מאמר שיטה

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60455

⸱

12 בדצמבר 2019

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

במאמר זה

סיכום

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

תקציר

איתות מחריץ מווסת את התחזוקה של תאי גזע/מחולל שחור עצביים על-ידי אינטראקציות תא תא. הרכיבים של הביטוי הדינאמי של מוצג איתות. החריץ מדרגה Hes1 ו-Delta-like1 (Dll1) מבוטאים באופן מרוכך בתאי גזע/מחולל מעשה עצבי. מכיוון שתקופת הביטוי הנדנוד של הגנים הללו קצרה מאוד (2 שעות), קשה לעקוב אחר הביטוי המחזורי שלהם. כדי לבחון שינויים מהירים כאלה בביטוי הגנים או בדינמיקה החלבונים, נדרשים כתבים בתגובה מהירה. בגלל ההבשלה שלה מהירה קינטיקה ורגישות גבוהה, הכתב הביולומינסנציה לוציפראז מתאים לעקוב אחר שינויים ביטוי גנים מהיר בתאי החיים. השתמשנו בכתבת לוציפראז של יציבות לניטור פעילות היזם וכתבת התמזגו לוצין להדמיה של דינמיקת חלבון ברזולוציית תא בודדת. כתבים אלה הביולומינציה להראות מחזור מהיר וליצור אותות חלשים מאוד; לכן, פיתחנו מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד כדי לזהות אותות קלושים כאלה. שיטות אלה מאפשרות לנו לנטר הדינמיקה של ביטוי גנים שונים בתאי החיים וברקמות, שהם מידע חשוב כדי לעזור להבין את המדינות הסלולריות בפועל.

מבוא

המוח המיונקים מורכב ממספר רב של סוגים שונים של נוירונים ותאי גליה. כל התאים נוצרים מתאי גזע/מחולל קדמון (npcs), אשר מתרבים הראשון כדי להרחיב את המספרים שלהם, ואז להתחיל להבדיל לנוירונים, ובסופו של דבר להצמיח תאים גליה1,2,3,4,5. לאחר תאים הבדיל לנוירונים, הם לא יכולים להתרבות או להגדיל את המספרים שלהם, ולכן, התחזוקה של NPCs עד שלבים מאוחרים יותר חשוב. איתות מדרגה דרך אינטראקציות תא תא ממלא תפקיד חשוב בשמירה על npcs6,7. החריץ מתקשר עם חלבון הממברנה, חריץ, על פני השטח של תאים שכנים ומפעיל את החלבון חריץ. לאחר ההפעלה, פרוטפוליזיס של חלבון חריץ מתרחשת, ובכך משחררים את התחום התאיים של חריץ (nicd) מן קרום התא לתוך הגרעין8,9,10. בגרעין, NICD נקשר לאזורי היזם של Hes1 ו Hes5 (Hes1/5) ומפעיל את הביטוי של גנים אלה. Hes1/5 לדכא את הביטוי של הגנים הפרניים Ascl1 ו Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. מכיוון גנים proneural לגרום לבידול עצבי, Hes1/5 לשחק תפקידים חיוניים בתחזוקת npcs. יתרה מזאת, כאשר גנים מפרניים יכולים להפעיל את הביטוי של החריץ ו-Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 גם מדחיקים את ביטויו של Dll1. לכן, הביטוי של Dll1 מוביל לתאים שכנים שליליים עבור Dll1 באמצעות איתות מדרגה. בדרך זו, תאים מעכבים תאים סמוכים לאחר אותו גורל, תופעה המכונה עיכוב לרוחב8. במוח המתפתח, הדיכוי הרוחבי ממלא תפקיד ביצירת סוגי תאים שונים.

הדמיה בזמן אמת ברמת תא בודדת מגלה ביטויים דינאמיים של רכיבי איתות מדרגה ב-npcs15,16,17. איתות מחריץ מפעיל את הביטוי של Hes1, אך Hes1 חלבון נקשר ליזם משלו ומחדש את הביטוי שלו. יתר על כן, Hes1 הוא חלבון בלתי יציב מאוד, כי הוא מושפל על ידי אוביקוויב-פרוטאסאט מסלול; לכן, הדיכוי של היזם משלה הוא רק קצר החיים ולאחר מכן התמלול מתחיל שוב. בדרך זו, הביטוי של Hes1 נדנוד בשתי רמות שעתוק וטרנסלtional במחזור 2 h18. הביטוי הנדנוד של Hes1, בתורו, מעורר את הביטוי המסובב של הגנים של המטרה במורד הזרם, כגון Ascl1, Neurog2, וDll1, דרך הדחקה מחזורית15,16,17,19. בעוד הגנים הפראוניים יכולים לגרום לבידול עצבי, הביטוי הנדנוד שלהם אינו מספיק לבידול עצבי; בעצם הביטוי המתמשכת שלהם חיוני לבידול העצבי. הביטוי נדנוד של גנים proneural חשוב לשמירה על npcs במקום לגרימת בידול עצבי14,15,16. הביטוי של Dll1 מרוטים ברמות התמלול והטרנסלאיזם במהלך שונות, כגון נוירוגנזה וסוטוגנזה. הביטוי הדינמי של Dll1 חשוב עבור מורגנזה נורמלי ביטוי קבוע של Dll1 גורם פגמים נוירוגנזה ו somitogenesis17. ממצאים אלה מדגימים את הפונקציה החשובה כי הדינמיקה של ביטוי גנים וקינטיקה חלבונים יש על הרגולציה של אירועים התפתחותיים שונים (כלומר, דינמיקה ביטוי שונה לייצר תפוקות שונות התנהגויות סלולר).

כדי לנתח את הדינמיקה של איתות מדרגה, הניתוח הסטטי של רקמות ותאים אינו מספיק מכיוון שהם משתנים ללא הרף. בזמן אמת הדמיה של תאים בודדים הוא כלי רב עוצמה כדי לחשוף את הדינמיקה ביטוי גנים. הביטוי הדינמי של מולקולות איתות מהירות עוברות תגובות מחזורית בתקופה של 2-3 h. ביטוי תקופתי מהיר זה מציג שתי בעיות קשות לניטור בזמן אמת: (1) הביטוי של המולקולות מדוכא רמות נמוכות, ו (2) מחזור מהיר דורש כתבים בתגובה מהירה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו בעבר ביולומינציה בזמן אמת שיטה הדמיה20. מכיוון שלעיתונאי הביולומינסנציה יש רגישות גבוהה יותר וזמן התבגרות קצר יותר מאשר כתבים פלורסצנט, אסטרטגיה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר הדינמיקה המהירה בתאי החיים. שימוש בהדמיה בזמן אמת, גילינו כי גנים נוספים הציגו ביטוי דינמי משחשבנו בעבר. בנוסף, מספר הדיווחים המציגים ביטוי ודינמיקה חלבונים בתאי החיים והמשמעות של הדינמיקה הללו באירועים ביולוגיים שונים גדל, מציע תפקיד בסיסי של הדינמיקה ביטויים גנים21,22.

בדוח זה, אנו מתארים דרך להמחיש את הביטוי של החריץ והDll1 ב NPCs בתרבויות המונתק ובתרבויות הפרוסה הקורטיקלית. כדי לנטר את הדינמיקה של תמלול Dll1 ברמות תא בודד, יצרנו תרבויות מופקות של npcs שנגזר מהטלנצאלון העובריים של עכברים טרנסגניים הנושאים את הכתבת PDll1-רוב-fluc, הכתבת לוציפראאז מונחה-מיזם Dll1. כדי לפקח על הדינמיקה Dll1 חלבון ב vivo, הצגנו את הכתב היתוך Dll1-Fluc לתוך NPCs בקליפת המוח ודמיינו את הביטוי של הכתב NPCs בתרבויות פרוסת הקליפה. הדמיה בזמן אמת אפשרה לנו ללכוד את התכונות השונות של ביטוי גנים ודינמיקה חלבונים בתאי החיים ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים, כולל נושאי בעלי חיים, אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים במכון למדעי החיים ומדעי הרפואה, אוניברסיטת קיוטו.

1. כתבים ביולומינסנציה

הערה: הכתב הלוציפראז מתאים למדידת הדינמיקה המהירה של פעילות היזם על ידי החדרת אות השפלה. יתר על כן, כתב היתוך לוציפראז מאפשר ניטור של דינמיקת החלבון בתא בודד. שני סוגי הכתבים זמינים עבור תרבות מונו-layer (תרבות הדיסוציאציה) ותרבות רקמה (תרבות פרוסה) ניסוי.

  1. כתבת ניטור פעילות Dll1 יזם17
    הערה: כדי לעקוב אחר השינויים המהירים בביטוי הגנים, הכתב המהיר והעיתונאי הלא יציב הוא חיוני. גחלילית לוציפראז (Fluc) מראה התבגרות מהירה לעומת fluorescein כתבים. בגלל אוביקוויב התמזגו כתבת לוציפראז (רוב-Fluc) מראה השפלה מהירה מחזור מהיר, זה מאוד שימושי כדי לפקח על הביטוי הגן הדינמי בתאי החיים20.
    1. השתמש Dll1 היזם מונחה יציבות כתבת לוציפראז, לוציפרול (pDll1-ורוב-Fluc, איור 1פאנל עליון) , כדי לעקוב אחר שינויים מהירים בביטוי Dll1 ברמת ההמרה17.
    2. צור קו עכבר טרנסגניים הנושא את pDll1-רוב-Fluc לביטוי היציב של כתב זה.
  2. כתבת ניטור Dll1 חלבון17.
    1. עבור דור של עכברים נוק-אין, הכנס את ה-Dna לוציפראז אל 3 termini של אזור הקידוד Dll1 כך Dll1-לוציפראאז חלבון היתוך מבוטא (Dll1-Fluc כתב, איור 1, פאנלתחתון)17.
    2. נטר את דינמיקת הביטוי של Dll1 ברמות החלבון על-ידי מדידת הפעילות הלוציפרראז.
    3. עבור ניטור הדינמיקה Dll1 חלבון ברמות רקמות, להציג את הכתב Dll1-Fluc לתוך NPCs בטלנצאלון העובריים באמצעות אלקטרופורציה של הרחם.

2. מערכת הדמיה ביולומינסנציה

  1. בניית מערכת הדמיה ביולומינציה לחיות באמצעות מיקרוסקופ הפוך מותקן עם רגישות גבוהה, מים מקורר מצלמה מצלמות. כדי להפחית את הרעש ולקבל רגישות גבוהה, לצנן את המצלמה עם מים צוננים המסופקים על ידי מקצר המים בטמפרטורה ממוטבת של-90 ° c.
  2. עבור הדמיה של תא/רקמה חיה, התקן את מערכת הדגירה, שליטה בטמפרטורה ובגז מעורב, לשלב המיקרוסקופ.
  3. עבור הדמיה של הביטוי של כתבת הלוציפראז ביציבות, השתמש בזווית מספרית גבוהה (NA: 1.30) 40x העדשה היעד טבילה שמן. מרחק העבודה של העדשה הזאת הוא 0.2 מ"מ, הוא זמין עבור לא רק תרבות תא מונו שכבה אלא גם לחתוך תרבות.
  4. עבור ניטור כפול של לוציפראז וביטוי כתבת fluorescein, להתקין את המכשיר תאורה LED לנתיב האור של המיקרוסקופ.
  5. שלוט בדימות הזמן עם תוכנה המשויכת למיקרוסקופ (לדוגמה, תוכנית רכישה רב-מימדית של תוכנת התמרה).
  6. הכן את המערכת כולה בחדר חשוך, מכיוון שהאות של כתב הלוציפראז מאוד חלש, וכדי למנוע מהאור החיצוני למנוע את הרכישה.

3. בתרבויות הדיסוציאציה של הגזע/הקדמון (NPC)

  1. הכנת מדיה תרבותית, מנות, וריאגנטים לתרבות הדיסוציאציה של NPC
    1. הכינו N2/B27 מדיה לתאי גזע/מחולל עצבי באמצעות ריכוז סופי של 1x N2, 1x B27, 1 מ"מ N-acetylcysteine, 10 ng/mL bFGF ו 50 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ב DMEM/F12 מדיה.
    2. להכין פתרון פפאין עבור הדיסוציאציה המכילה 7 U/mL פפאין, 0.006% dnase ו 1 מ"מ N-acetylcysteine ב-ebss מדיה.
    3. הכינו 100 מ"מ של תמיסת נתרן לוציפראב לדימות. לדלל 100 mM לוציב פתרון N2/B27 מדיה לריכוז הסופי של 1 מ"מ.
      הערה: לוציפראב מראה אוטומטי-פלואורואסעין עצמו. במקרה של לluciferase-הדמיה כפולה פלואורסצנטית, במיוחד EGFP, הפחתת הריכוז של לluciferase כדי 0.5 mM הוא טוב יותר.
    4. מעיל 35-mm זכוכית מנות בתחתית (קוטר זכוכית 27 מ"מ) עם 40 μg/mL של פולי-L-ליזין (PLL) פתרון עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף את לוחיות 3x עם PBS ולתת לו להתייבש.
  2. חיתוך העוברים והדיסוציאציה של NPCs
    1. לאחר המתת החסד pDll1 ההרה-ורוב ללוק העכבר (היום העובריים 12.5 (E 12.5)) על ידי שיתוף2 חנק צוואר הרחם, לחתוך דרך הבטן ולהוציא את הרחם.
      הערה: על החוקרים לפעול לפי התקנות וההנחיות של ועדת מחקר בעלי חיים של מוסד. אם נעשה שימוש בהרדמה או בתרופות לשיכוך כאבים, השתמש בהן כראוי.
    2. העבר את הרחם בצלוחית בגודל 10 ס מ המכיל 25 מ ל של הקרח קר PBS. להוציא את העוברים מן הרחם ב-PBS קר קרח, באמצעות מספריים מיקרו מלקחיים עדינים.
    3. חותכים את הראש של כל עובר באמצעות מספריים ולהעביר אותו 10 ס מ מנות פטרי המכילות הקרח קר Dמאמ/F12. הסר את האפידרמיס ואת הסחוס סביב המוח ולהעביר את המוח כדי 35 מ"מ צלחת פטרי המכיל קרח קר 3 מ ל של N2/B27 מדיה.
    4. לנתק את הטלנצאלון הימני והשמאלי מדינצאלון (איור 1בבא-פ, ג, ד). להסיר את קרום הקרומי המכסה את פני השטח של טלנצאלון באמצעות מלקחיים עדינים (איור 1Bi). שימוש מלקחיים עדינים שוב, להוציא את החלק הרוחבי של קליפת המוח של הטלנצאלון (איור 1Bg, h, j-l E).
    5. להעביר את הרקמות לצינורות חדשים 1.5 mL באמצעות P1000, ולהסיר כל מדיום נוסף עם P200. הוסף 0.1 mL של פתרון פפאין לרקמת המוח (זוג של קליפת הקליפה). לאחר 15 דקות של דגירה ב -24 ° c, מצנעת בעדינות את הדגימות 10 פעמים עם P1000 פיפטה. החזר את הדגימות במשך 15 דקות ב-24 ° c.
    6. מצנעת בעדינות את הדגימות 10 פעמים עם P1000 פיפטה. צנטריפוגה את הדגימות עבור 3 דקות ב 400 x g וטמפרטורת החדר (RT). . מחק את הסופרנטאנט
    7. הוסף 1 מ ל של מדיה DMEM/F12 לתוך הגלולה. פיפטה בעדינות 10 פעמים. עם P1000 פיפטה צנטריפוגה את הדגימות עבור 3 דקות ב 400 x ו RT. למחוק את הסופרנטאנט. . חזור על זה לפחות עוד 2 פעמים
    8. לתוך הגלולה, להוסיף 0.5 mL של מדיה N2/B27 המכיל 1 מ"מ לוספרין ולערבב היטב. זרע את התאים (1 x 106 תאים) לצלחת זכוכית מצופה pll. תרבות התאים בחממה CO2 עבור 1 h. לאחר התאים לדבוק התבשיל, להוסיף 2 מ"ל של N2/B27 מדיה, המכיל 1 מ"מ לוציב.
  3. ויזואליזציה של ביטוי הכתב ללוציפראז בתרבות הדיסוציאציה של NPC
    1. הפעל את מערכת הדימות החי לפני ביצוע הניתוח. עבור התרבות NPC, להגדיר את הטמפרטורה של אינקובטור הבמה ב 37 ° c ולקבוע את ההגדרה של תערובת הגז 20% O2, 5% CO2.
    2. הכניסו את שמן הטבילה אל העדשה האובייקטיבית. מניחים את המנה לדוגמה על במת המיקרוסקופ. הצגת השדה באופן ידני ובחירת המיקום הטוב ביותר ומוקד תאי הריבית. לחץ על live כדי לרכוש את תמונת הבדיקה.
    3. הפעל את רכישת הזמן על ידי 2-מימדי (לומינציה שדה בהיר) רכישות 24 שעות עם תוכנית רכישה רב ממדית . בחר תוכנית רכישה רב ממדית והגדר את הגדרת הרכישה כדלקמן (שלב 3.3.6).
    4. עבור רכישת תמונה לאור, השתמש בהגדרות הבאות של המצלמה: קצב העברה נמוכה (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 דקות/5 דקות חשיפה זמן. לרכישת תמונות בשדה בהיר, השתמש בהגדרות הבאות: קצב העברה ביניים (1 מגה-הרץ), 1 x 1 binning ו 100 ms זמן חשיפה.

4. באלקטרופורציה של הרחם

הערה: הדבר מבוצע לצורך הקדמה של כתב Dll1-Fluc לתוך תאי הקדמון העצביים.

  1. הכנת כלים וריאגנטים לאלקטרופורציה
    1. הכנת נימים מיקרו להזרקה של ה-DNA לתוך החדר של טלנצאלון עובריים. מתחו את העשב בחום וחתכו את קצהו במכונת הליטוש.
    2. הכינו תערובת של דנ א עם צבע (למשל, טרילון כחול). הריכוז של כל דנ א הוא 1 μg/μL ב-PBS ולהוסיף את הצבע לריכוז הסופי של 10%.
      הערה: השתמש בתערובת של ה-DNA עבור ויזואליזציה של דינמיקה Dll1 חלבון כדלקמן: Dll1-Fluc (Dll1 כתבת חלבון, איור 2e העליון) ו PEF-egfp (EF יזם מונחה ביטוי Egfp וקטור, איור 2E נמוך), ניטור המיקום ומורפולוגיה של תאים מזוהמים.
    3. הכינו שני סוגים של הרדמה: 3.88 מ"ג/mL של פנטוברביטל ו 0.12% של xylazine, ב-1x מעוקר.
    4. השתמש בכלים הסטריליים ובכפפות הניתוח במהלך הפעולה.
  2. באלקטרופורציה של הרחם
    1. מורדם בפעם ההרה העכבר ICR (E 12.5) על ידי מינהל הצפק הרדמה עם 500 μL של 3.88 mg/mL פנטוברביטל ו 500 μL של 0.12% xylazine.
      הערה: על החוקרים לפעול לפי התקנה של ניסויים בבעלי חיים. אם אדם צריך להשתמש בהרדמה או בתרופות לשיכוך כאבים, השתמש בהם כראוי.
    2. הצמד את השיער וחטא את העור בקרצוף כירורגי.
    3. בדוק אם העדר. תגובה לצביטה בבוהן לאחר רפלקס הדוושה לא נצפתה, לעשות 2-3 ס מ לחתוך דרך הבטן לאורך קו האמצע. לשים את החלקים סביב לגזור ולהרטיב את הגאוזים עם PBS חם לא לייבש את החתך. להוציא את קרן הרחם הנכון בעדינות עם מלקחיים בצורת טבעת ולספור את מספר העוברים.
    4. הכנס 1-2 μL של ה-DNA המעורב לחדר של טלנצאלון של עוברים בעדינות עם מיקרו נימי.
      הערה: כאשר ההזרקה מוצלחת, ניתן לראות את צבעו הכחול של הצבע על פני הרחם.
    5. הרטב את הרחם והאלקטרודה לפני מתן פעימות המתח, ולאחר מכן החזיקו את ראש העובר בעדינות. הגדר את האלקטרודה טעונה חיובית בצד של החצי הכדור, שבו ה-DNA הוזרק. ודא כי המצב של הדופק של אלקטרופורציה הוא 30-50 V עבור 50 ms, המרווח של הפולסים הוא 1 s (50 ms תשלום ו950 ms ללא תשלום). לספק 5 פולסים לעובר אחד ולבדוק כי בועות נוצרות מן האלקטרודה טעונה שלילית.
      הערה: ודא כי הכיוון של האלקטרודה: ה-DNA משולבים בתאים בצד של אלקטרודה חיובית. במהלך הליך זה, אל תזיז את המיקום של האלקטרודה.
    6. חזור על הצעדים 4.2.3-4.2.4 עבור עוברים אחרים ולהחזיר את קרן הרחם אל חלל הבטן. בצע את אותו ההליך לעוברים בקרן הרחם השמאלית.
    7. לאחר לשים בחזרה את הצד השמאלי, תפר את החתך על ידי תפר משי (4-0) עם מחט (17 מ"מ). לפני סגירת החתך לחלוטין, הכניסו PBS חם לתוך חלל הבטן
      הערה: המרווח בין התפרים הוא בסביבות 2 מ"מ.
    8. לאחר סיום הניתוח, למקם את העכבר על משטח חימום לאחר התאוששות הרדמה. הבית העכבר בנפרד.
      הערה: על החוקרים לבצע את הרגולציה המקומית של ניסויים בבעלי חיים. אם מישהו צריך להשתמש בסמים. הקלת כאבים, השתמש בהם כראוי

5. הכנת תרבויות הפרוסה של קליפת המוח המתפתחת והדמיה של ביטוי כתב לוציפראז בפרוסות קליפת המוח

  1. הכנת מדיית תרבות וריאגנטים לתרביות פרוסות של קליפת המוח
    1. להכין מדיה מועשר עבור פרוסות קורטיקלית המכיל 5% סרום העובר העוברי ו 5% סרום סוסים ב N2/B27 מדיה.
    2. בועה 100% O2 גז באמצעות dmem דיה/F12 התקשורת לניתוח ועשיית פרוסות קורטיקלית.
      הערה: כדי להשתמש בגז חמצן בבטחה, לאחסן את הצילינדר O2 בארונית גליל ולפקח על ריכוז החמצן באוויר על ידי מד ריכוז חמצן.
    3. לדלל 100 mM לוציפרב תמיסת נתרן במדיה מועשר לריכוז הסופי של 1 מ"מ.
      הערה: לוציפראב מראה אוטומטי-פלואורואסעין עצמו. במקרה של לluciferase-הדמיה כפולה פלואורסצנטית, במיוחד EGFP, ריכוז נמוך יותר של לluciferase (0.5 mM) הוא טוב יותר.
    4. הגדר את החממה רב-גזי ב 37 ° c על ידי 40% O2 ו 5% CO2.
  2. ניתוח עוברים ובחינת ביטוי של כתב פלורסנט
    1. לאחר המתת החסד העכבר ההרה שאליו הכתבים (E 13.5) מוצגים על ידי אלקטרופורציה הרחם (שלב 4.2), לחתוך דרך הבטן ולהוציא את הרחם.
      הערה: על החוקרים לפעול לפי התקנה של ניסויים בבעלי חיים. אם משתמשים בהרדמה או בתרופות לשיכוך כאבים, השתמשו בהם כיאות.
    2. העבר את הרחם ל 10 ס מ צלחת פטרי המכילה PBS. להוציא את העוברים מהרחם ב-PBS, באמצעות מספריים מיקרו מלקחיים עדינים. לחתוך את הראש של כל עובר ולהעביר ל 10 ס מ צלחת פטרי המכיל מדיה DMEM F12/לצמצם עם 100% O2 גז. להסיר את האפידרמיס ואת הסחוס סביב המוח בתקשורת Dמאמ/F12.
    3. שים את המוח על המכסה של צלחת פטרי עם מלקחיים בצורת טבעת ולהגדיר את המכסה על הבמה הזריחה סטריאוסקופי מיקרוסקופ. בדוק את האזור של הקליפה המבטא חלבון פלורסנט תחת אור עירור (איור 2א, ב).
    4. להעביר את המוח ללוח גומי סיליקון ממולא 30 מ ל של DMEM דיה/F12 התקשורת בודימם עם 100% O2 גז. מסירים את הקרום על המשטח של הטלנצאלון על ידי מלקחיים עדינים.
    5. חותכים את הגבול בין האמצעי לרוחב של החלק הרוחבי של הטלנצאלון ונפרד לשתי אונות באמצעות סכין מיקרו מנתחים או מלקחיים עדינים. באמצעות סכין מיקרו כירורגית, חותכים את קליפת המוח כמו פסים לעשות פרוסות קורטיקלית (איור 2ג, ד). הפיפטה פרוסות באמצעות פיפטה ומעבירים אותן למדיה מועשרת בצלחת 35 מ"מ.
    6. שימו את הפרוסות על מוסיף התרבות במנות התחתונות בזכוכית עם מדיה מועשרת. תקן את כיוון הפרוסות בעזרת מלקחיים עדינים. הגדר את משטח החיתוך של הפרוסות על פני השטח של הוספת התרבות. הסירו את המדיה הנוספת באמצעות פיפטה. מודיית את הפרוסות בחממה רב-גזי שנקבעו על ידי 40% O2 ו 5% CO2 ב 37 ° c עבור 30 דקות.
    7. הוסף 300 μL של מדיה מועשרת המכיל 1 מ"מ לוצין מחוץ לכנס התרבות בצלחת הזכוכית התחתונה.
  3. ויזואליזציה של ביטוי כתב לוציפרראז בתרביות פרוסות
    1. התחילו את מערכת הדימות החי לפני שמתחילים בניתוח. השתמש בתנאי הבא של תרבויות הפרוסה הקורטיקלית: 40% O2, 5% CO2 ו-37 ° c.
    2. לשים את השמן טבילה כדי 40x עדשה אובייקטיבית. לשים את המנה לדוגמה לשלב של מיקרוסקופ. לרכוש את תמונת המבחן של פלורסנט ולהגדיר את המיקום ואת מישור המוקד לאזור העניין תחת התאורה של אור עירור.
    3. הפעל את רכישת הזמן על ידי 3-מימדי (לומינציה, זריחה ובהיר שדה) רכישות עבור 24 שעות (איור 2F-h). עבור רכישת תמונה לאור, השתמש בהגדרות הבאות של המצלמה: קצב העברה נמוכה (50 kHz), 2x2/4x4 binning, 10 דקות/5 דקות חשיפה. עבור הרכישה והחשיפה של תמונת שדה בהיר, השתמש בהגדרות הבאות: קצב העברה ביניים (1 מגה-הרץ), 1x1 binning ו 100 ms זמן חשיפה.

6. עיבוד תמונה וניתוח

  1. חבר כל תמונה והפוך את תמונות המחסנית. לחץ על יבא רצף תמונות מתפריט קובץ (קובץ | יבא | רצף תמונות) ובחר את התיקייה, שבה נשמרים התמונות שנרכשו. שים מילים מסוימות הכלולות בשם הקובץ לעמודה של File name מכיל.
  2. כדי להסיר את הרעש של הקרן הקוסמית על התמונות הביולומינסטיות, החל את התוסף לסינון Spikenoise של imagej/פיג'י. פתח את תמונות המחסנית ולחץ על מסנן Spikenoise.
  3. החל Savitzky Golay מסנן זמני plug-in כדי לקבל דינמיקה ברורה של הביטוי כתב. פתח את תמונות מחסנית ולחץ על Savitzky Golay מסנן זמני.
  4. כדי למדוד את עוצמת ביטוי הכתב, החל את היישום ' פרופיל ציר Z פלוס ' על כל תא בודד. בחר את התאים והגדר ROIs, אזור של עניין ולחץ על ציר Z פרופיל פלוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביטויים של הגנים Hes1/7 מחזור תנודות 2 המחזור בקווי התא השונים במהלך somitogenesis. יתרה מזאת, תקופת התנודה היא קצרה מאוד והן ה-mRNAs והחלבונים שלהם מאוד לא יציבים עם מחצית החיים של כ -20 דקות. אם נעשה שימוש בכתבת תגובה איטית, לא נוכל לעקוב אחר דינמיקה מהירה כזו, ואם נשתמש בכתב יציב, הדבר מצטבר בהדרגה בזמן שביטוי הגנים מואץ. לפיכך, העיתונאי חייב להיות מושפל במהירות כדי לעקוב אחר המחזור המהיר של גנים כאלה ביטא מחזוריות. כדי להתגבר על בעיות אלה, השתמשנו בכתב הלוציפראז כדי לעקוב אחר הביטוי הדינאמי של נדנוד. בגלל של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מרכיבי האיתות החריץ מציגים ביטויים מרוטים ב-סנכרון במהלך התקופה האחרונה, אלא מתוך סנכרון במהלך נוירוגנזה, המובילה לקשיים בלכידת דינמיקת הביטוי באמצעות ניתוח סטטי במקרה האחרון. לפיכך, ניטור זמן אמת נדרש כדי לחשוף את דינמיקת הביטוי של רכיבי איתות מדרגה, כגון Hes1 ו- Dll1. מכיוון שתקופות הביטויים של Hes1 ו- Dll1 תנודות קצרות ביותר, כ-2-3 h, תגובה מהירה וכתבים לא יציבים נדרשים לניטור דינמיקת הביטוי שלהם. למטרה זו פיתחנו את הכתב הביולומינסאלי ומערכת ההדמיה. הכתב הביולומינסאלי לוציפראז מראה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין עניין פיננסי סותר.

תודות

אנו מודים ליומיקו איוומוטו על התמיכה בייצור וידאו. אנו גם אסירי תודה לאקיהירו איזוטורה לדיון ולתמיכה בניתוח תמונה, היטושי מייניה לתמיכה טכנית עבור דור של בעלי חיים טרנסגניים, Yuji Shinjo (האולימפוס מדע הרפואה), Masatoshi אגאווה (האולימפוס מדע הרפואה), Takuya אישיזו ( האולימפוס מדע הרפואה) ו Ouin Kunitaki (Andor יפן) עבור תמיכה טכנית ודיונים של מערכת הדמיה biלומינסנציה. עבודה זו נתמכת על-ידי מחקר הליבה של המדע האבולוציונית והטכנולוגיה (JPMJCR12W2) (ק), גרנט-עזרה עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים (MEXT 24116705 עבור H.S. ו MEXT 16H06480 עבור ק), גרנט ב-עזרה עבור מחקר מדעי (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), קרן טקדה (ק וH.S.), ופלטפורמה לגישות דינמיות למערכת החיים ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<מערכת הדמיה חזקה>ביולומינסנציה
סירקולטור מים צוננים (צ'ילר)דגם ג'ולבוF12-ED
וטכנולוגיית אנדורדגם: iKon-M 934
מערכת חממהTOKAI HITדגם: INU-ONICS
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסדגם: IX81
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסדגם: IX83
מכשיר תאורת LEDCoolLEDדגם: pE1
MetaMorphמכשירים מולקולרייםדגם: 40000
בקר גז מיקסטוקןדגם: TK-MIGM OLO2
עדשת אובייקטיביתאולימפוסדגם: UPLFLN 40X O
<חזק>תכשירים לדיסקציה
דיסקציהניקון: SMZ-2B
מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטיLeicaדגם: MZ16FA
מלקחיים עדיניםDUMONTINOX מס' 5
<חזק>מספריים, מיקרו מספריים
מלקחיים
בצורת טבעת
10 ס"מפטרי צלחת גריינר664160-013
35 מ"מפטרי צלחת גריינר627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
<חזק>ריאגנטים ל-NPC תרבית דיסוציאציה
B27 תוסףinvitrogen12587-010
bFGFinvitrogen13256-029פתרון מלאי: 1 μ גרם/מ"ל ב-0.1% BSA/PBS
D-luciferinNacalai Tesque01493-85תמיסת מלאי: 100 מ"מ ב-0.9% מלח
DNaseWorthington Biochemical CorporationLK003172תמיסת מלאי: 1000U/ml ב-EBSS
EBSSWorthington Biochemical CorporationLK003188
צלחת תחתית זכוכיתתוסף IWAKI3910-035
N2 (100x)invitrogen17502-048
N-אצטיל-ציסטאיןסיגמאA-9165-25G
פפאיןוורת'ינגטון תאגיד ביוכימיLK003178תמיסת מלאי: 7U/ml ב-EBSS
פניצילין/סטרפטמיציןנקלאי טסק09367-34
פולי-ליזיןסיגמאP-628140 מ"ג/מ"ל ב-DW
<חזק>תכשירים למזרק אלקטרופורציה ברחם
50 מ"לTERUMO181228T
אלקטרודהNeppagene7 מ"מ
אלקטרופורטורNeppageneCUY21 EDIT
מלקחיים
GauzesKawamoto co.7161
מיקרו נימיתוצרת הבית
PBSNacalai Tesque14249-24
PentbarbitalKyoritsuseiyaku
קסילזיןבאיירסרקטל
<חזק>תכשירים לתרבית פרוסה
10 ס"מ פלסטיקפטרי צלחת גריינר664160-013
גריינרצלחת פטרי מפלסטיק 35 מ"מ627160
תרביתMilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
סרום בקר עובריסיגמא172012-500 מ"ל
מלקחיים עדיניםDUMONTINOX מס' 5
מלקחיים
סרום סוסGibco16050-122
סכין כירורגית מיקרואלקון19 מד V-Lance
אינקובטור רב גזפנסוניקMCO-5MUV-PJ
N2/B27 מדיהתוצרת ביתref. NPC dissociatioin culture
PBSNacalai Tesque14249-24
בצורת
, מיקרו מספריים
קרש חיתוך גומי סיליקוןתוצרת הבית
: מצלמת CCD מקוררת דגם מלקחיים פלסטיק פלסטיק מספריים מלקחיים בצורת טבעת Somnopentyl, מחט תפר מספריים מיקרו Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2 מספריים טבעת

מקורות

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704(2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים