בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

שחרורו של ETs מ נויטרופילים זוהה לראשונה כתגובה חיסונית מולדת המופעל על ידי זיהום חיידקי¹. הם מורכבים השדרה DNA אשר שונים חלבונים הגרניט עם תכונות אנטי בקטריאלי מאוגדים, כולל נויטרופילים elastase ו myeloperoxidase². התפקיד העיקרי של נויטרופילים (רשתות) היא ללכוד פתוגנים ולהקל על חיסול שלהם³. עם זאת, בנוסף לתפקיד המגן של ETs בהגנה החיסונית, מספר גדל והולך של מחקרים גילו גם תפקיד בפתוגנזה מחלה, במיוחד במהלך התפתחות של מחלות מונחה דלקות (כלומר, דלקת מפרקים שגרונית ו טרשת עורקים⁴). שחרורו של ETs יכול להיות מופעלות על ידי ציטוקינים pro-דלקתיות שונים כולל אינטרלויקין 8 (IL-8) ו נמק גורם הגידול אלפא (tnfα)^5,6, ואת הצטברות מקומי של ETs יכול להגביר את הנזק לרקמות ולעורר תגובה הפרו דלקתית⁷. לדוגמה, ETs היו מעורבים כמו לשחק תפקיד סיבתי בפיתוח טרשת עורקים⁸, קידום פקקת⁹, וחיזוי הסיכון וכלי דם¹⁰.

עכשיו הוא מוכר כי בנוסף נויטרופילים, תאים חיסוניים אחרים (כלומר, התורן תאים, אאוזיפרלס, ו מקרופאגים) יכול גם לשחרר את האור על חשיפה לחיידקים או גירוי פרו-דלקתי^11,12. זה עשוי להיות משמעותי במיוחד במקרה של מקרופאגים, בהתחשב תפקיד המפתח שלהם בפיתוח, רגולציה, והרזולוציה של מחלות דלקתיות כרוניות. לכן, חשוב להשיג הבנה גדולה יותר של הקשר הפוטנציאלי בין שחרור ET מקרופאגים ופיתוח דלקת מחלות הקשורות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מטס ורשתות בפלאק טרשת עורקים אנושיים שלמים ומאורגנים בתרובי¹³. באופן דומה, המטס היו מעורבים בנהיגה פציעה בכליות באמצעות התקנה של תגובות דלקתיות¹⁴. עם זאת, בניגוד נויטרופילים, יש נתונים מוגבלים על מנגנוני היווצרות MET מקרופאגים. מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות האדם מודלים מחוץ לתחום של היווצרות MET להראות כמה הבדלים המסלולים המעורבים בכל סוג תא (כלומר, לגבי העדר הציטרין של היסטון עם מקרופאגים)⁶. עם זאת, חלק הראו כי מהדורת NET יכול להתרחש גם בהעדר האוקירורולציה¹⁵.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה וישירה להערכת שחרור MET במודל מקרופאג רלוונטי קלינית. ישנם מספר שונים של מודלים מקרופאג cell מחוץ לתחום ששימשו לחקר מטס (כלומר, קו התאים האנושי THP-1 מונוציט וקווי התאים השונים murine מקרופאג)¹⁶. ישנן מספר מגבלות המשויכות למודלים אלה. לדוגמה, הבידול של THP-1 מונוציטים מקרופאגים בדרך כלל דורש צעד לקרקע, כגון תוספת של מיבריא אצטט myristate (PMA), אשר עצמו מפעיל את החלבון קינאז C (PKC) התלויים שבילים. תהליך זה ידוע להפעיל את שחרור ET⁴ ותוצאות שחרור בסיס נמוך הבזמ thp-1 תאים. מחקרים אחרים הדגישו כמה הבדלים ביו פעילות ותגובות דלקתיות רכוב על ידי מקרופאגים ב vivo לעומת PMA מטופלים THP-1 תאים¹⁷.

באופן דומה, את ההתנהגות ואת התגובות דלקתיות של קווי מורטין מקרופאג שונים כמו הקווים אינם מייצגים לחלוטין את ספקטרום התגובה של מקרופאגים האדם העיקרי¹⁸. לכן, לצורך חקירת היווצרות מקרופאג ET בהגדרה הקלינית, מקרופאגים (HMDMs) של האדם הראשי הנגזר הנחשב להיות מודל רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מקרופאג כמו monocytic או murine.

שחרור ET מ-M1 מקוטב HMDMs הוכח לאחר החשיפה של תאים אלה למספר גירויים דלקתיים שונים, כולל myeloperoxidase הנגזר חומצה היפוכלורית חמצון (HOCl), PMA, TNFα, ו-IL-8⁶. מתוארים כאן הוא פרוטוקול כדי להקטאת HMDMs ל-M1 פניטיפ ולדמיין שחרור MET לאחר מכן בחשיפה לגירויים דלקתיים אלה. PMA משמש גירוי של שחרור MET כדי להקל על השוואות למחקרים קודמים אשר השתמשו נויטרופילים. וחשוב מכך, HOCl, IL-8 ו-TNFα משמשים גם כדי לעורר שחרור MET, אשר האמינו להיות מודלים טובים יותר של הסביבה דלקתית ב vivo. השיטה המיקרוסקופית להדמיה של מהדורת ET כרוכה בצביעת ה-DNA של החילוץ בתרביות תאים חיים באמצעות שימוש ברעלים בירוק, הכתם הירוק של פלורסנט בלתי מורגש בצבע חומצות גרעין שהוחלו בהצלחה במחקרים הקודמים של נויטרופילים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ואיכותית של שחרור ET, אך אינה מתאימה כשיטה עצמאית לכמת של מידת שחרור ET. יש להשתמש במתודולוגיה חלופית אם הכמת נדרש כדי להשוות את היקף שחרור ET כתוצאה מתנאי טיפול שונים או התערבויות.

ה-HMDM היו מבודדים מההכנות של מעיל הבאפי האנושי המסופק על ידי בנק הדם עם אישור מוסר מאזור הבריאות המקומי של סידני.

1. התרבות החMDM

1. לבודד את המונציטים מן ההכנות מעיל באפי הכין דם היקפי של תורמים אנושיים בריאים באמצעות הכנה מסחרית זמין כדי לבודד לימפוציטים, ואחריו משחררות הנוכחית של הזרם הצנטריפוגלי^{19, . עשרים}דולר
2. לאשר את הנוכחות של מונוציטים על ידי ציטוטווייה וצביעת עם כתם Giemsa שונה לאפיון מונוציט¹⁹.
3. תחת תנאים סטריליים, להתאים את צפיפות של מונוציטים ל 1 x 10⁶ תאים/mL באמצעות RPMI-1640 מדיה ללא נסיוב. להוסיף 1 מ ל של תא זה השעיה לכל באר של 12 היטב העור הרקמה לוחית. תרבות בחממה תא ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ עבור 2 h כדי לקדם את הדבקות לצלחת תרבות רקמה.
4. תחת תנאים סטריליים, להסיר את מדיית התא ולהחליף עם השלמת RPMI-1640 התקשורת התרבותית המכילה 10% (v/v) במאגר סרום אנושי 20 מ"מ L-גלוטמין.
5. תרבות התאים ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא במשך 8 ימים, שינוי התקשורת כל יומיים.

2. פולריזציה של הmdm

1. תחת התנאים סטרילי, להכין את המדיה לקרקע M1 על ידי הוספת אינטרפרון γ (IFNγ; 20 ng/mL) ו ליפופוליד (LPS; 1 μg/mL) לתקשורת מלאה RPMI-1640 תרבות. הכן את מדיית הקרקע M2 על-ידי הוספת אינטרלויקין 4 (IL-4; 20 ng/mL) לRPMI המלאה-1640 תרבות.
2. בתנאים סטריליים, מכילים מדיה מבארות בארות העור המכילות את החברה המכילה את ה-HMDM, אשר שופרה ומתורבת כמתואר בסעיף 1.
3. שטוף בזהירות את הבארות המכילות את התאים 3x עם ה-PBS סטרילי (מחומם מראש עד 37 ° c), באמצעות 1 mL-הבליטים של PBS.
4. הוסף 1 מ ל של מדיית הטרמה של M1 או M2 לכל מדיה המכילה את ה-HMDM (המתאים לניסוי).
5. דגירה את התאים עבור 48 h ב 37 ° צ' בנוכחות של 5% CO₂ ב אינקובטור תא.

3. גירוי של הMDM כדי לגרום לשחרור MET

1. בתנאים סטריליים, להכין את מדיית התרבות המכילה המעוררים שונים של שחרור MET (המתאים לניסוי) לRPMI מלאה-1640 מדיה: PMA (25 ננומטר), רקומביננטי האדם TNFα (25 ng/mL), או האדם רקומביננטי IL-8 (50 ng/mL ).
2. לניסויים עם גירוי HOCl, להכין HOCl (200 μM) ב HBSS (טרום מחומם ל 37 ° c), מיד לפני התוספת לתאים. ודא כי HOCl אינו מוכן במדיית תאים מוחלטת.
   הערה: הריכוז של פתרון המניה של HOCl הוא כימות על ידי מדידת ספיגת UV של הפתרון ב 292 ננומטר ו-pH = 11⁶ ובאמצעות מקדם הכחדה של 350 M^-1ס"מ^-121.
3. לאחר הטיפול הפולריזציה המתואר בסעיף 2, מטפי את מדיית התא מכל הבאר ולשטוף בזהירות את התאים 3x עם 1 mL מקבל ה, או: PBS סטרילי (עבור PMA, TNFα ו-IL-8) או HBSS (עבור HOCl), אשר כבר טרום מחומם 37 ° c.
4. לניסויים עם PMA, TNFα, או IL-8: להוסיף 1 מ ל של המדיה המלאה המכילה PMA, TNFα, או IL-8 לאחר הסרת PBS בשלב הכביסה הסופי.
5. לניסויים עם TNFα, דגירה את התאים עבור 6 h ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא. לניסויים עם PMA ו-IL-8, דגירה את התאים 24 שעות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא.
6. לניסויים עם HOCl, להוסיף 1 מ ל של HOCl ב HBSS לאחר הסרת HBSS בשלב הכביסה הסופי. לאחר מכן, דגירה את התאים עבור 15 דקות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ ב אינקובטור תא.
   1. בזהירות לטפי את הטלפון supernatant ולשטוף את התאים 3x עם 1 mL משובטים של HBSS כפי שמתואר בשלב 3.3.
   2. לאחר הסרת HBSS משלב השטיפה הסופי, להוסיף 1 מ ל של RPMI-1640 המלא התקשורת התרבות. לאחר מכן, דגירה את התאים 24 שעות ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂ בחממה תא.

4. הדמיה של מפגש בתרבות התאים החיים

1. הכינו בדיקת רעלים לצבע ירוק HBSS בריכוז של 40 μM.
2. בסוף הטיפולים שתוארו בסעיף 3 כדי לגרום לשחרר MET, ישירות להוסיף 25 μL של 40 μM של הצבע לכל היטב המכילים HMDM.
3. התאים הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות בחושך.
4. הציבו את ה-HMDM בבארות של תרבות הרקמה על במת המיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלורסנט הפוך להדמיה.
5. נוהלי מיקרוסקופ
   1. הפעל מקור אור פלורסנט רחב טווח, ברייטסורס מקור אור, ומיקרוסקופ הפוך מותקן עם מצלמה דיגיטלית צבעונית ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים).
   2. סובב את גלגל הסינון לתנוחת "מספר 2" עבור הזריחה הירוקה (עירור = 504 nm, פליטה = 523 nm) לדימות של הדגימות המוכתמת הירוקות הכלולות בתוך בארות תרבות הרקמה.
   3. באמצעות המטרה 5x, למקד את התמונה עם המוקד גס, ואז ידיות מיקוד עדין על המיקרוסקופ, עד התמונה נראה חד, ברור, וממוקד כאשר מתבוננים דרך העין מיקרוסקופ.
   4. העבר את המיקרוסקופ למצב המצלמה.
   5. הפעל את התוכנה המשויכת.
   6. בחר בלשונית הלכידה בתוכנה.
   7. לחצו על הלחצן ' הפעל ' לתצוגה מקדימה של התמונה והתאימו את כפתור המיקוד העדין במיקרוסקופ עד שהתמונה תיראה חדה, ברורה וממוקדת בחלון התצוגה המקדימה של התוכנה.
   8. לחץ על לחצן הלכידה .
      הערה: התמונה שנלכדה תוצג באופן אוטומטי בתוכנה הנלווית.
   9. בתוך התוכנה, לחץ על קובץ | שמור כסוג קובץ התמונה הדרוש.
   10. על המיקרוסקופ, לסובב את גלגל הסינון אל המיקום "מספר 5" עבור הדמיה ברייטפילד ולחזור על שלבים 4.5.2 – 4.5.9 כדי להשיג את התמונה המקבילה ברייטפילד.
   11. חזור על השלבים 4.5.2 – 4.5.10 לפי הצורך עבור רכישת תמונות עוקבות.

ברייטפילד תמונות המציגות את השינויים הורפולוגיים של HMDM בתגובה לגירויים של בידול התא מוצגים באיור 1. מקרופאגים מקוטבי M1 מניסויים עם HMDM חשופים ל-IFNγ ו-LPS הראו צורה מוארך ובעלת צורת ציר, כפי שמצוין על-ידי החיצים השחורים באיור 1 (הלוח האמצעי). לצורך השוואה, המבנה של מקרופאגים מקוטב M2 לאחר החשיפה של HMDM ל-IL-4 עבור 48 h היו בדרך כלל עגול ושטוח, כפי שמצוין על ידי החיצים השחורים באיור 1 (הפאנל הימני הרחוק).

היכולת של הבדיל HMDM פנוטיפים כדי לשחרר את מטס היה דמיינו על ידי הדמיה של תאים לחיות האור עם בדיקת רעלים בירוק, כפי שהוצג באיור 2. איור 2A מציג את נתוני הפקד שהתקבלו מכל הפנוו של hmdm במשך 24 שעות בהיעדר גירויים פרו-דלקתיים. במקרה זה, היה מוגבל מאוד ירוק כתמים, כפי שהיה צפוי, בהתחשב באופי התאים המשמעות של הכתם הזה. איור 2B הראה כתמים חיוביים עבור מטס, כתוצאה מחשיפה של M1 HMDMs ל HOCL, PMA, IL-8, או TNFα. המטס מצוינים על ידי החצים הלבנים, המוצגים כפסים ירוקים, כתוצאה מגדילי ה-DNA של החילוץ. עם HOCl, בנוסף לצביעת מסחטות DNA, היה כמה כתמים ירוקים לכאורה בתאים. זה מכתים הסלולר נצפתה גם במידה מסוימת עם גירויים אחרים והוא האמין לשקף אובדן של שלמות הממברנה וכתוצאה מכך מוות תא לא תלוי כתוצאה מתנאי הטיפול.

איור 2B מציג גם את הניסויים המתאימים שבוצעו עם M2 HMDMs, אשר נחשפו IL-4. במקרה זה, לא היה שחרור של ה-DNA מן התאים, כפי שצוין על ידי העדר קווצות/פסים של ה-DNA לחילוץ; למרות, היה קצת קליטה תאית של צבע פלורסנט ירוק עם HOCl ו TNFα. למטרות השוואתי, איור 3 מציג נתונים מייצגים המציינים MET שחרור thp-1 מקרופאגים חשופים TNFα (50 Ng/mL) עבור 4 h. במקרה זה, יש לציין כי אוכלוסייה לא מקוטב של תאים שימש, ואת THP-1 מונוציטים היו מובחנים מקרופאגים על ידי טרום טיפול עם PMA (50 ng/mL עבור 72 h) כמתואר בעבר22.

איור 1: שינויים מורפולוגיים בעלי הסדר המימדי הדיפרנציאלי. נציג תמונות ברייטפילד מתוך HMDMs לא מובלים ומובחנים (n ≥ 5). HMDMs היו מתורבתים עם מדיה מלאה המכילים סרום אנושי ו גלוטמין במשך 8 ימים לפני הטרמה M1 או M2 הפנוטיפ על החשיפה IFNγ ו LPS או IL-4, בהתאמה, עבור 48 h. סרגל סרגל = 200 μm. חיצים מציינים דוגמאות של תאים המציגים מאפיינים מורפולוגיים של המערכת HMDMs M1 או M2. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מטס המיוצר על ידי M1 HMDMs בעקבות HOCl, PMA, IL-8, ו-TNFα גירוי. תמונות מייצגות של SYTOX דיקת רעלים ירוקה ויטראז ' מ (A) לא מגורה M1 ו M2 HMDMs מודטת עבור 24 שעות בהעדר גירויים דלקתיים שימשו כפקד, הוכחת העדר שחרור MET. (ב) M1 ו-M2 HMDMs טופלו עם 1) hocl (200 μm, 15 דקות), pma (25 ננומטר), או IL-8 (50 Ng/ml) עם דגירה עבור 24 h או 2) TNFα (25 Ng/ml) עם דגירה עבור 6 h כדי לגרום לשחרר MET. מטס היו מדמיינו בתוספת של בדיקת רעלים ירוקה, כפי שמצוין על ידי חיצים לבנים בפאנל העליון מ-M1 HMDMs. הגרורות לא נראו בניסויים המתאימים עם M2 HMDMs. Data מייצגים שכפול בארות התרבות מ n ≥ 3 תורמים בודדים. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: המטס המיוצרים על ידי מקרופאגים לא מקוטב 1 בעקבות גירוי TNFα. תמונות מייצגות של SYTOX דיקת רעלים ירוקה מוכתם TNP-1 מקרופאגים, אשר הובלו על ידי טרום טיפול עם PMA (50 ng/mL עבור 72 h) לפני דגירה נוספת עבור 4 h בהעדר או נוכחות של TNFα (50 ng/mL) כדי לגרום לשחרר MET. המטס היו מדמיינו בתוספת. של בדיקת רעלים ירוקה נתונים מייצגים של שכפול בארות התרבות מניסויים n ≥ 3. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

. למחברים אין מה לגלות