Method Article

זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנים חיידקיים מפרישות חלבונים לתוך המחשב המארח המטרה תהליכים ביולוגיים קריטיים. זיהוי מסלולים המארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור הוא המפתח לטיפול פתוגנזה מולקולרית. כאן, שיטה באמצעות מדכא שמרים שונה ומסך רעילות כדי להבהיר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור רעיל מתואר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים תאיים להפריש גורמים התקפה אלימה הנקרא אפקטור חלבונים לתוך ציטוסול מארח כי לפעול לחתור מארחים חלבונים ו/או מסלולים ביולוגיים הקשורים שלהם לטובת החיידק. זיהוי של חלבונים בקטריאלי החיידק אפקטור הפכה יותר לניהול בשל ההתקדמות ברצף הגנום החיידקי ואת הופעתו של אלגוריתמים המאפשרים זיהוי סיליקו של גנים קידוד הפרשת מועמדים ו/או eukaryotic כמו תחומים. עם זאת, זיהוי של גורמים והתקפה אלימה אלה הוא רק צעד התחלתי. באופן טבעי, המטרה היא לקבוע את התפקוד המולקולרי של החלבונים של אפקטור ולהבהיר כיצד הם מתקשרים עם המארח. בשנים האחרונות, טכניקות כמו מסך שני שמרים היברידית בקנה מידה גדול immunoprecipitations בשילוב עם ספקטרומטר המסה סייעו בזיהוי של אינטראקציות חלבונים חלבון. למרות שזיהוי של שותף כריכה מארח הוא הצעד הראשון המכריע לקראת הבעת המצאת הפונקציה המולקולרית של חלבון אפקטור חיידקי, לפעמים חלבון מארח נמצא יש פונקציות ביולוגיות מרובות (למשל, actin, clathrin טובולין), או חלבון חיידקי לא יכול פיזית לאגד חלבונים מארחים, לשלול את החוקר של מידע חיוני על מסלול מארח מדויק להיות מניפולציות. הרעלת שמרים שונה מסך בשילוב עם מסך משתיק קול הותאם כדי לזהות מסלולים מארחים המושפעים על ידי חלבונים החיידק אפקטור. מסך רעילות מסתמך על השפעה רעילה של שמרים הנגרמת על ידי חלבון אפקטור מפריעה המסלולים הביולוגיים המארחים, אשר לעתים קרובות מתבטא כפגם גדילה. ביטוי של הספרייה גנומית שמרים משמש כדי לזהות גורמים מארחים לדכא את רעילות של חלבון אפקטור חיידקי, ובכך לזהות חלבונים במסלול כי החלבון מטרות מטרה. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות עבור מסכי רעילות ומדכא. ניתן לבצע טכניקות אלה בכל מעבדה המסוגלת לשכפול מולקולרי וטיפוח של שמרים ומסלול קולי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדו ח הראשון של ההליכים הדומים לאלה שהוצגו כאן אפיינו את הלגיונרים האלה מסוג העירוי הרביעי, שהוא deAMPylase שמשנה Rab11. טכניקות דומות שימשו לאפיון של מספר L. משאבה מנועי 1,2,3. השיטה הותאמה כדי לאפיין את הסוג Coxiella בורנתיבי הרביעיחלבון,ולאחרונה את השירות של טכניקה זו הורחבה לאפיון של כלמידיה trachomatis ממברנה חלבונים5 .

פרוטוקול זה ניתן לפרוץ לשני חלקים עיקריים: 1) את המסך רעילות שמרים, שבה חלבון החומר החיידקי של עניין מתבטא שמרים שיבוטים מוקרן לפנוטיפ רעיל כפי שמעידים על ידי פגם גדילה, ו 2) מסך מדכא שמרים , שבו הפנוטיפ הרעיל מדוכאים על ידי ביטוי של ספרייה גנומית שמרים במתח הרעיל. כך, את המסך רעילות היא מסך עבור פנוטיפים רעילים המניפסט כמו ליקויים בגדילה כאשר החיידק החיידקי של העניין הוא ביטוי יתר. שיבוטים רעילים, השתנה בהצלחה עם וביטוי האפקטור חיידקי, נבחרו ונשמר לשלב הבא. הצעד העיקרי השני כרוך יתר על הביטוי בספרייה גנומית חלקית שמרים מתעכל בשכפול שמרים רעילים. פלמידים ממציא את הספרייה גנומית שמרים הציע לשימוש בפרוטוקול זה לשאת 5-20 kb מוסיף, בדרך כלל מתאים 3-13 שמרים לקרוא מסגרות לקריאה (ORF) של גודל הגן הממוצע של ~ 1.5 kb על פני כל פלמידים, המייצגים גנום שמרים כולו מכוסה כ-10x. חלק זה של השיטת נקרא מסך מדכא, כמו המטרה היא לדכא את רעילות של חלבון אפקטור חיידקי. הפלמיונים הפוטנציאליים של מדכא מבודדים משמרים, ברצף ומזוהים הדיכוי ORFs. הרציונל הנמצא בבסיס מסך מדכא הוא כי חלבון האפקטור נקשר, אינטראקציה עם, ו/או להתמקד ברכיבים של מסלול מארח זה מטרות, וכי מתן אלה חלבונים מארחים בחזרה עודף יכול להציל את ההשפעה הרעילה על השביל ולכן, פגם הגדילה. כך, מזוהה ORFs כי לדכא רעילות לעתים קרובות מייצגים משתתפים רבים של מסלול מארח. ניסויים אורתוגונאליות מבוצעים לאחר מכן כדי לוודא כי האפקטור חיידקי אכן אינטראקציה עם השביל מעורבים. הדבר הכרחי במיוחד אם התגלתה שותפה מחייבת כגון clathrin או אקטין, משום שחלבונים אלה מעורבים בהמון תהליכים מארחים. ניסויים נוספים יכולים להבהיר את התפקוד הפיזיולוגי של חלבון האפקטור במהלך הזיהום. רעילות מסכי מדכא הם גם כלים רבי עוצמה לפענוח התפקוד הפיזיולוגי של חלבונים אפקטור חיידקי כי לא לאגד פיזית מארח חלבונים עם מספיק כדי לזהות על ידי immunoprecipitation או כי אינטראקציה עם ארח באינטראקציות פגע וברח אנזימטיות שאינן מזוהות על-ידי מסך היברידי משני שמרים.

למרות מסך מדכא יכול להיות שיטה רבת עוצמה כדי לחשוף אינטראקציות פיזיולוגיות פוטנציאליות בין חלבונים אפקטור חיידקים ומסלולים מארחים, חלבון אפקטור חיידקי חייב לגרום לפגם גדילה שמרים, אחרת באמצעות זה ב מסך משתיק קול יהיה שימוש קטן. יתר על כן, הפנוטיפ הרעיל חייב לגרום לפחות 2-3 יומן רישום10 הגרעון בצמיחה או יהיה קשה לזהות דכאי. אם המעבדה מוגדרת לתרבות התאים, הקרנת חלבונים לרעילות בקווי תאים משותפים כגון הלה יכולה לעתים קרובות להעניק תובנה לגבי המאמץ להמשיך במסך הרעילות לשמרים. ביטוי חוץ רחמי של חלבון אפקטור בתאי הלה לפעמים גורמת לרעילות כי מתאים מאוד רעילות בזן שמרים המשמש מסכים אלה4. סימני ההיכר של הלחץ בתאי הלה כוללים אובדן סיבי לחץ, ניתוק תאים מהצלחת, ועיבוי גרעיני המציין אפופטוזיס. כל אינדיקציה חזותית של מתח בתאי הלה להפוך את החלבון של עניין מועמד טוב לגרימת פגם גדילה בשמרים, אשר לשכפל הרבה יותר במהירות, ולכן מגיבים יותר להפרעות חיוניות של מסלולים חיוניים.

יצוין כי מסך מדכא לא תמיד לזהות שותפים איגוד מארח כמו דכאי, אבל זה עדיין יכול לסבך רכיבים קריטיים של מסלול מארח (s) ממוקדות, מניב השקפה הוליסטית של התהליכים הביולוגיים נחטף על ידי ה חלבון אפקטור חיידקי. על פני השטח, זה נראה מנוגד לאינטואיציה, משום שמתן שותף מחייב בחלבון האפקטור המיותר צפוי להציל את הפגם בגדילה. במאמצים לזהות מסלולים המיועדים על ידי C. trachomatis אפקטור חלבון CT229 (cpos), אשר נקשר לפחות 10 שונים רב GTPases במהלך זיהום5, אף אחד מהשותפים מחייב ראב לדכא את רעילות של CT229. עם זאת, מדכאי רבים המעורבים בסחר בסמים (CCV) מצופים, אשר הובילו לעבודה נוספת הממחיש כי CT229 במפורש פוגעת בסחר בנשק CCV. באופן דומה, בעת חקירת ה -C. burנתיבי אפקטור חלבון Cbu0041 (cira) כמה Rho GTPases כי הצילה את הפגם בגידול שמרים זוהו, ומאוחר יותר נמצא כי cira פונקציות כמו Gtpases הפעלת חלבון (גאפ) עבור rhoa4.

השימושיות של מסך מדכא שמרים להסבר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור לא יכול להיות יתר על המידה, וחוקרים אחרים מנסה לאפיין חלבונים תאיים אפקטור חיידקים יכול להפיק תועלת רבה מ טכניקות אלה. אלה מספרים הם בעלי ערך אם immunoprecipitations ו/או שמרים-שני מסכי היברידית לא הצליחו למצוא שותף מחייב והוא יכול להבהיר איזה מסלולים מיועדים על ידי חלבון אפקטור חיידקי. כאן, פרוטוקולים מפורטים עבור מסכי רעילות ומדכא כדי לזהות מסלולים ביולוגיים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריאלי תאיים אפקטור מסופקים, כמו גם כמה מכשולים נפוצים מנוסים בעת שימוש אלה בחני וה פתרונות תואמים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה וריאגנטים

הערה: לוחיות הרישוי צריכות להיות מוכנות לפני היום, וטובות לחודש אחד. מדיה וריאגנטים ניתן לעשות בכל שלב וטוב לחודש 1.

  1. להכין 1 L של תמיסת גלוקוז (10% w/v) על ידי המסת 100 g של D-(+)-גלוקוז ב 800 מ ל של מים מזוקקים בגביע 1, 000 mL. כוונן את אמצעי האחסון ל-1 ל' עם מים מזוקקים. סנן דרך מסנן סטרילי 0.2 יקרומטר לתוך בקבוק אחסון מדיה מעוקר 1 L.
  2. הכינו 1 ל' לפתרון הגלקטוז (10% w/v) על ידי המסת 100 גרם של D-(+)-גלקטוז ב 800 מ ל של מים מזוקקים בגביע L 1. כוונן את עוצמת הקול ל-1 mL באמצעות מים מזוקקים וסנן באמצעות מסנן סטרילי 0.2 יקרומטר לתוך בקבוק אחסון מדיה סטרילי 1,000 mL.
  3. להכין 1 L של תמצית שמרים peptone דקסטרוז (YPD) אגר על ידי המסת 10 גרם של תמצית שמרים, 20 גרם של peptone, 20 גרם של גלוקוז, ו 20 גרם של אגר ב 1,000 mL של מים מזוקקים. אוטוקלב עבור 20 דקות וקריר באמבט מים 56 ° c עד לקירור. יוצקים לתוך 100 מ"מ לוחות באמצעות ~ 20 מ ל של מדיה לצלחת.
  4. הכן 1 L של ציר YPD על ידי המסת 10 גרם של תמצית שמרים, 20 גרם של peptone, ו 20 גרם של גלוקוז ב 1,000 מ ל של מים מזוקקים. אוטוקלב עבור 20 דקות.
  5. להכין את הנושרת סינתטי (SD) אורציל (אורה-) גלוקוז אגר. עבור 1 L, לפזר 6.7 g של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 1.9 g של תוספת הנושרת ללא uracil, ו 15 גרם של אגר ב 800 mL של מים מזוקקים. אוטוקלב במשך 20 דקות וקריר באמבט מים ב56 ° c עד הטמפרטורה היא ~ 50-60 ° c. באמצעות הפיאוולוגית 50 mL או צילינדר לסיים סטרילי, להוסיף 200 mL של פתרון גלוקוז הכין בשלב 1.1. מערבבים היטב על ידי מתערבל בעדינות או מקום על צלחת מהומה. יוצקים לתוך 100 מ"מ לוחות באמצעות ~ 20 מ ל של מדיה לצלחת.
  6. הכינו את הנושרת הסינתטית (SD) אורציל (אורה-) גלקטוז אגר. עבור 1 L, לפזר 6.7 g של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 1.9 g של תוספת הנושרת ללא uracil, ו 15 גרם של אגר ב 800 mL של מים מזוקקים. אוטוקלב במשך 20 דקות וקריר באמבט מים ב56 ° c עד הטמפרטורה היא ~ 50-60 ° c. שימוש בפיפטה מ50 mL או בצילינדר הדרגתי סטרילי, מוסיפים 200 מ ל של פתרון הגלקטוז שהוכן בשלב 1.2. מערבבים היטב על ידי מתערבל בעדינות או מקום על צלחת מהומה. יוצקים לתוך 100 מ"מ לוחות באמצעות ~ 20 מ ל של מדיה לצלחת.
  7. הכנת הנושרת הסינתטית (SD) אורציל (אורה-) ציר גלוקוז. עבור 1 L, לפזר 6.7 g של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו ו 1.9 g של תוספת הנושרת ללא אורציל 800 mL של מים מזוקקים. אוטוקלב במשך 20 דקות וקריר באמבט מים ב56 ° c עד הטמפרטורה היא ~ 50-60 ° c. באמצעות הפיאוולוגית 50 mL או צילינדר לסיים סטרילי, להוסיף 200 מ ל של פתרון גלוקוז הכין בשלב 1.1.
  8. הכינו את הנושרת הסינתטית (SD) אורציל (יורה-) לאוצין (Leu-) גלוקוז אגר. עבור 1 L, לפזר 6.7 g של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו; 1.9 גרם של תוספת הנושרת ללא uracil, leucine, ו טריפטופן; 15 גר' אגר; ו 0.076 g של טריפטופן ב 800 מ ל של מים מזוקקים. אוטוקלב במשך 20 דקות וקריר באמבט מים ב56 ° c עד הטמפרטורה היא ~ 50-60 ° c. באמצעות הפיאוולוגית 50 mL או צילינדר לסיים סטרילי, להוסיף 200 mL של פתרון גלוקוז הכין בשלב 1.1. יוצקים לתוך 100 מ"מ לוחות באמצעות ~ 20 מ ל של מדיה לצלחת.
  9. הכנת נושרת סינתטית (SD) אורציל (אורה-) לאוצין (Leu-) גלקטוז אגר. עבור 1 L, לפזר 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו; 1.9 גרם של תוספת הנושרת ללא uracil, leucine, ו טריפטופן; 15 גר' אגר; ו 0.076 g של טריפטופן ב 800 מ ל של מים מזוקקים. אוטוקלב במשך 20 דקות וקריר באמבט מים ב56 ° c עד הטמפרטורה היא ~ 50-60 ° c. שימוש בפיפטה מ50 mL או בצילינדר הדרגתי סטרילי, מוסיפים 200 מ ל של פתרון הגלקטוז שהוכן בשלב 1.2. מערבבים היטב על ידי מתערבל בעדינות או הצבת על צלחת מהומה. יוצקים לתוך 100 מ"מ לוחות באמצעות ~ 20 מ ל של מדיה לצלחת.
  10. הכנת נושרת סינתטית (SD) אורציל (אורה-) לאוצין (Leu-) מרק גלוקוז. עבור 1 L, לפזר 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו; 1.9 גרם של תוספת של הנושרת ללא uracil, לאוצין, טריפטופן; ו 0.076 g של טריפטופן ב 800 מ ל של מים מזוקקים. אוטוקלב במשך 20 דקות וקריר באמבט מים של 56 עד 60 ° c עד שטמפרטורת הטמפרטורה היא ~ 50 ° c. באמצעות הפיאוולוגית 50 mL או צילינדר לסיים סטרילי, להוסיף 200 mL של פתרון גלוקוז הכין בשלב 1.1.
  11. להכין פוליאתילן גליקול (יתד) פתרון. הוסף 50% w/v של פוליאתילן גליקול 3350 מים מזוקקים. . לחטא על ידי אוטוקלינג
  12. להכין ליתיום אצטט 1 M (LiAc) על ידי המסת 10.2 g של אצטט ליתיום מייבשים ב 200 mL של מים מזוקקים. . לחטא על ידי אוטוקלינג
  13. . הכן דנ א של זרע הרינג לדלל 10 mg/mL זרע הרינג DNA ל 2 מ"ג/mL באמצעות מים מזוקקים. חום ב 100 ° צ' עבור 5 דקות ומיד מקום על הקרח עבור 5 דקות.

2. שיבוט הגן של עניין לתוך הרעלה רעילות שמרים pYesNTA-קאן

הערה: כיום, יש מגוון וקטורים רעילות שמרים זמינים הן מסחרית ומבחינה אקדמית. מסך מדכא שמרים ניתן להשתמש בשילוב עם רבים של וקטורים אלה בתנאי הפלבאמצע לבטא את החלבון אפקטור של הריבית משתמשת בחירת נושרת אחר מאשר אורציל וסמן אנטיביוטי אחר מאשר BlaR. עבודה זו השתמשה שונה pyesnta וקטור4,5 הכולל קלטת ההתנגדות kanamycin להקרנה קלה יותר עבור דכאי פוטנציאליים. מערכת השיבוט חייבת לאפשר לחלבון האפקטור להיות במסגרת עם היזם גל והתגית שלו. הכלמידיה הCT229 בחלבון קרום הממברנה שימש כהוכחה לעיקרון עבור מספר זה.

  1. השתמש ב-PCR כדי להגביר את הCT229 מ -C. trachomatis דנ א גנומית בעקבות הוראות היצרן באמצעות CT229 + 1 kpn F (ccggtacgtgccatpacatppppacpppppppppppppppppppppppp השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: (1) 98 ° צ' עבור 30 ס מ; (2) 98 ° צ' עבור 10 ס מ, 55 ° צ' עבור 30 s, 72 ° צ' עבור 2 דקות; (3) חזור על שלב 2 עבור סכום כולל של 25x; (4) 72 ° צ' במשך 10 דקות; ו-(5) 4 ° c להחזיק.
  2. ניתוח 5 μL של מוצר ה-PCR ב-1% צמח ג'ל (איור 1).
  3. לטהר את הנותרים 45 μL של ה-DNA באמצעות ערכת טיהור PCR בעקבות הוראות היצרן.
  4. לעכל את 50 μL של הוספת PCR מטוהרים ו pYesNTA-Kan (איור 2) עבור 1 h ב 37 ° c באמבט מים באמצעות kpni-hf ו-XHOI-hf.
    הערה: עבור pYesNTA-Kan, לעכל 5 μg של פלבאמצע באמצעות 5 μL של KpnI-HF, 5 μl של XhoI-HF, ו 6 μL של מאגר בנפח כולל של 60 μL. עבור התוספת, לעכל את כולו 50 μL של מוצר PCR מטוהרים באמצעות 2 μL של KpnI-HF, 2 μL של XhoI-HF, ו-6 μL של מאגר.
  5. הפעל את התקציר כולו על 1% ג'ל. לבצע טיהור של הפלסמיד מתעכל באמצעות ערכת החילוץ ג'ל לאחר הוראות היצרן.
  6. לטהר את הוספת ה-PCR מתעכל באמצעות ערכת טיהור ה-PCR בעקבות הוראות היצרן.
  7. שיבוט להכניס pyesnta-kan באמצעות 2 μl של pyesnta-kan (שלב 2.5), 2 μl של מאגר ליגאז DNA, 1 μl של T4 ליגאז, ו 15 μl של הוספה (שלב 2.6). . בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות
  8. להוסיף את תגובת השיבוט כולו כדי 50 μL של E. coli תאים מוכשרים ולבצע את תגובת טרנספורמציה.
  9. צלחת תגובת שינוי כולו על צלחת LB המכיל 100 μg/mL של carbenicillin.
  10. האיחסן 10 מ ל של LB המכיל 100 μg/mL של carbenicillin עם שלוש מושבות נפרדות. דגירה לילה ב 37 ° c עם טלטול ב 150 סל ד.
  11. בודד את הפלסטלינה באמצעות ערכת המינימום של הציוד לאחר הוראות היצרן.
  12. רצף את הפלמידים המבודדים בעזרת הצבעי היסוד הספציפיים לגנים (שלב 2.1).

3. מבחן חלבון העניין רעילות בשמרים

  1. מW303 על YPD אגר (שלב 1.3) כדי להשיג מושבות מבודדות. מודטה ב -30 ° c עבור 24 שעות.
  2. איחסן 10 מ ל של ציר YPD (שלב 1.4) עם מושבה אחת מהצלחת אגר (שלב 3.1). מודטה ב 30 ° c עם טלטול ב 150 rpm לילה.
  3. הוסף 0.5 mL של התרבות לילה ל 10 מ ל של ציר YPD (שלב 1.4) ו-דגירה ב 30 ° c עם טלטול ב 150 rpm עבור 4 h.
    1. גלולה 10 מ ל של התרבות ב 3,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    2. להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מים סטרילי, להעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה, ואת הגלולה ב 3,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של 1 מילימטר ליתיום אצטט (LiAc) ואת הגלולה ב 3,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. . חזור על השטיפה השנייה
    5. . הסר את הכביסה השהה מחדש את הגלולה ב 2.4 mL של 50% יתד 3350. הוסף 360 μL של 1M LiAc, 500 μl של 2 מ"ג/mL של DNA זרע הרינג, ו 400 μL של מים סטריליים.
      הערה: הדבר מספיק ל-20 שינויי צורה.
    6. הוסף 180 μL של ערבוב השינוי משלב 3.3.5 לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 5 μL של pYesNTA-Kan-קן CT229 פלמיד DNA (100-500 ng) משלב 2.12.
    7. דגירה באמבט מים 30 ° c עבור 30 דקות.
    8. דגירה באמבט מים ב 42 ° c עבור 30 דקות.
    9. גלולה ב 3,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. הסירו את ערבוב הטרנספורמציה עם הפיפטה. השהה מחדש את הגלולה ב-100 μL של מים סטריליים. צלחת הטרנספורמציה על SD Ura- אגר עם גלוקוז (שלב 1.5).
    11. לוחיות הדגירה ב 30 ° c עבור 48 h.
  4. איחסן 5 מ ל של SD Ura- ציר המכיל גלוקוז (שלב 1.7) עם מושבה אחת מן הצלחת. דגירה הלילה ב 30 ° צ' עם טלטול ב 150 סל ד. כלול שמרים השתנה עם וקטור לבד כפקד שלילי.
    1. להוסיף 180 μL של מים סטריליים ל 5 בארות של 96 צלחת הבאר (A2-A6).
    2. מערבולת התרבות הלילה לערבב.
    3. הוסף 180 μL של שמרים לבאר הראשונה (A1). סרילית לדלל 1:10 (6 דגימות בסך הכל כולל ללא מדולל).
    4. שימוש בפיפטה רב-ערוצית, ספוט 5 μL של כל דילול ב- SD Ura-גלוקוז (שלב 1.5) ואורה- גלקטוז (שלב 1.6) לוחות אגר. מודטה ב 30 ° c עבור 48 h.
  5. העריכו את הרעילות על ידי השוואת התפתחותם של השמרים המבטאים את חלבון האפקטור של הריבית הגדלה על המדיה המכילה את גלקטוז לצמיחת שמרים המבטאים את הווקטור בלבד.
  6. אשר את הביטוי של חלבון היתוך שלו על ידי הכתמים המערביים.

4. שינוי צורה של שמרים רעילים עם הספרייה גנומית שמרים

  1. איחסן 100 mL של ה-SD Ura- ציר גלוקוז (שלב 1.7) באמצעות 1 mL של המניה משלב 3.4. המשך 16-עד 24 שעות ב 30 ° צ' עם טלטול ב 150 סל ד. מקום 900 mL של ה- SD Ura-ציר גלוקוז ב 30 ° c ללילה כדי לחמם את התקשורת.
  2. להוסיף את כל 100 mL של התרבות לילה לבקבוקון prewarmed 1. המשך 4 עד 5 שעות ב 30 ° צ' עם טלטול ב 150 סל ד.
    1. מצנע את התרבות ב-6,000 x g במשך 10 דקות ב -4 ° c.
    2. . מחק את הסופרנטאנט השהה את הגלולה ב-250 מ ל של מים סטריליים. מצנע את התרבות ב-6,000 x g עבור 5 דקות ב -4 ° c.
    3. . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה ב 250 מ ל של 1 מ"מ LiAc. מצנע את התרבות ב-6,000 x g עבור 5 דקות ב -4 ° c.
    4. הסר LiAc והשהה מחדש את הגלולה ב 9.6 mL של 50% יתד 3350. הוסף 1.44 mL של 1M LiAc, 2 מ ל 2 מ"ג/mL זרע הרינג DNA, 50 μg של הספרייה הגנומית pYep13 (ATCC 37323). כוונן את עוצמת הקול ל-15 מ"ל עם מים סטריליים. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך.
    5. דגירה באמבט מים 30 ° c עבור 30 דקות.
    6. הוסף 750 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לשפר את יעילות השינוי. דגירה באמבט מים ב 42 ° c עבור 30 דקות. מערבבים באמצעות היפוך עדין כל 10 דקות.
    7. גלולה השמרים ב 3,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של מים סטריליים. גלולה ב 3,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. השהה את הגלולה ב -8 מ ל. של מים סטריליים
    10. כדי לקבוע את יעילות השינוי, לדלל 1:10 ו צלחת 100 μL של כל דילול ב-SD Ura- Leu- גלוקוז אגר (שלב 1.8).
    11. צלחת 200 μL של המדגם על SD Ura- Leu- גלקטוז אגר (שלב 1.9) צלחות. השימוש 50 צלחות בסך הכל.
    12. מודטה ב -30 ° c עבור 48 עד 96 שעות או עד שמושבות מופיעות.
      הערה: המושבות מופיעות בדרך כלל על לוחיות הגלוקוז ב-48-72 שעות ובצלחות גלז אגר ב-72 עד 96.
  3. תיקון מושבות (מציל פוטנציאליים) על SD Ura- Leu- גלקטוז אגר (שלב 1.9) כדי להרחיב ולעשות מניות. מודטה ב -30 מעלות צלזיוס עבור 24 שעות.
  4. איחסן 5 מ ל של SD Ura- Leu- ציר גלוקוז (שלב 1.10) באמצעות החלק של התיקון. דגירה הלילה ב 26 ° צ' עם טלטול ב 150 סל ד.
    1. להוסיף 180 μL של מים סטרילי ל 5 בארות של 96 צלחת הבאר (A2-A6).
    2. מערבולת התרבות הלילה לערבב.
    3. הוסף 180 μL של שמרים לבאר הראשונה (A1). סרילית לדלל 1:10 (6 דגימות בסך הכל כולל ללא מדולל).
    4. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, ספוט 5 μL של כל דילול ב-SD Ura- גלוקוז ו-sd ura- גלז אגר צלחות. כלול אפקטור רעיל לבד כפקד.
    5. מודטה ב 30 ° c עבור 48 h.
  5. להשוות את הצמיחה של שמרים לבטא את האפקטור רעיל לבד שמרים המכילים את דכאי פוטנציאליים. רק להמשיך עם דכאי פוטנציאליים כי יש רעילות מופחתת לעומת שמרים לבטא את האפקטור לבד.

5. זיהוי ואישור דכאי

  1. האיחסן 5 מ ל של SD Ura- Leu- ציר גלוקוז (שלב 1.10) עם 100 μl של שמרים משלב 4.4 ו-דגירה לילה ב 30 ° צ' עם טלטול ב 150 rpm.
    1. גלולה השמרים ב 3,000 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. מחק בעדינות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.
    2. בודד את הפלסמיד עם ערכת המינימנה של שמרים פלסטלינה לאחר הוראות היצרן.
  2. הפוך את הפלביניים המבודד לתוך התאים E. coli מוסמך צלחת הטרנספורמציה כולה על LB אגר עם 100 μg/mL של carbenicillin. מודטה ב 37 ° c עבור 24 שעות.
  3. האיחסן 10 מ ל של מרק LB המכיל 100 μg/mL של carbenicillin, עם שלוש מושבות מן הצלחת ו דגירה ב 37 ° c לילה עם טלטול ב 150 rpm.
    1. התרבויות גלולה ב 3,000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. בודד פלסמיד באמצעות ערכת miniprep לאחר הוראות היצרן.
  4. שינוי מחדש של שמרים רעילים עם פלמידים מבודדים משלב 5.3.1 בעקבות השלבים בחלק 3 של הפרוטוקול.
    1. איחסן 5 מ ל של SD Ura- Leu- ציר גלוקוז עם מושבה מלוחית השינוי. דגירה הלילה ב 30 ° צ' עם טלטול ב 150 סל ד.
    2. ספוט באורה- מLeu- גלוקוז וגלקטוז אגר לאישור דיכוי הרעילות.
  5. רצף באמצעות pYep13 F (ACTACGCGA) ו-pYep13 R (TGATGCCGGCGC) התחל לזהות ORFs שמרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפני מסך מדכא שמרים בפועל ניתן לבצע, חלבון הריבית של אפקטור העניין חייב להיבדק עבור רעילות בשמרים. זה מושגת על ידי ביטוי חלבון העניין של שמרים תחת שליטתה של מקדם גלקטוז-inducible. הצמיחה על גלוקוז (תנאים שאינם מחייבים) יש להשוות תחילה כדי להבטיח רעילות היא במיוחד בשל ביטוי של חלבון הריבית והוא לא פגם כללי. כפי שמוצג באיור 3, רעילות מתבטאת כמושבות קטנות יותר ו/או צמיחה מופחתת. ירידה של 2-3 הרישום בצמיחה שמרים הוא אידיאלי עבור מסכי מדכא שמרים.

בדומה למוצג

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר הליכים צעד אחר צעד לזיהוי מסלולים ביולוגיים מארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור באמצעות הרעלת שמרים שונה מסך מדכא. זן שמרים השתמשו, ס cerevisiae ס W303, הוא auxotrophic עבור אורציל ו leucine. Uracil הגביע של הנבג משמש כדי לבחור שמרים נושאת את החלבון של עניין על pYesNTA-Kan וקטור בעוד לאוסין משמש הגביע משמשת כדי לבחור עבור שמרים הספריה גנומית וקטור pYep13. הספריה הגנומית של הספרייה שמרים לשאת 3 על 13 ORFs, כך כל ORFS צריך להיות משוכפל בנפרד לתוך וקטור p415-ד6 או וקטו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לשלבי אנדרסן, אבי מקלאוף, ולורל וודס על עזרתם בטכניקות אלו. מחקר זה מומן על ידי כספי האתחול מאוניברסיטת איווה המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה כדי מרי מ. וובר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher ScientificBP2641500
GalactoseMilliporeSigmaG0750-1KG
ערכת מיצוי ג'ל GeneJet ThermoFisherScientificK0691
ערכת טיהור GeneJet PCRThermoFisher ScientificK0701
ערכת מיני-הכנה פלסמידGeneJet ThermoK0503
גלוקוזMilliporeSigmaG8270-1KG
הרינג זרע DNAPromegaD1811
KpnI-HFניו אינגלנד BiolabsR3142S
ליתיום אצטט דיהידראטMilliporeSigmaL6883-250G
פפטוןפישר מדעי
Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראזניו אינגלנד מעבדותביולוגיותM0530
פולי (אתילן גליקול) 3350MilliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 DNA ליגאזניו אינגלנד BiolabsM0202S
טריפטופןMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFניו אינגלנד BiolabsR0146S
תמצית שמריםפישר ScientificBP1422-500
ערכת מיני-הכנה לשמריםZymoD2001
בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינוMilliporeSigmaY0626-250G
שמרים סינתטיים נשירה בינונית תוספי תזונהMilliporeSigmaY1501-20Gללא uracil
שמרים סינתטיים נשירה תוספי תזונה בינונייםMilliporeSigmaY1771-20G אורציל, לאוצין, טריפטופן
ללא

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles