אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

סיכום

אנו מתארים פלטפורמה כי מנצל את הספרייה של עמידות לאנטיביוטיקה איזוגניים לdereplication של אנטיביוטיקה . הזהות של אנטיביוטיקה המיוצר על ידי חיידקים או פטריות ניתן להסיק על ידי הצמיחה של E. coli ביטוי ההתנגדות המתאים שלה הגן. פלטפורמה זו יעילה כלכלית וחסכונית בזמן.

תקציר

אחד האתגרים העיקריים בחיפוש אחר אנטיביוטיקה חדשה מתמציות המוצר הטבעי הוא גילוי מחדש של תרכובות נפוצות. כדי להתמודד עם האתגר הזה, dereplication, שהוא תהליך של זיהוי תרכובות ידועות, מבוצע על דגימות של עניין. שיטות לdereplication כגון הפרדה אנליטית ולאחריה ספקטרומטר מסה הינן צורכות זמן רב ועתירות משאבים. כדי לשפר את תהליך dereplication, פיתחנו את פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP). ARP היא ספריה של כ 100 גנים עמידות לאנטיביוטיקה ששוכפל בנפרד לתוך es, coli. אוסף זה הנבג יש יישומים רבים, כולל שיטה חסכונית ונתיישב עבור אנטיביוטיקה dereplication. התהליך כולל תסיסה של חיידקים המייצרים אנטיביוטיקה על פני השטח של מנות פטרי מלבני המכילות בינונית יציבה, ובכך מאפשר הפרשה ודיפוזיה של מטבוליטים משני דרך המדיום. לאחר תקופת תסיסה של 6 ימים, מסירים את ביומסה החיידקים, ומוסיפים לצלחת הפטרי דק שכבת-על כדי ליצור משטח חלק ולאפשר את התפתחותם של זנים מחוון ה-coli . האוסף שלנו של זני ARP מוצמד לאחר מכן על פני השטח של צלחת פטרי המכילה את האנטיביוטיקה. הצלחת היא הדגירה הבאה לילה כדי לאפשר צמיחה E. coli על פני השטח של כיסוי. רק זנים המכילים התנגדות אנטיביוטי ספציפי (או הכיתה) לגדול על פני השטח הזה מאפשר זיהוי מהיר של התרכובת המיוצר. שיטה זו בוצעה בהצלחה לזיהוי יצרנים של אנטיביוטיקה ידועה וכאמצעי לזיהוי אלה המייצרים תרכובות הרומן.

מבוא

מאז גילוי של פניצילין ב 1928, מוצרים טבעיים נגזר מיקרואורגניזמים סביבתיים הוכיחו להיות מקור עשיר של תרכובות מיקרוביאלית¹. כ 80% של אנטיביוטיקה המוצר הטבעי נגזרות חיידקים של סוג Streptomyces ואקטיטיטים אחרים, בעוד 20% הנותרים מופק על ידי מינים פטרייתי¹. כמה מהפיגומים הנפוצים ביותר לאנטיביוטיקה המשמשים במרפאה כגון β-lactams, טטרציקווים, rifamycins, ו הקוגליניים, היו מבודדים במקור מחיידקים². עם זאת, בשל עלייתה של עמיד בפני סמים (mdr) חיידקים, פאנל הנוכחי שלנו של אנטיביוטיקה הפך פחות יעיל בטיפול^3,4. אלה כוללים את "ESKAPE" פתוגנים (כלומר, vancomycin עמידים בפני בידור ו β-lactam עמידים בפני לקטקוקוס, klebsiella דלקת ריאות, הפסאודומונס aeruginosa, acineטבק הביטוחהעצמי, ו Enterobacter sp.), המהווה תת-ערכה של חיידקים, הנחשבים לבעלי הסיכון הגבוה ביותר על-ידי מספר רשויות בריאות הציבור הגדולות כגון ארגון הבריאות העולמי^3,4,5. הופעתה הגלובלית התפשטות של אלה mdr פתוגנים תוצאות הצורך קבוע עבור אנטיביוטיקה הרומן^3,4,5. למרבה הצער, שני העשורים האחרונים הוכיחו כי גילוי של אנטיביוטיקה הרומן ממקורות מיקרוביאלית הוא קשה יותר ויותר⁶. הגישות הנוכחיות לגילוי הסמים כוללות הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות אקטיביים, כולל ספריות מוצר טבעי לחלץ, המאפשר אלפי תמציות להיבדק בזמן נתון². עם זאת, לאחר מזוהה פעילות מיקרוביאלית, השלב הבא הוא לנתח את התוכן של התמצית גולמי כדי לזהות את הרכיב הפעיל ולסלק את אלה המכילים תרכובות ידועות או יתירים^7,8. תהליך זה, המכונה dereplication, חיוני כדי למנוע ו/או להקטין באופן משמעותי את הזמן המושקע בגילוי מחדש של אנטיביוטיקה ידועה^7,9. למרות שצעד הכרחי בגילוי הסמים הטבעי של המוצר, dereplication הוא מפרך לשמצה ואינטנסיבי משאבים¹⁰.

מאז beutler et al. לראשונה נטבע את המונח "dereplication", מאמצים נרחבים נעשו כדי לפתח אסטרטגיות חדשניות לזיהוי מהיר של אנטיביוטיקה ידועה^11,12. כיום הכלים השכיחים ביותר המשמשים לdereplication כוללים מערכות כרומטוגרפיות אנליטיות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטר מסה, ושיטות זיהוי מבוססות תהודה מגנטית גרעינית^11,13. למרבה הצער, כל אחת מהשיטות הללו מחייבת שימוש בציוד אנליטי יקר ובפרשנות נתונים מתוחכמת.

בניסיון לפתח שיטה dereplication שניתן לבצע במהירות ללא ציוד מיוחד, הקמנו פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP)¹⁰. ARP יכול לשמש לגילוי של שדון אנטיביוטי, הפרופיל של תרכובות אנטיביוטיות חדשות נגד מנגנוני ההתנגדות ידוע, ואת dereplication של אנטיביוטיקה ידועים בתמציות הנגזרות של אקאובקטריה וחיידקים אחרים. כאן, אנו מתמקדים ביישום שלה dereplication אנטיביוטי. ARP מנצל את הספריה של איזוגניים es, המאשכיה זנים המבטא גנים בודדים התנגדות כי הם יעילים נגד אנטיביוטיקה הנפוץ ביותר מחדש גילו^14,15. כאשר הספרייה E. coli גדל בנוכחות של אורגניזם משני מייצר מטבוליזם, את הזהות של המתחם ניתן להסיק על ידי הצמיחה של החיידק של E. coli המבטאים הגן הקשור שלה התנגדות¹⁰. כאשר ה-ARP דווח לראשונה, הספריה כללה > 40 גנים הענקת עמידות ל -16 שיעורי אנטיביוטי. תבנית הdereplication המקורית תוכננה להקיף תת-ערכה של גנים ההתנגדות לכל מחלקה לאנטיביוטיקה כדי לספק מידע לגבי מחלקת משנה אנטיביוטי בתהליך dereplication. כיום, ה-ARP מורכב מ> 90 גנים המקנים עמידות ל -18 שיעורים אנטיביוטיים. באמצעות האוסף הנרחב שלנו של גנים ההתנגדות, תבנית dereplication משנית פותחה והוא ידוע כפלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה מינימלית (MARP). תבנית זו נוצרה כדי למנוע יתירות גנטית כדי פשוט לספק מידע לגבי המעמד האנטיביוטי הכללי כי מטבוליט dereplicated lite קשורה. בנוסף, התבנית MARP מחזיקה הן מסוג wildtype ואת המתח היתר/לקוי של E. coli BW25113 (e. Coli BW25113 ΔbambΔtolc), לעומת הגלגול המקורי של ה-ARP, אשר רק מנצל את המתח היפרחדיר. היבט ייחודי זה יוצר פנוטיפים נוספים במהלך dereplication, המציין את היכולת תרכובות לחצות את הקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק להיות שלאחר מכן כאשר מקבל הפחתה עם ה-ARP ו/או MARP, להדגיש את הצעדים הקריטיים ביותר לעקוב, ולדון בתוצאות אפשריות שונות.

פרוטוקול

1. הכנת הספריה E. coli מניות גליצרול (מאת אגר סלטס)

1. פס החיידק ARP/MARP E. coli מציר lysogeny קימוט (LB) אגר הסלטים על מנות פטרי המכילות LB אגר ואת סמן לבחירה המתאים (שולחן 1).
2. הכינו תרבויות עבור כל אחד מזני E. coli על ידי הנעם 3 מ ל של LB המכיל את סמן לבחירה המתאים עם מושבה אחת. לגדול לילה ב 37 ° צ' עם האוורור (250 rpm).
3. לשלב 800 μL של התרבות ו 200 μL של שילוב של 80% גליצרול ב-mL 1.8 בהקפאה. מערבבים על ידי היפוך הצינורות 3-4 פעמים, ולאחסן ב-80 ° c.

2. ARP/MARP מלאי קפואים לוח הספרייה הכנה

1. פס הזנים ARP/MARP מתוך מניות גלירול שהוכנו בסעיף 1 על קבוצה חדשה של מנות פטרי המכילות LB אגר ו סמן לבחירה המתאים. הגדלים בלילה ב 37 ° c.
2. באמצעות טכניקה אספטי, פיפטה 500 μL של הקטיון מותאם מולר הינטון מרק (MHB) ממאגר סטרילי לתוך כל באר של הצלחת סטרילית 96 היטב בעומק.
3. עם לוחיות המוכנות בשלב 2.1, השתמש המוליך מקל כדי לחסן את הצלחת 96 הבאר העמוקה בהתאם למפת ARP/MARP (משלים איור 1 ומשלים איור 2). ודא שסמן הבחירה המתאים נוסף לכל באר. מניחים ממברנה איטום לנשימה על פני השטח של צלחת הבאר העמוקה מודדת לילה ב 37 ° צ' (250 rpm).
4. ודא שאין בארות מזוהמות על-ידי התייחסות למפת ARP/MARP. . אני חוזר אם מזוהם שימוש בצינורות מרובי ערוצים, העברת 100 μL מכל באר של צלחת הבאר העמוקה לצלחת סטרילית 96-היטב עגול התחתון. חזור על שלב זה כדי ליצור מספר לוחיות של ספריית מלאי קפואה.
   הערה: מומלץ להכין לפחות 5 לוחות ספריה בכל פעם כדי לשמור על שלבים חוזרים 2.1-2.4 למקרה של זיהום לוחית של הספרייה מלאי קפוא.
5. סיים לעשות את הצלחות ARP/MARP קפואים הספרייה על ידי pipetting 100 μL של סטרילי 50% גליצרול לתוך כל טוב ולערבב על ידי בעדינות ללטף למעלה ולמטה.
6. מכסים את הצלחות עם חותמות אלומיניום סטרילי ולהבטיח כי כל טוב הוא אטום בנפרד.
7. מספר לוחיות ולהקדיש רק אחד המלאי קפוא לוחית הספרייה לצורך מחדש תבניות חדשות בזמן נתון. שמור את השארית כמו גיבוי במקרה של זיהום לוחית של ספריית מלאי קפוא.
8. הניחו את מכסה הצלחת על גבי חותם האלומיניום והחנות ב-80 ° c.

3. תרבית זרעים וDereplication הכנה לצלחת

1. באמצעות מקל המוליך, איחסן 3 מ ל של Streptomyces אנטיביוטי בינוני (SAM) (או בינוני מתאים אחרים עבור האורגניזם נבדק) במבחנה המכילה אחת חרוז זכוכית סטרילי (כדי לשבור את mycelium) עם זן לייצר כי הוא להיות dereplicated. בשביל Streptomyces, מגרדים בעדינות. נבגים מהמשטח של מושבה
2. באמצעות אותו המוליך עץ מקל, רצף שליטה עקרות על צלחת פטרי המכילה אגר של בנט.
3. מודקת את התרבות הזרעים ב 30 ° צ' עם אוורור עבור 6 ימים (250 rpm) ו מודקת צלחת בקרת עקרות ב 30 ° c עבור 6 ימים.
   הערה: התייחס לטבלה 2 עבור מתכוני המדיה של סם ובנט. ההנחיות המפורטות לעיל מתאימות למרבית האקומיקטיטים. לשנות את מדיית הצמיחה לפי הצורך עבור חיידקים ופטריות אחרים.
4. הכינו לוחות dereplication על ידי מוחצות 23 מ ל של בנט חם אגר לתוך פיפטה סרוולוגית ומוותר 20 מ"ל באופן שווה על פני השטח של צלחת פטרי מלבנית (טבלה של חומרים), משאיר את שאר המדיום בפיפטה כדי למנוע היווצרות בועת אוויר.
   הערה: ודא כי פני השטח משמש ליציקת צלחות היא רמה ולבצע את השלב הזה לפני אגר התקרר יותר מדי; משטח שטוח חיוני להצמדת ספריה בשלבים הבאים.
5. לסובב בעדינות את הצלחת עד המדיום מכסה את כל האזורים של הצלחת ולא להפריע זה עד אגר הוגדר לחלוטין.
6. הכנת הממברנה ממברנה ניטרוגליצרין גיליונות (טבלה של חומרים) באמצעות מכסה צלחת פטרי מלבני כתבנית עקיבה כך הסדינים להתאים את פני השטח של צלחת dereplication. חותכים את הסדינים ומקלבים אותם בנרתיק סטרילי.
   הערה: קרום זה מאפשר אורגניזמים לספורקה על פני השטח שלה, בעוד מטבוליטים משני עשוי להיות מופרש לתוך המדיום למטה. לאחר שגדלו, הקרום מוסר כדי לספק משטח נקי עבור dereplication. ההתאמה הקרובה ביותר של נייר הממברנה על פני השטח של האגר של בנט, המנקה את התוצאה הdereplication.
7. בדוק את צלחת בקרת עקרות כדי להבטיח כי לא קיימים מזהמים לאחר 6 ימים של דגירה. אם מזהמים ללא זיהום, להסיר את המכסה של צלחת פטרי מלבני ו פיפטה 200 μL של תרבות הזרעים על פני השטח של אגר של בנט.
8. הפיצו באופן שווה את התרבות על פני המשטח של הצלחת כולה בעזרת משטח כותנה סטרילי.
9. מניחים את קרום הניטרוצלולוזה מוכן בשלב 3.6 על גבי התרבות על פני צלחת פטרי. התחל על ידי יישור הקצה התחתון של הקרום לקצה התחתון של צלחת פטרי, ולאחר מכן להחיל את קרום מהקצה התחתון לקצה העליון של הצלחת.
10. השתמש בספוגית כותנה סטרילי להחליק כל בועות אוויר שייתכן שנוצרו בין ממשק קרום-אגר, להבטיח כי הקרום הוא סומק אגר.
11. הניחו את המכסה על צלחת פטרי מלבנית ומניחים אותו הפוך בשקית ניילון אטומה. מודטה ב -30 ° c במשך 6 ימים.

4. לוחית הDereplication של MHB כיסוי ו-ARP/מארפ הכנה לצלחת

1. לאחר 6 ימים, הסירו את הצלחת הdereplication מהאינקובטור של 30 ° c. באמצעות מלקחיים סטרילית (autoclaved או מרוסז ביסודיות עם 70% אתנול), בזהירות להסיר את קרום הניטרוצלולוזה מפני השטח של באגר של בנט.
   הערה: צעד זה יסיר את הנבגים של הידרופובי ומיסיליה גדלו על פני הקרום כדי לספק משטח נקי עבור dereplication, הקלה על שלב 4.2.
2. כפי שמתואר עבור שלב 3.4, להבטיח את משטח העבודה הוא ברמה ולהשתמש בצנרת סרולוגית לאספירין 23 מ ל של הקטיון חם מותאם mhb אגר. ליצור כיסוי על ידי חילוק 20 מ"ל באופן שווה על פני השטח של הצלחת dereplication, להשאיר את שאר המדיום בתוך הפיפטה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
3. לסובב בעדינות את הצלחת עד המדיום מכסה את כל האזורים ולא להפריע לו עד אגר הוגדר לחלוטין. ברגע שהוא התקרר והתחזק, החזר את הצלחת הdereplication לשקית הפלסטיק האטומה ואחסן אותו הפוך ב -4 ° c בלילה.
   הערה: שלב זה מאפשר דיפוזיה של מטבוליטים משניים מן המדיום של בנט מותסס לתוך כיסוי MHB אגר. אם הממברנה התאית לא היה מוכן כראוי יהיה גידול נבג סביב קצות הצלחת, אשר יש תכונות הידרופובי להדוף את MHB אגר. אל תשפוך את הכיסוי על גבי הנבגים האלה כי זה יכול לגרום לזיהום של כיסוי.
4. באותו יום שנשפך הכיסוי, הופך תבנית ARP/MARP טרייה על-ידי ליטוף 100 μL של הקטיון MHB לתוך כל טוב של צלחת 96-באר.
   הערה: כדי להפחית את הסיכוי לפזר זיהום במהלך dereplication, להשתמש בלוח הספרייה ARP/MARP אחת רק כדי dereplicate 2-3 לוחות dereplication. לכן, החיסונים מספיק 96-טוב ARP/לוחות MARP מבוסס על מספר זנים שיהיו dereplicated.
5. קח את הלוח הקפוא ARP/MARP לוחית הספרייה מתוך-80 מקפיא ° c. הסר את חותם האלומיניום לפני העיבוי מתחיל להיווצר על הצד התחתון, ובכך להקטין את הסיכוי לזהם בארות השכנות בלוח הספרייה.
6. באמצעות שימוש סטרילי 96-הצמדה כלים (או צורות אחרות של ציוד חיסונים), סיכה בזהירות מלוח המלאי הקפוא ARP/MARP הספרייה לחישוב החדש MHB-המכיל 96-טוב צלחות. כדי למזער את הזיהום במהלך dereplication, להכין כמו ARP רבים או לוחיות הספרייה MARP הדרושים רק dereplicate 2-3 לוחות dereplication לכל לוחית הספרייה. חטא כלים הצמדה בין מספר כל צלחת.
7. שים חותם אלומיניום סטרילי חדש על התבנית הקפואה פעם אחת להשלים ולהחזיר אותו למקפיא-80 ° c. מניחים את 96 מחוסן-לוחות היטב בתוך שקית פלסטיק אטומה ו-דגירה ב 37 ° צ' עם אוורור (250 rpm) עבור 18 h.
   הערה: חדש לוחיות הספרייה מלאי קפוא ניתן להכין משלב זה לאחר להבטיח כי אין זיהום קיים. הוסיפו גליצרול לצלחת לפני שאתם מאחסנים ב-80 ° צ' כמתואר בשלב 2.5.

5. מיקוד באמצעות ה-ARP/מארפ

1. הסר את תבנית ARP/MARP מהאינקובטור וודא כי לא קיימים מזהמים. תמיד באמצעות תבנית שמוכנה טרי ולא ישירות מהמלאי הקפוא.
2. הסירו את לוחות הdereplication מ -4 ° צ' והניחו לטמפרטורת החדר להיות מעורפלת. אם יש עיבוי, פתח את המכסים ואפשר להתייבש בסביבה סטרילית.
3. שימוש בכלים הצמדה סטרילי (או ציוד חיסונים אחרים), פינים מלוח הספרייה ARP/MARP על פני השטח של כיסוי MHB אגר של לוחות dereplication. להיזהר לא לנקב את אגר. לחטא כלים הצמדה בין לאשר כל צלחת dereplication.
4. לאחר הצמדת התבנית אל פני השטח של הלוחות הdereplication, הניחו לתבנית להתייבש במשך 3 עד 5 דקות. מניחים את הצלחות dereplication מחוסן הפוכה בשקית פלסטיק אטומה, ומטה לילה ב 37 ° c.
5. Dereplication לנתח תוצאות למחרת על ידי השוואת הצמיחה על צלחת dereplication לבארות המתאימות למפת ARP/MARP (שולחן 3 ושולחן 4).

תוצאות

התוצאות הבאות הושגו כאשר אוסף של זנים של מdereplicated לאנטיביוטיקה הפקת הריבית היו באמצעות ה-ARP ו/או MARP.

דיאגרמה של זרימת העבודה dereplication ARP/MARP מתוארת באיור 1, ומפות לוחית הספרייה מוצגות באיור המשלים 1 ובאיור 2. איור 2 מדגים תוצאה חיובית dereplication שבו התמצית הסביבתית wac 8921 מזוהה כמו מפיק כלורמפאנרול. איור 3 מראה העדר הצמיחה ARP לחלוטין, אשר מציין את הנו...

דיון

הפרוטוקול המתואר לעיל יכול להיות מיושם הן גילוי של תרכובות מיקרוביאלית הרומן ושדון שניתן להשתמש בשילוב עם אנטיביוטיקה קיימים כדי להציל את פעילותם. פלטפורמת מנצל את הפלטפורמות הגבוהות של המצע של מנגנוני התנגדות ואנטיביוטיקה קנצוני שלהם, לתרכובות dereplicate בתוך תמציות טבעי גולמי מוצר. למרות הזמן הנדרש עבור צלחות dereplication להיות מוכנים הוא ארוך (~ 2 שבועות), תהליך dereplication עצמו הוא השלם לאחר תקופת דגירה אחת לילה, אשר מהירה בהשוואה לזמן זה יכול לקחת כדי לבודד ולאפיין תרכובת מתמציות גולמי. בנוסף, אין צורך בציוד יקר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS סרטים לאחסון קר	סיגמא-אולדריץ'	Z722642-50EA
אמפיצילין נתרן מלח	ביו חנות	AMP201.100
BBL מולר הינטון II מרק (מותאם קטיון)	בקטון דיקינסון	212322
BBL פיטון פפטון (סויה)	בקטון דיקינסון	211906
סידן פחמתי	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
אפליקטורים עם קצה כותנה	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 מ"ל mix.color	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
צינור תרבית חד פעמי, 16 מ"מ x 100 מ"מ	פישר סיינטיפיק	14-961-29
אלכוהול אתילי אלכוהול נטול מים	אלכוהול מסחרי	P016EAAN
חרוזי זכוכית, מוצק	פישר סיינטיפיק	11-312C
גליצרול	ביו חנות	GLY001.4
חומצה הידרוכלורית	פישר סיינטיפיק	A144-212
נרתיק עיקור איטום מיידי	פישר Scientific	01-812-54
ברזל (II) סולפט Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB מרק Lennox	Bio Shop	LBL405.500
מגנזיום סולפט Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore מסנן ממברנה, 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות	Millipore-Sigma	HAWP00010	גליל 10 FT, הידרופילי, לבן,
לוח מיקרוטסט רגיל 96 באר, בסיס עגול	Sarstedt	82.1582.001
ניו ברונסוויק Innova  44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray צלחת באר אחת	תרמו פישר 264728 מדעי		עם מכסה, צלחת פטרי סטרילית, לא מטופלת
92 מ"מ x 16 מ"מ עם מצלמות	Sarstedt	82.1473.001
כלי הצמדה	ETH ציריך-הזמנה		מותאמת אישית
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	P217-500
עמילן תפוחי אדמה	בתפזורת אסם	279
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP358-10
נתרן חנקתי	פישר סיינטיפיק	S343-500
אפליקטורים מעץ	Dukal Corporation	9000
תמצית שמרים	פישר סיינטיפיק	BP1422-2