הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

4.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60542

⸱

24 באפריל 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Angiogenesis and Ocular Cell Transplantation, University of Lübeck, 2Department of Ophthalmology, University of Lübeck, 3Institute of Biomedical Optics, University of Lübeck

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

תקציר

Nd: לייזרים YAG שימשו כדי לבצע ניתוח בעינית לא פולשנית, כגון capsulotomy במשך כמה עשורים עכשיו. האפקט המרחיק מסתמך על התמוטטות אופטית במוקד הלייזר. גלי הלם אקוסטי בועות הקצף נוצרות, גרימת קרע ברקמה. גודל בועה והגברה של הלחץ משתנים באמצעות אנרגיית הדופק ומיקומו של נקודת המוקד. במחקר זה, עיניים פורקלסי חזירי הוקמו מול מסחרית זמין Nd: YAG לייזר. משתנה אנרגיות הדופק, כמו גם עמדות שונות של נקודות מיקוד אחורי הקרנית נבדקו. נגעים וכתוצאה מכך הוערכו על ידי שני פוטון מיקרוסקופ ו היסטולוגיה כדי לקבוע את הפרמטרים הטובים ביותר עבור התנתקות בלעדית של תאים אנדותל הקרנית (CEC) עם נזק מינימלי השני. היתרונות של שיטה זו הם הצריבה המדויקת של CEC, מופחתת נזק סביבתי, ומעל לכל, טיפול ללא מגע.

מבוא

שקיפות הקרנית חיונית להעברת האור לרשתית ולפוטוטורטורים1. בהקשר זה, מצב יחסי של התייבשות הוא קריטי כדי לשמור על סיבי הקולגן בתוך משתית הקרנית מיושרים כראוי. הומאוסטזיס זה מתוחזק על ידי תאי הקרנית אנדותל (CEC) ממוקם על קרום האמת (DM)2. האנדותל היא שכבת הקרניות הפנימית ביותר. יש לו מכשול חשוב ותפקוד המשאבה, אשר חיונית עבור שקיפות הקרנית3. בניגוד האפיתל, האנדותל אינו מסוגל לחדש את העצמי4. לפיכך, כל נזק תאי שנגרם על-ידי מחלה או טראומה מגרה את התאים האנדותל הנותרים כדי להגדיל ולהגר, לכסות את הפגמים הנובעים ולשמור על פונקציונליות הקרנית5. עם זאת, אם צפיפות ה-CEC נופלת מתחת לסף קריטי, פירוק האנדותל מוביל לבצקת, וכתוצאה מכך ראייה מטושטשת וחוסר נוחות או כאב חמור אפילו4. למרות הזמינות של תרופות כדי להקל על הסימפטומים, כיום הטיפול הסופי היחיד במקרים אלה הוא השתלת הקרנית, אשר ניתן לבצע בצורה של השתל בעובי מלא או השתלת אנדותל מלצ'יני. הנוהל האחרון הינו זמין בתור ממברנה של הממברנה האנדוספיה (DMEK), כמו גם של התפשטות הנוכחות האוטומטית של מתיחת העומק (DSAEK)6. עם זאת, ההגנה של שנותרו CEC ושיפור ההישרדות שלהם יכול להיות יעד חלופי, אשר זקוק למודל מחלה נאותה כדי לבחון תרופות טיפוליות פוטנציאליות.

הנוכחי CEC מחלת הפסד מודלים להתמקד בהשמדת האנדותל באמצעות הזרקה של סוכנים רעילים (g., בנזלקוניום כלוריד) לתוך החדר הקדמי או על ידי שחיקה מכנית של התאים באמצעות שיטה של ירידות פולשני7,8. בעוד מודלים אלה מבוססים היטב, חסרונות כגון תגובה דלקתית כללית ונזק סביבתי לא מדויק קיימים. לכן, מודלים אלה נוטים יותר לייצג את השלבים הסופיים של המחלה, כאשר האפשרויות הכירורגי הנ ל הם בלתי נמנעים.

עם ההתקדמות אסטרטגיות הטיפול הסלולרי כגון בתאי גזע וטיפול גנטי, היישום של אלה טיפולים סלולריים יכול להיות שימושי בשלבים המוקדמים של הפסד CEC9. לאחר מכן, אנו זקוקים למודל המייצג את השלבים המוקדמים האלה של המחלה בצורה מספקת יותר. בהקשר זה, מודלים של תרבות התא השתפרו בעשור האחרון אבל הם עדיין מוגבלים בתוקף שלהם, כמו תאים בתחום החוץ לא יכול להתקרב לשכפול האינטראקציות המורכבות המתרחשות בין סוגי התא השונים בתוך הקרנית10. לכן, vivo ex ובדגמי המחלות vivo עדיין בביקוש גבוה ושיפור הקיימים הוא בעל אינטרס מוחלט.

פולשני, ניתוח תוך העינית על ידי פוטושיבוש באמצעות מניאודימיום: YAG (Nd: YAG) לייזר הפך הליך שגרתי עבור רופאי עיניים ברחבי העולם מאז השקתו בסוף שנות ה-7011. פוטושיבוש מסתמך על קליטת אור לא לינארית המובילה להקמת פלזמה, הדור של גלי הלם אקוסטי, ויצירת בועות קוויטציה, בכל פעם שאתר היישום ממוקם בסביבה נוזלית12. באופן כללי, תהליכים אלה תורמים להשפעה המיועדת של חיתוך רקמות מדויק. עם זאת, הם יכולים גם להיות מקור נזק סביבתי מיותרים הגבלת הכליאה המקומית של ניתוח לייזר13.

החיזוי של השפעות מכניות כתוצאה מכך השתפר באופן משמעותי באמצעות אפיון של הפצת גל ההלם וקורס החפירה. זוהי המטרה שלנו למקד את CEC עם נזק קטן לרקמות שמסביב ככל האפשר כדי לספק מודל פולשני, לייזר בסיוע ניסיוני המודל עבור בשלבים המוקדמים של הפסד CEC. לצורך זה, יש צורך לקבוע את האנרגיות האופטימליות של הדופק ומיקומי הנקודות של מוקדי הלייזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים ברקמת בעלי חיים עוקבים אחר ההנחיות של ועדת האתיקה המקומית לטיפול בבעלי חיים.

1. הכנת תרבות איברים וטיפול לייזר

  1. השיגו עיניים פורקליות טריות מהמטבחיים שמור אותם קריר (4 ° c) ב שונה בינונית הנשר של דולבco (dmem) עם גלוקוז גבוה, שיושלם עם L-גלוטמין, נתרן פירובט, פניצילין/סטרפטומיצין (1%), סרום חזירי (10%), מעתה המכונה במאמר זה כמדיום מלא.
  2. הסרת רקמות מיסיביות עם מספריים ולהשרות את העיניים 5% povidone-הפתרון האופטלמולוגי של יוד עבור 5 דקות לפני הצבת אותם מלוחים מעוקר מאגור פוספט (PBS) עד השימוש.
  3. עיניים מסך עבור הפתווגיות מקטע הקדמי הראשי, כגון צלקות הקרנית, בצקת, ו אטימות אחרות עם התקן ספקטרלי קוהרנטית אופטי של טומוגרפיה ממוחשבת (טבלת חומרים).
  4. למקם את העיניים מול יחידת מנורה שחור מצויד Nd: YAG לייזר (טבלה של חומרים), אשר יש אורך גל של 1,064 ננומטר ו קוטר ספוט מוקד של 10 יקרומטר באוויר.
    הערה: לצורך מיקום אופטימלי מנגנון החזקת תלת-ממד מודפס משמש, אשר נועד להחזיק את חברת העין, מבלי ללחוץ יותר מדי על זה (איור 1).
  5. השתמש הגדלה של 12x ולהדוף את התאורה כדי להמחיש את שכבות הקרניות הבודדות.
  6. הגדר את אנרגיית הדופק (למשל, 1.6 mJ) ונקודת המיקוד (לדוגמה, 0.16 מ"מ) עבור אבלציה סלקטיבית של תאי האנדותל.
  7. במקום הקרנף ברור שיהיה בקרבת לימבוס והכנס אתהחומרהגמיש ביותר (לוח חומרים) כדי לייצב את התא הקדמי.
  8. בלו את הקרנית המרכזית שטופלה בלייזר באמצעות טרפין של 8 מ"מ.
  9. הניחו את הקרנית המחפירה בבאר של לוחית של 12-הצלחות עם האתר האנדותל הפונה כלפי מעלה והדגם בתוך 3 מ ל של מדיום מלאה ב-37 ° c עד 3 ימים.
    הערה: ניתן להוסיף למדיום סוכני cytop, פוטנציאליים במהלך שלב זה.

2. הכנה להיסטולוגיה

  1. הכנת מאגר של סורנסן עם pH של 7.4 המכיל 19.6 mL של 133 mM KH2פו4 ו 80.4 Ml של 133 mm Na2hpo4.
  2. להסיר את המדיום מתוך קרנית המכילה היטב ולקבוע את הרקמה 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) באמצעות מתנול-בחינם פאראפורמלדהיד (4%) במאגר של סורנסן
  3. מניחים רקמות ב -20% סוכרוז ב-PBS עד כיורים רקמות (1 h) ולאחר מכן ב 30% סוכרוז ב-PBS לילה ב-RT. דאג להימנע ממגע עם בועות וממשק פני האוויר. הטמע רקמות בטמפרטורת חיתוך מיטבית (OCT) ובחנות at-80 ° c.
  4. גזור סעיפים 10 יקרומטר עבה באמצעות קריוסטט ב-27 ° c.
    הערה: מברשת שיער גמלים שימושי כדי להנחות את הקטע המתעוררים על להב הסכין.
  5. העבר את המקטע לשקופית מיקרוסקופ על ידי נגיעה בשקופית לרקמות בתוך 1 דקות של חיתוך אותו כדי למנוע הקפאת ייבוש של הרקמה. אחסן את השקופיות ב--80 ° c.

3. המטאוקסילין ואאוזין (H & E) מכתים

  1. חלקי אוויר יבשים במשך כמה דקות כדי להסיר לחות.
  2. כתם עם מסוננים 0.1% מיימרים המטאוקסילין במשך 10 דקות בצינור 50 mL.
  3. בצנצנת Coplin, לשטוף קריר פועל ddH2O עבור 5 דקות ולטבול ב 0.5% אאוזין 10x.
  4. טבול ב-ddH2O עד אאוזין מפסיק בעירום ולאחר מכן לטבול 50% (10x), כמו גם 70% (10X) אטוה.
  5. משקל 95% אטוח (30 s) ו 100% אטוח (60 s) לפני שטבול בקסילן מספר פעמים.
  6. לבסוף לטעון, coverslip הדגימה לפני נטילת תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות ההליך המוצג כאן, התייחסו לעיניים עם Nd: YAG לייזר, הערכת אנרגיות פולס שונות (1.0-4.6 mJ) ועמדות של נקודות מוקד (מרחק מהמשטח האחורי של הקרנית: 0.0-0.2 מ"מ) כדי למצוא את הפרמטרים האופטימליים. מספר משכפל (n = 3) הוערך עבור כל קבוצת כוכבים של פרמטרי הלייזר (12 x 21).

בנוסף לפרוטוקול הנ ל, הדגימה נותחה עם מיקרוסקופ שני פוטון לפני קיבעון ו-H & E כתמים. מיקרוסקופ שני פוטון השתמשו במצב מוצק, נעול במצב 80 MHz Ti: לייזר ספיר עם טווח כוונון של 690-1b040 nm ופלט לייזר ממוצע של > 900 mW ב 80...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התוצאות של המחקר הטיס הזה עולה כי Nd: YAG לייזר ניתן להשתמש באופן סלקטיבי בתאי הקרנית בצורה סלקטיבית כאשר הפרמטרים המתאימים למינון האנרגיה ומיקום נקודת המיקוד נבחרים.

כמו הפונקציה אנדותל חשוב עבור שקיפות הקרנית ושמירה על הקרנית מתוך בצקת סטרומה, מודלים של בעיות אנדותל לשחק תפקיד חשוב בפיתוח של תרופות נגד הגנה או ניתוחים כירורגיים. יש כמה הקים במודלים חוץ גופית עבור חיקוי במצב vivo10,14,15, אבל כפי שיד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים לכריסטין וררן וליאן א. סוצ'יורק על עזרתם בשיטות נסיוניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ואקום BARRON TREPHINEKATENAK20-2058
CryostatLeicaCM 3050S
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני - גבוה גלוקוזPAAE-15009
מחזיק עינייםעצמיN/A
מיקרוסקופ הפוךLeicaDMI 6000 B
KH2PO4Merck529568
Na2HPO4Merck1065860500
Nd:YAG לייזרZeiss MeditecvisuLAS YAG II פלוס
OCT רקמות טקסאקורה פינטכניק4583
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'P4333
פוספט חוצץ מלח (PBS)Gibco10010056
סרום חזירסיגמא-אולדריץ'12736C
טומוגרפיהקוהרנטית אופטית ספקטרליתהיידלברג הנדסהספקטרליס
צלחת תרבית רקמות 12 בארותSarstedt833921
מיקרוסקופ דו-פוטוניJenLabDermaInspect
ViscoelasticOmniVisionMethocel

מקורות

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
  3. Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
  4. Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
  5. He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047(2016).
  6. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  7. Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
  8. Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
  9. Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
  10. Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
  11. Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
  12. Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
  13. Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
  14. Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
  15. Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
  16. Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
  17. Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
  18. Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).
  19. Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
  20. Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
  21. McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
  22. Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אבליציה בלייזר Nd:YAGניתוח תוך-עיני לא פולשנימודל עין של חזירמיקרוסקופיית דו-פוטוןניתוח היסטולוגיאבליציית תאים סלקטיביתאופטימיזציה של פרמטרי לייזרפרוטוקול קיבוע רקמותחיתוך בקריוסטט
פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.