הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60511

⸱

27 בנובמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, 2Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, 3Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, 4Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, 5Department of Biochemistry, University of Lausanne

במאמר זה

סיכום

הסיכות ולולאות של RNA יכולות לתפקד כצבעי יסוד לתמלול הפוכה (RT) בהיעדר התחל העצמי הספציפי ברצף, הפרעה למחקר של התעתיקים החופפים של התמלילים. פיתחנו טכניקה מסוגל לזהות את ה-RNA ספציפי סטרנד, ואנחנו השתמשנו בו כדי ללמוד HIV-1 antisense חלבון ASP.

תקציר

ב retroviruses, שעתוק החושים שתוארו בנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) ו-T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1). ב-HIV -1, החלבון antisense של ASP גן ממוקם על סטרנד שלילי של env, במסגרת הקריאה -2, הפורש את הצומת gp120/gp41. בכיוון ההגיון, הקצה של 3 מסגרת הקריאה של ASP חופף עם V4 של אזורים gp120-משתנים ומספר V5. המחקר של ה-RNA ASP סוכלה על ידי תופעה המכונה RT-self-הטרמה, לפיו מבנים משניים RNA יש את היכולת הממשלה RT בהעדר של פריימר ספציפי, יצירת cDNAs לא ספציפי. השימוש המשולב בשילוב עם כדורי היסוד הפוכים ביולוגית בתגובת RT, יחד עם האהדה לטיהור של cDNA על streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים, אפשרה לנו באופן סלקטיבי להגביר את ה-RNA של ASP בתאים CD4 + T נגזר מאנשים נגועים ב-HIV-1. השיטה שלנו היא בעלות נמוכה יחסית, פשוט לבצע, מאוד אמין, ובקלות להיות מתוכדל. במובן זה, הוא מייצג כלי רב עוצמה לחקר שעתוק החושים לא רק ב-HIV-1 אלא גם במערכות ביולוגיות אחרות.

מבוא

החלבון antisense (ASP) הגן הוא מסגרת קריאה פתוחה (ORF) הממוקם על סטרנד שלילי של הנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) המעטפה (env) גן, הפורש את הצומת gp120/gp411. במהלך 30 השנים האחרונות, מספר דיווחים הראו כי הגן HIV ASP הוא אכן מועתק ותורגם2,3,4,5,6,7,8,9. למרות התעתיקים של ASP antisense כבר מאופיין באופן מלא בתוך מבחנה, עד לאחרונה מידע על הייצור בפועל של ה-RNA של ASP בחולים עדיין חסר.

הרצף של ASP הוא הפוך ומשלים ל-env. זה מייצג מכשול גדול כאשר מנסים לזהות תעתיקים של ASP. שיטת הפוך סטנדרטית לתגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) שיטות משתמשות גנטית ספציפית אנטי הגיון לסנתז DNAs משלימה (cDNAs) של הקוטביות הימנית. גישה זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת לקבוע את הכיוון (תחושה או אנטי-היגיון) של תבנית ה-RNA הראשונית, מכיוון שסיכות או לולאות של RNA יכולות להיות מראש בשני הכיוונים בהעדר התחל10, תופעה הידועה כ-RT-הטרמה עצמית. רוב החוקרים ASP הבעיה של RT הטרמה עצמית באמצעות תחל מתויג עם רצפים שאינם קשורים ל-HIV-111,12. אסטרטגיה זו, עם זאת, אינה מבטלת את התרחשות התופעה, ועלולה לגרום לנשיאה פוטנציאלית של cDNAs שאינו ספציפי ל-PCR11.

פיתחנו לאחרונה הרומן מיוחד סטרנד-PCR שיטת המחקר של RNA antisense ואנחנו השתמשנו בו עבור הזיהוי של ה-RNA ASP בקבוצה של שישה חולים נגועים באיידס, כפי שמוצג בטבלה 1. ההליך המתואר להלן פורסם בעבר על ידי אנטוניו Mancarella ואח '13. בפרוטוקול שלנו, אנו נמנעים מהפקת cDNAs לא ספציפי באמצעות גישה כפולה. ראשית, אנו מסלקים מבנים משניים של RNA על ידי שימוש ב-RNA בטמפרטורה גבוהה (94 ° c), ושנית, אנו הפוכה להפוך את ה-RNA של ASP באמצעות פריימר ביולוגי ברמה של ASP ואהדה-לטהר את התוצאה cDNA. על-ידי גישה זו, אנו מסוגלים להגביר רק את היעד שלנו cdna, מאז מוצרי RT אחרים שאינם ספציפיים מנועים או שנוצר (הטמפרטורה הגבוהה דנטורציה של RNA) או נמחק לפני ה-PCR (טיהור האהדה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מרכז אשפוז ודוייס (CHUV).

1. זיהום של דם היקפי תאים ברורים (PBMCs) עם HIV-1HXB2 זן

  1. יום 1: גירוי PBMCs
    1. לבודד PBMCs מעיל באפי תורם בריא.
    2. לספור ולהשעות מחדש PBMCs בריכוז של 1x106/mL בשנת מלאה רוזוול פארק הזיכרון המכון (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% סרום העוברי (fbs) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (R-10), עם תוספת של 50 U/ml של interleukin-2 (IL-2) ו 3 μg/ml פיטופפניטין (PHA).
    3. Pipet למעלה ולמטה ולפצל את התאים ב 2 6-טוב צלחות (3 מ ל של השעיית תא/טוב).
    4. דגירה עבור 3 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. יום 3: זיהום PBMCs
    הערה: השתמש באחת משתי הלוחיות כמו בשלב 1.1.3 כפקד שלילי (אל תדביק תאים אלה).
    התראה: בצע את ההליך כולו במעבדה III ברמת בטיחות (P3).
    1. PBMCs בריכה מצלחת אחת לתוך שפופרת בז 50 mL וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות.
    2. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 2.2 mL של R-10 המכיל 20 U/mL של IL-2 ו-2 μg/mL polybrene.
    3. הפשרת מבחנות המכילה את נגיף ה-HIV-1HXB2 ולהוסיף 1.8 mL של השעיה ויראלי (0.376 Ng/μl) אל התאים.
    4. מודרת התאים 2 h ב 37 ° c, בעדינות מתערבל את הצינור כל 30 דקות.
    5. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות.
    6. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-1x106/ml ב-R-10 המכיל IL-2 (50 U/ml).
    7. העבר את ההשעיה התא לצלחת 24-באר בריכוז של 1 מ ל/ובכן ו דגירה עבור 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    8. קציר 1 גם כל יום ולהעביר את התאים 1.5 mL שפופרת (מתויג עם יום של זיהום).
      הערה: לפני צנטריפוגה, העברת 150 μL של השעיית התא לצינור cy try זרם עבור PBMCs בקרת איכות זיהום (ראה שלב 1.3)
    9. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x g עבור 10 דקות ולהיפטר supernatant.
    10. הקפא את כדורי התא בשעה-80 ° צ' עד השימוש.
  3. זיהום PBMCs: בקרת איכות
    1. עבור כל יום של זיהום, לאסוף 150 μL של הנגועים PBMCs ולהעביר אותם לתוך הצינור cy, לנסות לזרום.
    2. הוסף 1 מ ל של מלוחים מאגור פוספט (PBS) ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
    3. להיפטר supernatant ולהוסיף 50 μL של PBS המכיל 1 μL של אקווה חיים/צבע מת (בעבר מדולל 1:10 עם PBS).
    4. מודקון ב 4 ° צ' עבור 15 דקות.
    5. הוסף 1 mL של PBS, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות, ולהיפטר supernatant.
    6. הוסף 250 μL של הפתרון קיבעון/החדירות ו-דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    7. להוסיף 1 מ ל של 1x סלסול/לשטוף מאגר (מניות 10x פתרון המכיל הן fbs ו סאפונין מדולל 1:10) ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
    8. להיפטר supernatant ולהוסיף 50 μL של PBS המכיל HIV מחסום p24 fluorescein isothiocyanate (FITC)-נוגדן מצומדת (מדולל 1:10).
    9. דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    10. הוסף 1 mL של PBS, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות, ולמחוק את supernatant.
    11. הוסף 150 μl של x cellfix (מניות 10x פתרון המכיל 10% פורמלדהיד, 3.55% מתנול, 0.93% נתרן אזיד מדולל 1:10) ולנתח תאים על ידי הזרמת cytometry.

2. גירוי של CD4 + תאים אנושיים עם אנטי CD3/CD28 נוגדנים

  1. בודד CD4 + T תאים מתוך PBMCs של שני חולים נגועים ב-HIV-1 ותורמים בריאים.
  2. להכין אנטי CD3/CD28 נוגדן לערבב על ידי דילול anti-CD3 (1:100) ו anti-CD28 (1:50) ב-PBS.
  3. מעיל 48-צלחת לוח על-ידי הוספת 200 μL של שילוב נוגדן לכל טוב למספר מתאים של בארות ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 2 h.
  4. משף את פתרון הנוגדן ולהוסיף 1 מ"ל של CD4 + T תאים ב-1x106/mL כדי ANTI-CD3/CD28 מצופה נוגדן בארות.
    הערה: להמריץ CD4 + T תאים עד 5 ימים.

3. תמלול הפוך

הערה: כדי להשיג מטופל ספציפי התחל, הספק DNA מבודדים מתאי CD4 + T מכל מטופל היה מוגבר באמצעות HIV-1HXB2 פאן ASP תחל. באמצעות הרצף הפנימי. של התחל הפאן-ASP כל התחל והבדיקות המשמשות במחקר זה מפורטות בטבלה 2.

  1. בידוד ה-RNA הכולל מתאים
    1. לכמת RNA ולחסל זיהום DNA על ידי טיפול בדגימות עם DNase.
    2. בצע תגובות RT באמצעי אחסון של 50 μL. העברה 0.1-1 μg של ה-RNA הכולל למספר מתאים של בארות של הצלחת 96-היטב PCR. הכינו את תערובת ה-RNA על ידי הוספת המרכיבים הבאים ל-RNA:
      5 μL של ביוטילנטי לאחור (20 μM)
      2.5 μL של דיאוקסינוקלאוטיד triphosphates (dNTPs) (10 ממ)
      25 μL של דיאטילפירוקרבונט (מתחת למים)-מטופלים מזוקקים (dH2O).
      הכינו את הפקדים האנדוגניים על ידי הוספת 5 μL של nuclease-מים ללא תשלום במקום פריימר הפוכה ASP ביולוגי.
    3. מניחים את הצלחת 96 היטב ה-PCR לתוך הציקלונינר וחום תערובת RNA ל 94 ° צ' עבור 5 דקות.
    4. מיד לצנן את תערובת RNA במים קר לפחות 1 דקות.
    5. הכינו את תערובת הריאקציה על ידי הוספת הרכיבים הבאים לצינור 1.5 mL (חשב את המספר הכולל של דגימות ועוד 1):
      10 μL של מאגר של 5x RT
      2.5 μL של 0.1 M של 1, 4-dithioitol (DTT)
      2.5 μL של RNase out (40 יחידות/μL)
      2.5 μL של אנזים RT (200 יחידות/μL)
    6. העברת 17.5 μL של תערובת זו לכל אחת מבארות המכילות RNA. הכינו את הבקרות האחרות המחליפים את ההמרה הפוכה עם 2.5 μL של מים ללא השכרה.
    7. מערבבים בעדינות את הצלחת ב 55 ° c עבור 60 דקות באמצעות הציקלייט.
    8. הפוך את התגובות על ידי חימום ב 70 ° c עבור 15 דקות.

4. טיהור אהדה של cDNA של ASP ביולוגיים

הערה: לא לטהר את התגובות RT-מינוס.

  1. להכין 1 L של 2x כביסה/כריכה מאגר המכיל 10 מ"מ-HCl (pH 7.5), 1 מ"מ מדיום חומצה (EDTA) ו 2 M הנאל. סנן את הפתרון.
    1. הכן 50 mL של מאגר כביסה/איגוד של 1x באמצעות מים בכיתות PCR.
    2. עבור כל תגובה, להשתמש 10 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin מעלה. בהתבסס על מספר התגובות, להעביר נפח מתאים של חרוזים לצינור 1.5 mL.
    3. שטוף את החרוזים על ידי הוספת נפח שווה של מאגר כביסה/כריכה של 2x ו מערבולת עבור 15 s.
    4. מניחים את הצינור לתוך מתלה הפרדה מגנטית ו דגירה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע את החרוזים ולהוסיף את אותו נפח של כביסה/כריכת מאגר 2x כאמצעי האחסון הראשוני של חרוזים.
    6. מערבולת עבור 30 s ולהעביר 10 μL של הבולם חרוזים למספר מתאים של 1.5 mL.
    7. מניחים את הצינורות במתלה הפרדה מגנטית ו דגירה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. מחק את הסופרנטאנט והוסף 50 μL של מאגר כביסה/כריכה של 2x.
    9. הוסף 50 μL של cDNA biotinylated לצינורות המתאימים המכילים את החרוזים.
    10. דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר מסתובבת בעדינות.
    11. הפרד את החרוזים מן הסופרנטנט על ידי מתלה הפרדה מגנט עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. שטוף את החרוזים על ידי הוספת 200 μL של מאגר כביסה/כריכה של 1x. מניחים את הצינורות בארון הפרדה של מגנט במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים את הסופרנטאנט. . אני חוזר פעמיים
    13. השהה מחדש את החרוזים ב -10 μL של מים בכיתות PCR.

5. התקן PCR

הערה: מטרת ה-PCR הסטנדרטי היא להגביר את כל ה-ORF של הגן של ASP. מוצרי הגברה לאחר מכן משובטת לתוך pCR 2.1 פלאמיד כדי לפתח עקומות סטנדרטיות עבור כימות ASP RNA על ידי PCR בזמן אמת (ראה הפסקה בזמן אמת PCR).

  1. בצע בדיקות סטנדרטי בנפח כולל של 50 μL. הכן נפח מתאים של התמהיל הראשי של ה-PCR (מספר הדגימות ועוד 1). עבור כל דוגמה, הוסף את הרכיבים הבאים לשפופרת 1.5 mL:
    1 μL של 10 שירותי התחל ASP (קדימה ואחורה)
    1 μL של 10 ממ מ מסוג Dntps
    מגנזיום כלוריד (MgCl2) (ריכוז תלוי בשימוש התחל)
    dH2O לנפח הסופי של 49 μl
    1. מערבבים היטב, במהירות לסובב את התוכן ולהעביר 49 μL/טוב של התמהיל הראשי של ה-PCR לצלחת 96-היטב PCR.
    2. בזהירות מערבולת צינורות המכילים את החרוזים המשמשים עבור האהדה של ASP cDNA לטיהור עבור 15 s.
    3. הוסף 1 μL של חרוזים לתוך הבארות המתאימות ולהפעיל את ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 95 ° c עבור 2 דקות, 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 30 s, 55 ° c עבור 30, ו 68 ° צ' עבור 40 s, אז 68 ° c עבור 7 דקות.
    4. הפרד בין מוצרי ה-PCR ל-1% מעלה ג'ל, חותכים את הלהקות ומשובטים את המוצרים המגבונים לתוך pCR 2.1 פלמיד.
    5. רצף ולנתח את הרצפים של כל שיבוט.

6. בזמן אמת כמותי PCR (qPCR)

הערה: פיתוח תחל וזונדים ספציפיים למטופלים באמצעות הגישה המתוארת בשלב 3 "תמלול הפוך". עבור התקני qPCR כוללים הדלקות של ASP בעקומות סטנדרטיות. פלמידים המכילים מוסיף מטופלים ספציפיים מפותחים כאמור בהערה בתחילת שלב 5 "ה-PCR הסטנדרטי".

  1. הכן את העקומה הסטנדרטית באמצעות 1:10 מדלל סדרתי של ASP, החל מ -3 x 106 עותקים/μl עד 3 עותקים/μl.
    1. הסיבוב הראשון PCR (pre-amp). לבצע תגובות בנפח כולל של 25 μL. הכנת נפח מתאים של התמהיל הראשי של ה-PCR (מספר דגימות ועוד 1). עבור כל דוגמה, הוסף את הרכיבים הבאים לשפופרת 1.5 mL:
      0.5 μl של שילוב של ASP או של עטפה פריימר (ריכוז סופי 0.2 μm כל אחד) (קדימה ואחורה)
      0.5 μL של שילוב dNTPs (ריכוז סופי 0.2 mM כל אחד)
      MgCl2 (הריכוז תלוי בזוגות הפריימר)
      dH2O עד כמות אחרונה של 24 μl
    2. העבר 24 μL של שילוב מאסטר של ה-PCR למספר מתאים של בארות של לוחית ה-PCR ב96.
    3. מערבולת בזהירות את הצינורות המכילים את החרוזים עם cDNA עבור 15 s.
    4. הוסף 1 μL של חרוזים לבארות המתאימות. עשה את אותו הדבר. לדילול הפלזמה
    5. הפעל את ה-PCR באמצעות האלגוריתם הבא: דנטורציה עבור 2 דקות ב-95 ° צ'; 30 s ב 95 ° צ', 30 s ב 55 ° צ', 40 s ב 68 ° c עבור 18 מחזורים; הארכה ב 68 ° c עבור 7 דקות.
    6. לדלל את הסיבוב הראשון בדיקות תגובות 1:5 עם המים PCR כיתה.
    7. . הסיבוב השני של ה-pcr לבצע תגובות בנפח כולל של 20 μL. הכנת נפח מתאים של התמהיל הראשי של ה-PCR (מספר דגימות ועוד 1). עבור כל דוגמה, הוסף את הרכיבים הבאים לשפופרת 1.5 mL:
      1.8 μL 10 מיקרומטר (קדימה ואחורה)
      1 μL of בדיקה של 5 μM
      6.2 μL של dH2O
    8. העברה 19 μL של מיקס מאסטר qPCR לתוך מספר מתאים של בארות של 96-ובכן qPCR לוחית ולהוסיף 1 μL של התגובות ה-PCR העגול הראשון מדולל לבארות המקביל. עשה את אותו הדבר. עבור הדילול הפלסטי
    9. הפעל את ה-qPCR עם האלגוריתם הבא: דנטורציה עבור 10 דקות ב-95 ° צ'; 15 ס ב 95 ° c, 1 דקות ב 60 ° צ' עבור 40 מחזורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טמפ גבוהה רנ א מצמידים לטיהור אהדה של cDNA biotinylated מונע הגברה של מוצרי ASP שאינם ספציפיים במהלך ה-PCR ב-PBMCs נגוע מבחנה בתאי CD4 + T מבודדים מהחולים. RT הטרמה עצמית הוכח להתרחש במהלך שעתוק לאחור של antisense rnas10,14,15,16,17. כדי למנוע תופעה זו, פיתחנו גישה מקורית באמצעות הטכניקה שתוארה במקור על ידי השוד ואח '10. ההליך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדוח זה אנו מתארים שיטת ה-RT הספציפית לסטרנד המוחלת על איתור RNA של ASP בתאים CD4 + T מבודדים מאנשים שנדבקו ב-HIV-1. התרחשות של הטרמה לא ספציפית במהלך RT הסלים את הזיהוי של התעתיקים RNA עם הקוטביות הימנית, המוביל וטעה של התוצאות. הקבוצות הקודמות פיתחו מספר אסטרטגיות שמטרתן למנוע סינתזה בלתי תלויה cDNA במהלך התגובה RT. תיוג בהילוך הפוך על 3 ' סוף עם רצפים שאינם קשורים HIV הוכיחה יעיל להשגת הגברה ספציפית סטרנד6,8,9. עם זאת, גישה ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים לפטריזיה אמגליו, אלסנדרה נוואל, קרייג פנוויק, ומתיו פרברו, שתמיד יהיו זמינים לדון בעבודתנו ובכל האנשים במעבדת האיידס Immunopathogenesis לסיוע הטכני היקר שלהם. אנחנו גם רוצים להודות לג ואהרון וודל מ VSB המשויכים Inc. שתרמו עם יצירות אמנות מעולה. לבסוף, תודות מיוחדות רבות לכל המטופלים, מבלי שהעבודה הזאת לא הייתה אפשרית. עבודה זו לא קיבלה כל מענק ספציפי משום סוכנות מימון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 ערכת ריצוף מחזורApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Set (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Human CD4+ T Cell ערכת בידודStemcell Technologies19052
סרום בקר עובריBiowestS1010-500
ערכת פתרון קיבוע/פרמיביליזציהBecton Dickinson554714
HIV Gag p24 זרימה ציטומטריה נוגדן - Kc57-FITCבקמן קולטר6604665
אנושי IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
לקטין מ- Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
ערכת כתמי תאים מתים צהובים חיים / מתים הניתנת לתיקון, לעירור 405 ננומטרInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
עכבר אנטי אנושי CD28Becton Dickinson55725
עכבר אנטי אנושי CD3Becton Dickinson55329
פריימרים ובדיקותDNA משולב טכנולוגיות (IDT)
פניצילין-סטרפטומיציןBioConcept4-01F00-H
פלטינה טאק DNA פולימראז נאמנות גבוההInvitrogen, תרמו פישר 11304011
זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציהסיגמא-אולדריץ'TR-1003-G
RNeasy מיני קיטQiagen74104
מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 גיבקו בינוני, תרמו פישר סיינטיפיק11875093
StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמתביוסיסטם יישומי, תרמו פישר סיינטיפיק4376600
SuperScript III טרנסקריפטאז הפוךInvitrogen, תרמו פישר סיינטיפיק18080044
TaqMan ביטוי גנים מאסטר מיקסביוסיסטם יישומי, תרמו פישר סיינטיפיק
ערכת שיבוט 4369016 TOPO TA לתת-שיבוט, עם One Shot TOP10 תאי E. coli מוכשרים כימיתInvitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase (2 U/µ L)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786

מקורות

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74(2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71(2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38(2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221(2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNARNA ASPT CD4cDNAqPCR
זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.