ציסטאין. Thioredoxin (Trx) מוצג בצהוב. אתר המחשוף של התרומבין והתג שלו מוצגים בציאן. משפחת מק-הדיקן שלו. מתויג באדום אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מבנים פפטיד ב-מו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: עגינה של מצע פפטיד באמצעות PyRx/AutoDock. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: משימות הפועלות באשכול Biowulf. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: מודל של המצע VEEV P12 המכיל את רצף האתר מחשוף בצומת nsP1/nsP2. Cys-477/שלו-546 לדיאד קטליטי מוצג בכחול. הדמות נעשתה באמצעות פימול (https://pymol.org). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: ניתוח SSHHPS של וירוס Zika ns2B/ns3 פרוטאז. (א) החזוי מטרות חלבון מארח של Zikv ns2B/ns3 פרוטאז. שאריות באדום מתאימים. לרצף מחשוף אחד שאריות בירוק נסבלים באתר המשנה ומתאימים לשקעים באתרי מחשוף אחרים. SFRP1 היה המספר הגבוה ביותר של שאריות זהים בסדר רציף. (ב) CFP-מצע-yfp חלבונים (~ 50-60 kda) הביעו ומטוהרים המכיל את רצף SSHHP החזוי מכל חלבון מארח (אנושי). פרוטאז ZIKV לחתוך האדם FOXG1, SFRP1, NT5M ויחידת המשנה Gsאלפא מבודד מספריית cdna רשתית. מוצרי המחשוף הם כ 28-30 kDa. רצפי המצע זמינים ב morazzani ואח '6 (ג) בעוד ns2B הns3 פרוטאז לחתוך SFRP1, זה לא לגזור homologues שלה (SFRP2 ו SFRP4). (ד) היישור של אתרי המחשוף ממינים שונים של בעלי חיים עשוי להועיל בבחירת דגם בעל חיים עבור וירוס הרביעי של הקבוצה. שים לב כי הרצף שמור R ↓ G שונה בין בני אדם ומכרסמים ב SFRP1. איור ששוחזר ממוריאני ואח '6אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: המצב יציב קינטי ניתוח באמצעות assays רציף מתמשך. (א) הנתונים הקינטית המוצגים בטבלה 5 הותוו ב-grafit. הכניסה מראה את העלילה. של לינויבר-בורק (ב) sds-ג'ל עמוד מציג את מוצרי המחשוף של המצע CFP-רובוטית v12-yfp. במשעול 1 הוא המצע "נימול" (48 kDa). במשעול 2 הוא "גזור" מצע (31 kDa ו -27 kDa). בנתיבים 3-9 תרכובות שונות נכללו כדי לבדוק את פעילות העכבות שלהם. ליין 4 מכיל את המעכב. הE64d קוולנטי התגובות הללו התבצעה במשך. הלילה בטמפרטורת החדר הרתיחה של הדגימות היה נדרש כדי להשיג את הדפוס פסים חדים. NsP2 פרוטאז הוא גלוי (56 kDa) בתגובות המכילות אנזים, אבל לא במסלול 1. . ליין 1 "זה בקרת" ללא אנזים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הדעות שהוביעו כאן הן אלה של המחברים ואינן מייצגות את אלה של חיל הים האמריקאי, צבא ארה ב, משרד ההגנה של ארה ב, או ממשלת ארה ב.