לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.

תקציר

לכידת לייזר (LCM) היא כלי רב עוצמה לבידוד סוגי תאים ספציפיים או אזורים מעניינים מרקמות הטרוגניות. המורכבות התאית והמולקולרית של יסודות השלד גדלה בפיתוח. טרוגניות רקמות, כגון בממשק של הסחוס ואלמנטים osseous אחד עם השני או עם הרקמות הסובבות, הוא אחד מכשול למחקר של פיתוח סחוס ועצם. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מהירה של עיבוד רקמות ובידוד של סחוס ועצם התשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח ביטוי גנים. הרקמות הקפואות טרי של עוברי העכבר הם מנות ומכתים קצר cresyl סגול משמש להמחיש סחוס ועצם עם צבעים נפרדים מרקמות המקיפים. השקופיות מיובשות אז במהירות, והסחוס והעצמות מבודדים לאחר מכן על ידי LCM. מזעור החשיפה לפתרונות מימית במהלך תהליך זה שומר על שלמות RNA. הסחוס ועצם הלסת של העכבר על E 16.5 היו נאספים בהצלחה וניתוח ביטוי גנטי הראה ביטוי דיפרנציאלי של גנים סמן עבור אוסטאופתי, אוסטאופציטים, אוסטאופםנמשך, ו כונדרוציטים. באיכות גבוהה RNA היה גם מבודד מתוך מגוון של רקמות וגילאים עובריים. פרוטוקול זה הכנה לדוגמה של LCM כולל קריוהטבעה, הפחתה, כתמים והסרת לחות של רקמות קפואות טריות, ובידוד מדויק של סחוס ועצם על ידי LCM וכתוצאה מכך באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח transcript.

מבוא

מערכת השלד והשרירים היא מערכת מרובת רכיבים המורכבת שריר, רקמת חיבור, גיד, רצועה, סחוס, ועצם, innervated על ידי עצבים ובאמצעות כלי דם¹. רקמות השלד להתפתח עם הגדלת טרוגניות הסלולר והמורכבות המבנית. סחוס ועצם להתפתח מאותו השושלת האוסטכונדרוקדמון, הם קשורים מאוד. הסחוס ועצם עובריים להתפתח בשיתוף עם השרירים, העצבים, כלי הדם, מובחן mesenchyme. הסחוס עשוי גם להיות מוקף עצם, כגון הסחוס של מקל הסחוס condylar בתוך עצם הלסת. רקמות אלה משויכים מבחינה אנטומית ומתקשרים אחד עם השני באמצעות אותות משוונים במהלך הפיתוח. במחקר של ביטוי גנים בהתפתחות של סחוס ועצם, מכשול אחד הוא הטרוגניות של מבנים השלד מורכב מסוגים מרובים של רקמות. בידוד מדויק של רקמת העניין הספציפית הוא המפתח לניתוח מוצלח של הטרנססקריפט.

לכידת לייזר (LCM) הוא כלי רב עוצמה כדי לבודד את סוגי התאים או אזורים המעניינים בתוך רקמות הטרוגניות, והוא הינו רגיש לרמה תא בודדת². זה יכול בדיוק למקד וללכוד את התאים של עניין עבור מגוון רחב של במורד הזרם בחני אמר ב transcript, גנומיקה, ו פרוטאומניקס^3,4. האיכות של ה-RNA המבודד, ה-DNA או החלבון יכול להיות מוערך עם הפלטפורמה bioanalyzer או שווה ערך. לדוגמה, איכות ה-RNA מצוינת על-ידי מספר התקינות של RNA (RIN)⁵.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לצביעת ובידוד מהירה של סחוס ועצם על ידי LCM מרקמות קפואות טריות. אנו משתמשים העובר העכבר כדי להדגים כי פרוטוקול זה תשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח הטרנססקריפט הבאים, כגון רצפי RNA (RNA-seq).

פרוטוקול

רקמות מעכברים הושגו בהתאם למכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, ופרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים בבית הספר Icahn לרפואה בהר סיני.

1. הכנת הדגימה קפואים טריים

1. . מנתח את העובר או את רקמת הריבית הטמע את המדגם בתבנית הטבעה חד פעמית עם מתחם החיתוך האופטימלי (OCT). להתאים את כיוון הדגימה עם טיפ או מחט.
2. הקפאת במהירות את הדגימות באמבט קרח יבש/מתיל-בוטאן 2. המשך לשלב או לחנות הבאים ב--80 ° c.
   הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

2. הקפאה ללכידת בלייזר

1. להפשיר את הקריוסטט ומשטחים פנימיים נקיים עם 70% אתנול. לטפל לוחית נגד רול וזוג מלקחיים עם סוכן הטיהור RNase. הגדר את הקריוסטט לטמפרטורת החיתוך הרצויה (-18 עד 22 ° c). הכינו מיכל כימי עם קרח יבש, הצבת גיליון נייר אלומיניום על הקרח היבש לאחסון זמני של שקופיות המדגם במהלך ההקפאה.
   זהירות: . קרח יבש קר מאוד תמיד לטפל בקרח יבש עם טיפול וללבוש כפפות מבודדות בכל פעם שהוא מטפל בו.
2. העבר את הדגימה הקפואה הטרייה. לתוך דלי של קרח יבש מניחים שכבה של מתחם OCT על בעל הדגימה קריוסטט ומיד מקום הדגימה על גבי OCT עם לחץ עדין. כאשר OCT קפוא לחלוטין, להדק את המחזיק עם הדגימה לתוך הזרוע החותכת קריוסטט.
3. השאר את הדגימה בקריוסטט במשך 15 דקות עד לטמפרטורה החיתוך.
4. מדור את הרקמה ולאסוף את הפרוסות על מחליק פוליאתילן (עט) ממברנה בעובי של 12 μm. יישר מקטעים עוקבים על הקרום. לאחר השלמת שקופית אחת, אפשר למקטעים להתייבש למשך מספר דקות ולהעביר את השקופית לנייר הכסף במיכל הקרח היבש עד לאיסוף כל השקופיות הנדרשות.
5. אחסן את השקופיות ב--80 ° c בתיבת שקופיות.
   הערה: עובי המקטע נבחר כדי למקסם את כמות הרקמה שנאסף תוך מתן אפשרות חיתוך יעיל של הרקמה, והוא עשוי להשתנות בהתאם לרקמת הריבית. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. שמרו על שקופיות חופשיות מזיהום RNase. הימנע משינויי טמפרטורה. למרות RINs של RNA משקופיות המאוחסנות עד 6 חודשים עשויים עדיין להצביע על איכות גבוהה של RNA, אנו ממליצים להשתמש בשקופיות בהקדם האפשרי.

3. הכנה לדוגמא ללכידת לכידת לייזר

1. הכינו פתרונות לצביעת והתייבשות.
   1. מקום 45 mL של 80% אתנול בכל אחד מ-3 50 שפופרות צנטריפוגה mL על קרח. תייג אותם כ#1, #2 ו#3. לדלל אתנול עם RNase/DNase מים חופשיים.
   2. מקום 45 mL של 95% אתנול בשפופרת הצנטריפוגה 50 mL על קרח.
   3. מקום 45 mL של 100% אתנול בשפופרת הצנטריפוגה 50 mL על קרח.
   4. מקום 45 mL של קסילן בתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL בטמפרטורת החדר.
      זהירות: . קסילין צריכה לשמש בתוך מכסה המנוע
2. הפשרת שקופית ממברנה של עט בקצרה על ידי הצבת אותו על יד כפולה, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עבור 30 כל אחד ב 45 mL של 80% אתנול (#1 ו#2) עם עצבנות ב 50 שפופרת צנטריפוגה mL כדי להסיר את OCT.
   הערה: חשוב להסיר את OCT לפני הצביעת, כדי למנוע מאוקטובר התיר במהלך הצביעת לטשטש את הסעיפים. מלקחיים ניתן להשתמש כדי להקל על ההסרה של OCT כי הוא לא נשטף על ידי עצבנות.
3. הנח שקופית על גיליון של רדיד אלומיניום. פיפטה 0.8 mL של 0.1% cresyl סגול ב 50% אתנול על השקופית וכתם עבור 30 s. לשטוף את השקופית ב 45 mL של 80% אתנול (#3) עבור 30 s, ולאחר מכן מייבשים במעבר עבור 30 כל אחד דרך 45 mL של 95% אתנול, 100% אתנול, ו קסילן בתוך 50 לצינורות צנטריפוגה mL.
4. לעמוד שקופיות על מגב משימה עדין עבור 5 דקות כדי לנקז מחלקים יבשים.
   הערה: יש לייבש שקופיות לגמרי לפני LCM.

4. לכידת לייזר מיקרודיסקציה

הערה: ללבוש אבקת כפפות מניטריל חינם בעת ביצוע LCM.

1. הפעל את מיקרוסקופ LCM, לייזר ומחשב. היכנס למחשב והפעל את התוכנה. להפוך את המפתח "On" מיקום להפעיל את הלייזר. כאשר אור ירוק (לייזר) הוא על, לחץ על הכפתור האדום כדי להפעיל את הלייזר, ולאחר מכן את האור (לייזר) הופך אדום המציין לייזר הוא מוכן לשימוש.
   הערה: הלייזר צריך כ 10 דקות כדי להתחמם.
2. הגדר את צינורות הגבייה.
   1. הכנס את הכובע של 0.5 mL פולימראז תגובת שרשרת (PCR) צינור לתוך האספן.
      הערה: בחר את האספן המתאים לצינורות ה-PCR הרצויים (0.2 או 0.5 mL).
   2. פיפטה 50 μL של מאגר החילוץ (מסופק על ידי ערכת בידוד RNA המפורטים בטבלת החומרים) לתוך הכובע של שפופרת אוסף mL 0.5.
   3. הכנס את התקן האיסוף למיקרוסקופ.
   4. בחלון ' שינוי התקן מלקט ', לחצו על הלחצן ' העבר לנקודת התייחסות ' כדי להעביר את האספן לנקודת ההתייחסות (RP). כוונן את המוקד כדי להציג בבהירות את ה-RP. לחץ על החיצים כדי להזיז את ה-RP למרכז התצוגה.
3. טען שקופיות דגימה.
   1. לחץ על לחצן ' בטל טעינה ' שמאלי בסרגל הכלים כדי להקטין את מחזיק השקופיות.
   2. מניחים את השקופית לתוך המחזיק, כשחתך הרקמה פונה כלפי מטה.
      הערה: התמצאות זו מבטיחה שמקטעי הרקמה השבויים יפלו לתוך המכסה של צינור הכבידה.
   3. הכנס את המחזיק חזרה לבמה.
4. . הגדר את פרמטרי הלייזר
   1. בחר באפשרות הפקד של תפריט הלייזר או לחץ על סמל הלייזר .
   2. כוונן פרמטרים אלה כרצונך: כוח, כוח הלייזר; צמצם, רוחב הלייזר; ומהירות, את המהירות של חיתוך במצב לצייר ולחתוך .
      הערה: בדוק את הלייזר באזור מחוץ לעניין. כוח גבוה יותר או צמצם גדול יותר מקל לגזור אך גורם נזק נוסף לתאים. להתאים את השילוב של כוח, צמצם, ומהירות כדי להשיג גזירה יעילה ונזק מינימלי של הרקמה. לדוגמה, Power = 40, צמצם = 5, ומהירות = 7 עבור רקמת הסחוס בסעיף 12 יקרומטר.
5. בחר וגזור תחומי עניין.
   1. התחל עם המטרה 5x ולמצוא את תחומי העניין, ולאחר מכן לעבור את המטרה (5x, 10x, או 40x) המראה הטוב ביותר את אזור הריבית.
      הערה: לאחר כתמים קרסיל סגול, הסחוס מוכתם מגנטה ורקמות מינרליזציה מופיעות חום או שחור, להבדיל מרקמות אחרות. ניתן לשמור תמונות באמצעות ' שמור תמונה בשם ' מתפריט הקובץ .
   2. בחר את הצינור עבור אוסף (A, B, C, D) על ידי לחיצה על הסימון על האספן.
   3. בחר באפשרות הזז וגזור או צייר וגזור. במצב מעבר וחיתוך , הדגימה נחתכת באופן ידני, באמצעות העכבר או העט של מסך המגע כדי לצייר צורות ביד חופשית. במצב ציור וחיתוך , צורות עשויות להיות מצוירות ביד חופשית עם העכבר או העט של מסך המגע לחיתוך העוקב. לחץ על לחצן התחל גזור כדי ליזום חיתוך לייזר.
   4. לאחר הגזירה הושלמה, רקמת היעד עם קרום העט נופל לתוך כובע של צינור האוסף על ידי כוח הכבידה. חזור על 4.5 כדי לאגר תחומי עניין מרובים במידת הצורך.
      הערה: חתכים חוזרים או הגדלת כוח או צמצם עשוי להיות הכרחי אם הרקמה לא ירידה לתוך כובע של צינור האוסף עקב חיתוך שלם. עצם מינרליזציה (חום או שחור) לא ניתן לגזור ישירות על ידי לייזר.
6. פרוק את האספן וסגור בזהירות את צינור ה-PCR. מניחים את רקמות המיקרוגזור בקרח יבש. המשך לשלב או לחנות הבאים ב--80 ° c.
   הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. חזור על 4.2 ל-4.6 עבור המדגם הבא.

5. הליזה של רקמות מיקרו ובידוד RNA

1. הפשרת רקמות המיקרוגזור בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בקצרה את הדגימות במשך 30 דקות ב 42 ° c.
2. לאחר הדגירה, לסובב את מאגר הליזה למטה לתוך הצינור 0.5 mL PCR. בצע טיפול DNase וחילוץ RNA באמצעות ערכת בידוד RNA (ראה טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן.

תוצאות

קטעים coronal של רקמות העכבר הקפוא קפואים ב-E 16.5 שימשו כדי להדגים את הבידוד ואת האוסף של הסחוס של Meckel (MC), סחוס condylar, ועצם הלסת על ידי LCM. עוברי עכבר על E 16.5 היו גזור מוטבע בתבניות קריוגניים עם מתחם OCT. דגימות בתבניות היו קפואות במהירות בקרח יבש ובמרחץ מתיל-2-בוטאן ואוחסנו ב-80 ° c.

כדי להפגין כתמים קרסיל סגול של סחוס ועצם, הקפאה במטוס ילתית בוצע ודגימות נאספו על שקופיות מיקרוסקופ. מקטעים נשטפו, ויטראז והתייבשות בעקבות הפרוטוקול לעיל (שלב 3.2 – 3.4). השקופיות היו יבשות מיובשות ומ...

דיון

LCM מאפשרת בידוד של אוכלוסיות תאים מועשר או הומוגניים מרקמות הטרוגניות. היתרונות שלה כוללים לכידת מהירה ומדויקת של תאים בהקשר vivo שלהם, בעוד חסרונות פוטנציאליים כוללים אותו להיות זמן רב, יקר, ומוגבל על ידי הצורך המשתמש לזהות אוכלוסיות משנה נפרדות בתוך דוגמה מסוימת³⁰. פרוטוקול זה מספק פרטים של LCM של סחוס מעובריים העכבר העצם, הדגשת השימוש של cresyl סגול כתמים בהליך מהיר כדי להמחיש את הסחוס ואת העצם לאוסף רקמות מדויק תוך שמירה על שלמות RNA גבוהה עבור ניתוח עוקבות על ידי RNA-seq. מגבלה אחת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-Methylbutane	ThermoFisher Scientific	O3551-4
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
צינור צנטריפוגה	ThermoFisher Scientific	339653	צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן חרוטי, 50 מ"ל
קרסיל סגול אצטט	Sigma-Aldrich	C5042
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S
מגב משימות עדין	ThermoFisher Scientific	06-666
תבנית הטבעה חד פעמית	ThermoFisher Scientific	1220
מים מזוקקים	Invitrogen	10977-015	אתנול ללא DNase/RNase
, מוחלט (200 הוכחה)	ThermoFisher Scientific	BP2818	ביולוגיה מולקולרית כיתה
זכוכית PEN קרום שקופית	Leica Microsystems	11505158
מערכת LCM	Leica Microsystems	Leica LMD6500
כיסוי מיקרוסקופ זכוכית	ThermoFisher Scientific	12-545FP
שקופיות מיקרוסקופ	ThermoFisher Scientific	12-550-15
OCT תרכובת	מיקרוסקופיה אלקטרונית	102094-106
צינור PCR עם מכסה שטוח, 0.5 מ"ל	Axygen	PCR-05-C	LCM הרכבה
קבועה	ערכת בידוד מעבדות וקטור	H-5000
RNA ThermoFisher	Scientific	KIT0204
חומר טיהור RNase	Sigma-Aldrich	R2020	RNase חומר טיהור לניקוי משטחים
קסילן	סיגמא-אולדריץ'	214736