מאמר שיטה

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

DOI:

10.3791/60528

⸱

30 באוקטובר 2019

 , 
1Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינוי מקדם הצמיחה-בטא (TGF-β) סופר משפחה חיונית עבור המבנה העובריים המוקדמים ופיתוח של מבנים מבוגרים באורגניזמים רב-תאיים. TGF-β סופר משפחה כולל TGF-β, עצם חלבון מורורגנטי (BMPs), הפעלות, צמיחה ובידול, ו Nodals. זה כבר מזמן ידוע כי כמות ליגו חשוף לתאים חשוב השפעותיו. זה היה חשוב כי מעברי הריכוז לטווח ארוך להגדיר דפוס עובריים. עם זאת, לאחרונה התברר כי עיתוי החשיפה לליפות אלה חשוב גם עבור ההשלכות שלהם במורד הזרם. Tgf-β סופרמשפחה ליגנד לא יכול להיות תוצאה התפתחותית עד שהוא שוחרר מתא שבו הוא הופק. עד לאחרונה, היה קשה לקבוע מתי הליטרים האלה שוחררו מתאים. כאן אנו מראים כיצד למדוד את שחרורו של Drosophila ילה BMP הנקרא עריפת ראש (dpp) מן התאים של הראש הזרוע הפרידיום או הכנף. ניתן לשנות שיטה זו עבור מערכות אחרות או לאותת ליגנדס.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצם מורורגנטית חלבונים (BMPs) הם חיוניים עבור embryogenesis מוקדם והסדר של מבנים מבוגרים. BMPs מיוצרים ומופרש כדי להשפיע על תמלול של גנים היעד הדרושים הגידול התא בידול בתאים מגיבים. עריפת ראש (Dpp) היא מטוס הומוסוזוזה של BMP4 שחשוב לפיתוח מבנים עובריים ומבוגרים כמו כנף1,2,3,4. כמה קבוצות התמקדו בתפקיד של Dpp כנפיים לעוף מבוגרים בגלל 1) כנפיים מורכב משני גיליונות epithelia שקוף עם דפוס עקביות עקבית שניתן להעריך בקלות; 2) הדיסקים הכנף הם גם שטוחים באופן סביר, יכול להיות מתורבת מחוץ לזחל, והם פשוטים התמונה והבדלים לכמת בתבנית; ו 3) הפיתוח דפוס הכנף רגיש Dpp כגון רטבאליות קטן בשביל יהיה להשפיע הכנף והוא.

Dpp מופק בתאים הממוקמים בגבול הקדמי/אחורי של דיסק כנף5,6,7,8. Dpp נקשר לקומפלקס מסוג 1 ו-2 קולטני סרין/טראונין קינאז9,10. עם כריכת Dpp, הסוג 2 קולטן זרחתיים את סוג 1 הקולטן אשר לאחר מכן זרחני אמהות נגד Dpp (משוגע), Smad 1/5/8 הומויומן. מגייסים מגויסים שכונתיות נוספת (מדיאה), אשר מאפשר לו להיכנס לגרעין שבו הוא מווסת את הגנים היעד, המוביל לתופעות למטה כגוןהתפשטות אובידול 4,11.

לאחרונה, מעבדת בייטס הראתה כי שחרורו הבלתי ראוי של dpp בתוך הדיסק הכנף יכול להוביל לירידה בזירחון מטורף, הפחתה בביטוי הגנים היעד, ופגמים כנף12,13. מספר ערוצי יונים משפיעים על התפתחות אגף דרוזוהילה ומבנים משויכים14,15. ערוצי יונים אלה יכולים גם להיות מעורבים במהדורת Dpp. בקביעת המנגנון של שחרור מורפוגן, חשוב כי יש שיטה להמחיש את האירועים שחרור.

ד"ר אאורליו טלמאן וסטיבן כהן יצרו חלבון היתוך Dpp-GFP אשר מסוגל להציל אובדן של Dpp, כלומר הוא פעיל ביולוגית ושוחרר באופן ביולוגית רלוונטי16. כאן, אנו מתארים כיצד אנו מדמיינים Dpp לשחרר אירועים באמצעות זה Dpp-GFP. חלבון זה היתוך שימושי במיוחד כי GFP הוא pH רגיש כך כאשר הוא בתוך שלפוחיות חומציים, הזריחה היא17. לכן, כאשר חלבון מתויג עם GFP הוא שוחרר שלפוחית לתוך הסביבה מגלותי יותר נייטרלי, עוצמת הזריחה GFP מגדילה17. ניצלנו את הרגישות של ה-pH של GFP כדי לקבוע אם Dpp-GFP נמצא בתוך שלפוחיות חומציים. אנו התמונה דיסקים כנף המבטא Dpp-GFP לפני ואחרי תוספת של אמוניום כלוריד, אשר מנטרל תאים תאיים ושלפוחיות18. מצאנו עלייה משמעותית בקרינה הפלואורסצנטית לאחר תוספת של אמוניום כלוריד, הרומז כי Dpp-GFP מצוי לפני התוספת של אמוניום כלוריד18. אנו מסיקים כי Dpp-GFP התאיים שוכן בתאי קרום חומצי מאוגד, כגון ושלפוחיות, והוא משוקם בתוספת של אמוניום כלוריד לנטרל את ה-pH של תאי תאיים18. זה עושה הדמיה חיה של Dpp-GFP טכניקה שימושית כדי להמחיש את הדינמיקה של Dpp בדיסק כנף Drosophila ילה כפי שהוא שוחרר מתאי חומצי לתוך הסביבה מגלומת.

כאן, אנו מתארים את השיטה אנו משתמשים כדי להמחיש את Dpp לשחרר אירועים באמצעות Dpp-GFP. Dpp-GFP ניתן להתבטא בתבנית מקורית שלה בתוך מערכת הדיסקים של Drosophila ילה באמצעות המערכת UAS-GAL419. זוהי השיטה ששימש כדי לקבוע כי ערוצי Irk השפעה שחרור Dpp18. הצלחנו לאמת את השיטה. ע י הדמיה חיה בערימות אנחנו לא רואים Dpp-GFP לנוע בתוך מישור המיקוד בסדרת הזמן אם רכשנו במישור אחד של מיקוד. אנחנו גם לא רואים תנועה של Dpp-GFP דקדטתא אם אנו מתמונה במחסנית z. אנו מסיקים כי ה-Dpp-GFP שנראה באמצעות שיטה זו הם שחרור אירועים ולא תנועה של שלפוחיות intracellularly. שיטה זו של לחיות הדמיה של Dpp-GFP יכול לשמש כדי לבדוק מודיטים אחרים של המהדורה Dpp עבור השפעתם על הדינמיקה Dpp או יכול להיות שונה כדי להסתכל על הדינמיקה של ליגונים אחרים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף ביצים כדי ליצור הזחלים לחיתוך

  1. לחצות 30-40 נקבה בתולה Dpp-GAL4/TM6 Tb הו זבובים ל 10-15 זכר Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
    הערה: כל גנוסוגים המכילים Dpp-GAL4 ו UAS-Dpp-GFP יכול לשמש כל עוד אזנים יש סמני זחל המאפשר מבחר של צאצאי המתאים במהלך הזחל.
  2. כדי לאסוף ביצים, להפוך את הזבובים חצה לתוך בקבוקון טרי של מזון ולאפשר להם לשכב 3 – 4 h לפני הסרתם מן הבקבוקון. כדי לעודד הנחת ביצה, כמות קטנה של ממרח שמרים עשוי מגורען מעורבב עם כמות קטנה של מים ניתן להוסיף לחלק העליון של המזון לפני הזבובים מוצגים לבקבוקון. את אותה קבוצה של זבובים מצטלבים ניתן לשמור ולהשתמש עד 7 ימים של אוספי ביצים.
    הערה: כל המאכלים הסטנדרטיים בארוחות הערב מגישים אוכל מקובל. משמש כאן הוא מתכון המזון המתואר על ידי Hazegh ו רייס20.
  3. שמרו את הבקבוקונים במבחנות ב-25 ° c תמורת כ-144 h עד שהזחלים נמצאים בשלב השלישי (נודד).
  4. כדי לבחור את הזחלים המתאימים לחיתוך (אלה ביטוי הן Dpp-GAL4 ו UAS-Dpp-GFP) הראשון לבחור הזחלים כי הם שאינם Tb. הזחלים האלה יהיו באורך נורמלי ולא נמוך ושמן.
  5. בין הזחלים שאינם שחפת, יהיו הזחלים המבטאים את CyO-GFP וזחלים המבטא Dpp-GFP. כדי לבחור את הזחלים Dpp-GFP, להציג אותם תחת stereomicroscope פלואורסצנטית. בעוד ששניהם Dpp-GFP ו CyO-GFP ביטוי larve יהיה כמה זריחה GFP, Dpp-GFP הזחלים ביטוי יכול להיות מכובד כי GFP הוא מוגבל הדיסקים הכנף והפלואורסצנט הוא הרבה פחות בהיר מאשר CyO-GFP הבעת הזחלים. בחר את הזחלים הבהירים פחות האלה לניתוח.

2. הכנת הפתרון לדימות ולחיתוך זחל

  1. עבור הדמיה חיה של דיסקי כנף, להכין שונה HL3 מדיה21 (70 מ"מ, 5 מ"מ kcl, 1.5 mm cacl2 הידרוקסיד, 4 מ"מ mgcl2, 10 mm נחקו3, 5 מילימטר טרהלוז לימה, 115 mm סוכות, 5 מ"מ hepes). מדיה זו מאפשרת את הדיסק הכנף להישמר בחיים עבור הדמיה21.
  2. להתאים את ה-pH ל 7.1 באמצעות hepes ולסנן עם מסנן 0.22 יקרומטר. השתמש במדיה זו הן עבור הניתוח של דיסק הכנף והן כאמצעי האחסון הגובר להדמיה חיה.

3. הכנת שקופיות להרכבה בדיסק כנף

  1. מניחים שתי חתיכות של קלטת כפולה ומאוזנת בתוך משטח מיקרוסקופ, ומשאירה מרווח של כ-5 מ"מ ביניהם. פיסות הסרט אמורות להיות ארוכות מספיק כדי שקצות הקלטת יהיו מיושרים עם קצות שקופית המיקרוסקופ.
  2. השתמש בקצה שטוח (כגון קצה הידית של צמד מלקחיים) כדי להקיש על הקלטת בחוזקה על השקופית כך שאף מדיה לא תוכל לחלחל מתחתיו.
  3. מקום 25 μL של שינויים HL3 מדיה בין שתי פיסות הקלטת. הדיסק הכנף יהיה מותקן בירידה זו של מדיה בין פיסות הקלטת, כך הקלטת מונעת את הכיסויים למחוץ את הדיסק (איור 1A).

4. מבתר והרכבה של דיסקים להדמיה

  1. הזחלים מנתחים בHL3 מוכן שונה26מדיה.
  2. קורעים בעדינות את הזחלים במחצית באמצעות שני זוגות של מלקחיים ולהשליך את החצי האחורי של הזחל.
  3. אחוז באמצע המחצית הקדמית של הזחל עם זוג אחד של מלקחיים ולהשתמש זוג אחר של מלקחיים סגורים כדי לדחוף את ווים הפה לתוך הזחל עד הזחל הוא הפוך לחלוטין.
  4. את הדיסקים הכנף ניתן למצוא בקלות רבה יותר על ידי מחפש את העיקולים חדה בשני הענפים העיקריים בצבעים כהים של הגרניים כי לדרוס את שני הצדדים של הזחלים. הדיסקים הכנף משקרים ישירות תחת כפיפות בקנה הנשימה בזחל הפוך.
  5. הסר בעדינות את דיסקי הכנף והעבר אותם ל-25 μL של HL3 media בשקופית המוכנה של המיקרוסקופ. חשוב לוודא כי אין פיסות קנה הנשימה שנותרו מחוברים הדיסקים לגזור הכנף כמו זה יכול לגרום לדיסקים לצוף, מה שהופך את ההדמיה קשה.
  6. סדר את הדיסק הכנף כך שהצד הפריפוייתי של נרתיק הכנף פונה כלפי מעלה מתוך שקופית המיקרוסקופ עם הדיסק שטוח (ראה איור 1א, ב).
  7. לכסות את הדיסק כנף וקלטת עם שמיכות ולאטום את העטיפה באמצעות לק הציפורן. ברגע שפולנית יבשה, המשך מיד לשלבי ההדמיה להלן.

5. הדמיה Dpp שחרור

  1. תמונה הכנף רכוב באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה עם מטרה שמן 40x ו 488 ננומטר לייזר. Dpp-GFP צריך להופיע כרצועה של הזריחה GFP במורד המרכז של דיסק כנף עם דקדטה קטן של Dpp-GFP שוחרר ממרכז זה פס של תאים.
  2. לאסוף תמונות במהירות של 2 Hz עבור 2 דקות כדי להמחיש לשחרר Dpp. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להגדיר את הלייזר בהגדרה רק חזק מספיק כדי לקבל תמונה ברורה של התאים Dpp-משחרר כדי למנוע הלבנת מעל במהלך איסוף התמונה. התמונות ניתן לאסוף כסדרה זמן אשר ניתן לייצא כקבצי AVI (אין דחיסה, 3 מסגרות/s) כדי להשיג קבצי וידאו של המהדורה Dpp.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מראה את תוצאות ההדמיה החיה הייצוגית של פרוטוקול זה. כאשר הפרוטוקול הוא מוצלח, Dpp-GFP ניתן לראות פס במורד המרכז של דיסק כנף עם גרעינים גלויים כמו עיגולים שאינם פלורסנט בתוך אזור Dpp-GFP (איור 2). השחרור dpp-GFP גלוי כמו פלורסנט המופיעים ונעלמים. הבחנו בקרינה Dpp-GFP המופיעים ונעלמים בגופי התא ורחוקים מגופי התא. Dpp איתות תלוי במבנים מבוססי actin המבוסס על מבנים בשם cytonemes הנמתחים הרחק מגוף התא22,23

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BMPs כגון Dpp להפוך את ההשפעה המשמעותית שלהם כאשר הם לאגד מורכבות של קולטנים מאוגדים קרום כדי לגרום מפל של איתות תאיים בתאים השכנה או מרחוק כנראה. מעבדתו של ד ר תומס קורנברג הראו כי תאים המייצרים את אות dpp בתאי מגע המקבלים את האות באמצעות אקטין מבוסס filapodia דק מבנים כמו המכונה cytonemes15,24,25. נתונים אלה מצביעים על כך שתקשורת סלולרית התפתחותית בהקשר זה עשויה להיות דומה לסינפסה העצבית26. בתקשורת סינפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוני להודות לד ר סאראלה פראדהן על עבודה על גרסה מוקדמת יותר של פרוטוקול זה. אנחנו רוצים להודות NSF-IOS 1354282 למימון בזמן שפיתחנו את הפרוטוקול. היינו רוצים להודות NIH-נדבך RO1DE025311 למימון המעבדה שלנו כרגע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שמרי אופהכוכב אדום<חזק>  <חזק> 
CaCl2 dyhydrateFisher ScientificC79-500
CoverslipsVWR484-457
סרט דו צדדיסקוטי
Drosophila Agar Type IIApex66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Huמלאי זה יהיה זמין בקרוב במרכז המניות של בלומינגטון דרוזופילה
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Huמלאי זה יהיה זמין בקרוב במרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה
פינצטה דומונט #5World Precision Instruments500233מלקחיים לניתוח
HEPESSigma AldrichH3375
KClFisher ScientificAC193780010
סירופ תירס קלקארו
תמצית מאלטBreiss
MgCl2Fisher ScientificAC223210010
מיקרוסקופ שקופיותSigma AldrichS8400
NaClFisher ScientificS271-500
NaHCO3RPIS22060-1000.0
לקאלקטרונים Micsroscopy Sciences72180
חומצה פרופיוניתVWRU330-09
קמח סויהADM מרכיבים מיוחדים062-100
סוכרוזפישר מדעיS5-3
סוכרוזפישרS512
TegoseptGenesee Scientific20-259
Trehalose dyhydrateChem-Impex אינטרנשיונל בע"מ00766
קמח תירס צהובQuaker
Zeiss LSM 780 מיקרוסקופ קונפוקליZeissמיקרוסקופ להדמיה חיה
Zeiss SteREO Discovery.V8 מיקרוסקופZeissלנתיחות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
  2. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
  3. Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
  4. Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
  5. Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
  6. Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
  7. de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
  8. De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
  9. Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
  10. Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
  11. Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
  12. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  13. Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
  14. George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
  15. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  16. Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
  17. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  18. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  19. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  20. Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744(2016).
  21. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  22. Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
  23. Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
  24. Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
  25. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  26. Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BMPGFP

מאמרים קשורים