הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים

12.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60543

⸱

6 בפברואר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Biocontrol, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שלוש שיטות להערכת הגירה נויטרופילים והסתננות הן בvivo והן בתוך מבחנה. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות מבטיח therapeutics פילוח הגירה נויטרופילים.

תקציר

נויטרופילים הם חבר מרכזי של המערכת החיסונית מולדת ולשחק תפקידים מרכזיים הגנה מארחים מפני פתוגנים ותגובות דלקתיות פתולוגי. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים. הסתננות מוחצת של נויטרופילים יכול להוביל נזק לרקמות הבחנה, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA). נויטרופילים מבודדים מתוך התפענות הצפק להגיב הגדרת כימוסטנט מוגדר, N-formyl-Met-מלאו-פה (fMLP), ב מבחנה ב Transwell או הלשכה הקאמרית Zigmond. את הניסוי כיס האוויר ניתן להשתמש כדי להעריך את כימוטקוניות של נויטרופילים לכיוון ליפופוליסכריד (LPS) ב vivo. מודל העכבר המושרה (AA) הנגרמת לעתים קרובות נעשה שימוש במחקר RA, ומכתים אימונוהיסטוכימיה של סעיפים משותפים עם anti-myeloperoxidase (MPO) או אנטי נויטרופילים elastase (NE) נוגדנים היא שיטה מבוססת היטב כדי למדוד הסתננות נויטרופילים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות טיפולים מבטיחים מיקוד הגירה נויטרופילים.

מבוא

נויטרופילים הם הנפוצים ביותר בתאי דם לבנים וחשבון עבור 50 ל-70% של אוכלוסיית כולה של תא דם לבן בבני אדם1. נויטרופילים הם אחד המגיבים העיקריים במהלך דלקת חריפה. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים שוחרר על ידי תאיםתושבהרקמה 2,3,4, אשר מתווך על ידי אינטראקציות בין מולקולות הדבקה התא על פני השטח של התאים נויטרופילים וכלי הדם5. נויטרופילים הם בסיסיים לארח את ההגנה ולשחק תפקיד בתגובות דלקתיות פתולוגי בשל קיבולת רבת עוצמה שלהם כדי לפגוע ברקמות באמצעות שחרורו של מינים חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות לפגיעה ברקמות3,6.

מחקרים קודמים תיארו מספר פרוטוקולים של בידוד נויטרופילים מעכברים או בני אדם. הו ואח ' הפגינו שיטת הפרדה בצפיפות מעבר הצבע כדי לבודד נויטרופילים אנושיים מהדם האנושי השלם7. עם זאת, בידוד של נויטרופילים מספיק דם העכבר קשה בגלל נפח הדם הקטן. לחילופין, מספרים גדולים של העכבר טהור ומלא קיימא יכול להיות הכין מתוך נוזל הצפק העכבר, ואת אלה נויטרופילים מטוהרים ניתן להשתמש לשעבר vivo לבחון מספר היבטים של פונקציות הסלולר ex vivo, כולל הסתננות נויטרופילים, הגירה, כימוטווניות, פרץ חמצוני, cy, ו נויטרופילים השמנה מסחטות (NET) 10,11 יכול לשמש להערכת. הגירה של נויטרופילים במבחנה מודל כיס האוויר משמש כדי להעריך את הגירה הסתננות של נויטרופילים ב vivo. מודל כיס האוויר תת עורית הוא נוח במודל בעלי חיים vivo ללמוד הגירה של תאים דלקתיים.

באופן מסורתי, נויטרופילים נחשבו כמו הפתוגן מייבשים בשלבים אקוטי של דלקת. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי נויטרופילים הם תאים מסובכים המבצעים מגוון משמעותי של פונקציות מיוחדות. נויטרופילים יכול לווסת תהליכים רבים כגון פציעה חריפה ותיקון, tuמוריגנזה, תגובה אוטואימונית, דלקת כרונית12,13. נויטרופילים גם לווסת את התגובות החיסונית אדפטיבית יכול להסדיר B תאים ו T תאים14,15. מחסור ניכר של נויטרופילים מוביל לתמותה או כשל חיסוני חמור בבני אדם ו נויטרופילים דלדול בעכברים מוביל הקטלנית, בעוד הפעלה מוגזמת או גיוס של נויטרופילים באיברים גורם למחלות החיסון מספר, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA) ו זאבת מערכתית מאריתסוס (לשיון)6. נויטרופילים הם התאים השופעים ביותר בנוזל אמתחת של חולים RA. נויטרופילים לייצר כמויות מוגזמות של myeloperoxidase (MPO) ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות השפלה, אשר שחיקה הסחוס בייטס. MPO הוא אנזים peroxidase מתבטא בעיקר בגרגירים של נויטרופילים16. NE קשורה להשמדה הסחוס הבין-מולקולרית17. MPO ו-NE יכול לשמש כדי להעריך את הסטטוס של הגירה נויטרופילים הסתננות ברקמת מטופלים RA.

מאמר זה מספק שלוש שיטות קונבנציונליות כדי להעריך את הגירה של המושרה נורמלי מושרה הן ב vivo ו בחוץ גופית, כמו גם חדירה של נויטרופילים פתולוגי במודל העכבר משותף ספציפי לדלקת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים נבדקו ואושרו על-ידי אוניברסיטת בייג לטיפול בבעלי חיים ברפואה הסינית והוועדה לשימוש.

הערה: C57BL/6 עכברים (בן 7-8 שבועות) שימשו.

1. בידוד נויטרופילים

  1. רכישת תאים בעלי כדוריות הצפק
    1. הכינו את התמיסה החדשה של 10% ב-ddH2O. חשב את עוצמת הקול הדרושה בהתאם למספר העכברים.
      הערה: הגדר את מספר העכברים כ-N, (2N + 1) מ-mL של הפתרון חייב להיות מומס ומסונן מראש.
    2. רסס את סביבת העבודה עם 70% אתנול. השתמש מזרק אינסולין כדי לצייר 1 מ ל של פתרון peptone ובועות פריקה.
    3. הערכת הזרקת הצפק ראשונה של 1 מ ל של פתרון peptone לכל עכבר.
      1. לתפוס את העכבר בתנוחת הראש עם יד אחת. לחטא את מקום ההזרקה עם כדורי כותנה ספוגים באלכוהול.
        הערה: תנוחת ההזרקה המועדפת טמונה בהיבט הרוחבי של הרביע השמאלי או הימני התחתון של הבטן.
      2. להשרות את הריאגנטים במהירות. הכנס 1 מ ל לתוך החלל הצפק של כל עכבר עם מזרק אינסולין.
        הערה: הזווית בין המחט לבין העור צריכה להיות כ -15 עד 30 ° כדי להימנע מפציעה במעיים או באיברים אחרים.
    4. אפשר לתגובה דלקתית להתפתח בן לילה. לאחר 12 שעות, לנהל את הזריקה השנייה באותו אופן כמו הזריקה הראשונה.
    5. שלוש שעות לאחר הזריקה השנייה, מורדם לחלוטין עכברים עם 5% isofלינה עבור 5 דקות בתא הרדמה גז במהירות של 2 L/min. הסירו את העכברים המדמיגים מהתא. והקריבו אותם באמצעות נקע בצוואר הרחם
      הערה: עומק מספיק של הרדמה מובטחת על-ידי צביטת הבהונות לפני הזזת עכברים מהתא ליחידת הנשימה היחידה. הרגליים לא אמורות לזוז. כשהאצבעות מצפות
      הערה: יש לעבד את כל הצעדים הבאים במכסה של תרבות הרקמה.
    6. לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הנח את העכבר על משטח פלסטיק סטרילי ותקן את הגפיים במחטים.
    7. השתמש בערכה סטרילית של כלים כירורגיים כדי לבצע חתך אופקי (~ 1 ס מ) באמצע הבטן התחתונה. להרים את העור של הבטן העליונה עם מלקחיים ולחתוך לאורך קו האמצע של הבטן ולחשוף את קיר הצפק שלמים.
    8. הכנס 5 מ ל סטרילי RPMI-1640 בינוני להשלים את חלל הבטן עם 30 G x 1/2 "מחט. הכנס את המחט דרך הקיר הצפק עם הקצה השופע של המחט הפונה כלפי מעלה ולהזריק את כל הנפח.
    9. טלטל את המשטח אופקית למשך 5 דקות. עסה את הבטן מספר פעמים בעדינות.
    10. להזריק 23 G x 1 1/4 "מחט לתוך החלל הצדדי של הבטן. לחלץ את נוזלי הבטן (~ 5 מ"ל) ולאסוף אותו בשפופרת צנטריפוגה 50 mL.
      הערה: מניחים את הצינורות על הקרח בהקדם האפשרי במקרה של הפעלת נויטרופילים.
    11. הכנס עוד 5 מ ל של בינוני מלא וחזור על ההליך כדי להסיר את התאים הנותרים מצפק. ברכת את נוזל הצפק. בשפופרת הצנטריפוגה 50-mL
    12. צנטריפוגה את הנוזל הצפק במאגר ב 400 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    13. . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את התאים ב-1 mL של RPMI-1640 בינוני מלא.
      הערה: לא מערבולת כדי למנוע הפעלת נויטרופילים.
  2. בידוד של נויטרופילים
    1. הוסף 4 מ ל של מעבר טרי 70.2% צפיפות הדרגתי בינונית (למשל, חלחול) בשפופרת צנטריפוגה 15 מ ל.
    2. כיסוי בזהירות 4 מ ל של הכין טרי 54.8% צפיפות מעבר הצבע בינונית על 70.2% צפיפות מעבר הצבע לאט לאורך קצה הצינור עם עצות בצנרת חדה ב 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת.
      הערה: תרגיל זהירות כדי להימנע מהפרעה לממשק בין בינוני הדרגתי של צפיפות 54.8% ו-70.2% בינונית מעבר הדרגתי של צפיפות.
    3. שכבת בזהירות הבולם תא הצפק 1 mL על גבי השכבה בינונית 54.8% צפיפות הדרגתי לאט עם עצות בצנרת חדה (איור 1א).
      הערה: תרגיל זהירות כדי להימנע מהפרעה לממשק בין ההשעיה של התא לבין מדיום 54.8% בצפיפות מעבר הצבע.
    4. צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 30 דקות ב 22 ° צ' ללא בלימה.
    5. לאסוף את נויטרופילים בממשק של 54.8% צפיפות מעבר הצבע בינוני ו 70.2% צפיפות שכבות בינוניות (איור 1B) לצינור חדש.
    6. הוסף 1 מ ל של RPMI-1640 בינונית להשלים את התאים שנאספו ובזהירות להשהות את התאים על ידי ליטוף בעדינות מספר פעמים. צנטריפוגה ב 100 x g עבור 10 דקות בשעה RT ובזהירות להסיר את supernatant.
    7. חזור על שלב השטיפה (שלב 1.2.6) פעם אחת.
    8. הוסף 0.5 mL של התרבות בינונית לגלולה להשעות את התאים מחדש על ידי ליטוף בעדינות מספר פעמים. קח 50 μl סדרת מחלקים כדי לספור את התאים באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי.

2. שיטת ההגירה של נויטרופילים

  1. למדוד את הגירה נויטרופילים על ידי שיטת העברת שינוי9 או שיטת zigmond קאמרית כפי שתוארה בעבר10,11.

3. שיטת האוויר בנרתיק

  1. הזרקת אוויר ראשונה
    1. ביום 0, מורדם לחלוטין עכברים עם 5% isofלילה עבור 3 דקות בחדר הרדמה גז במהירות של 2 L/min, ולשמור על ההרדמה של כל עכבר ביחידת נשימה אחת עם 2% isofהלביאן במהירות של 0.5 L/min.
      הערה: עומק מספיק של הרדמה מובטחת על-ידי צביטת הבהונות לפני הזזת עכברים מהתא ליחידת הנשימה היחידה. הרגליים לא אמורות לזוז. כשהאצבעות מצפות
    2. השתמש במסנן 0.22 יקרומטר המצורף ל-5 מזרק ml כדי לקבל נפח של 3 מ ל של אוויר מעוקר.
    3. הרם את העור האחורי של העכבר מורדם עם מלקחיים ו תת-עורי להזריק 3 מ ל של אוויר מעוקר באמצעות 26 G x 3/8 "מחט.
    4. לאחר הטיפול, להסיר את העכברים מיחידת הנשימה. עקוב אחר העכברים כדי להבטיח שהם בחיים עד שהם מתחילים לנוע.
  2. הזרקת אוויר שנייה
    1. ביום 3, להזריק 3 מ ל נוסף של אוויר מעוקר לתוך כיס האוויר הוקמה בעבר כדי לקיים את כיס האוויר כמתואר בסעיף 3.1.
  3. טיפול
    1. , ביום 6, 6 שעות לפני ההקרבה. תזריק טיפולים שונים לתוך כיס האוויר הכנס 1 מ"ל של תמיסת מלח (PBS) באגירה של פוספט בתור פקד שלילי. הכנס 1 מ ל של 1 μg/mL LPS כפקד חיובי כדי לגרום לדלקת מקומית.
    2. מורדם לחלוטין עכברים עם 5% isofלילה עבור 3 דקות בחדר הרדמה גז במהירות של 2 L/min, ולשמור על ההרדמה של כל עכבר ביחידת נשימה אחת עם 2% isof, במהירות של 0.5 L/min. הכן מאגר לשטוף על פי לוח חומרים.
      הערה: עומק מספיק של הרדמה מובטחת על-ידי צביטת הבהונות לפני הזזת עכברים מהתא ליחידת הנשימה היחידה. הרגליים לא אמורות לזוז. כשהאצבעות מצפות
    3. עבור כל כיס האוויר, לשטוף את כיס האוויר עם 1 מ ל של מאגר לשטוף ולאסוף את האקסודלקתית ב 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה. לשטוף את כיס האוויר עם 2 מ ל של מאגר לשטוף 2x ולאסוף את האקסוהדלקתית באותה צינורית צנטריפוגה.
    4. צנטריפוגה ב 100 x g עבור 10 דקות ב-RT. לבטל את התאים מחדש ו-השהה באמצעות 1 mL של מאגר לשטוף. לספור את התאים כדי לכמת את היחס נויטרופילים באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי.
      הערה: ראה תוצאות מייצגות באיור 2.

4. האינדוקציה של מודל העכבר של דלקת מפרקים המושרה (AA)

  1. להשעות להשלים את הפסיקה של פרוינד (פרנק) על ידי vortexing לפחות 5 s, ואז לצייר 100 μL של השעיה לתוך מזרק אינסולין.
    הערה: אנו ממליצים להשתמש בחדש לחלוטין בניסויים כדי להבטיח עקרות.
  2. עכברים מורדם כמתואר בשלב 3.1.1.
  3. סמן את כף היד הנבחרת והזרק 20 μL של הדיסק לתוך השטח המפרק של הקרסול. הכנס 20 μL של השעיה לתוך ארבעה כתמים פריקולריות על כף היד הנבחרת (80 μL בסך הכל).
  4. להסיר עכברים מיחידת הנשימה ולשים את העכברים מעובד בתא חדש. הצג עכברים כדי לוודא שהם נושמים עד שהם מחדש את היכולת לזוז.
  5. כל 3 ימים, להעריך את קוטר משותף על ידי מדידת קוטר מפרק הקרסול באמצעות מד עובי כיס (איור 3א).
  6. כל 3 ימים, להעריך את חומרת דלקת מפרקים על ידי מפרקים הבקיע קריטריון (איור 3ג): 0, נורמלי, אין ראיות של אריתמה ונפיחות; 1, דלקת הפרקים המוזרה ביותר, אודם ונפיחות קלה המוגבלת לקרסוליים או למפרק הקרסול; 2, דלקת מפרקים מתונה, אודם ונפיחות קלה הארכת מן הקרסול אל הרגליים; 3, דלקת מפרקים חמורה, אודם ונפיחות מתונה הארכת מתוך הקרסול למפרקים מתכת; 4, דלקת מפרקים חמורה ביותר, אודם ונפיחות קשה להקיף את הקרסול, הרגל והספרות, או ankylosis של האיבר.

5. כתמים אימונוהיסטוכימיים של חלקים משותפים

  1. בידוד משותף
    1. להקריב את העכבר בסעיף 4 באמצעות פריקה צוואר הרחם לאחר הרדמה עם isofלוריאן. לרסס את העכבר עם 70% אתנול.
    2. הסר את העור וחלק משריר הרגל האחוריות עם מלקחיים ומספריים. רסס את המפרק עם 70% אתנול ולהסיר את שאר השרירים באמצעות מגבת נייר.
    3. תקן את מפרק הקרסול ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 2 ימים בשעה RT. Decalcify המפרק ב 10% EDTA עבור חודש 1 ב RT ולשנות את המדיום שבועי.
    4. הטמע את הרקמה בפרפין והכינו מקטעי רקמה בעובי 4-μm.
      1. מניחים רקמה בתבנית מסומנת עם נפח מסוים של פרפין נוזלי. . מגניב לזמן קצר
      2. להגדיר את עובי ב 4 יקרומטר ו לחתוך פרוסות על מיקרוטומה. קטעים צפים באמבט מים ב43 ° c.
      3. הבהר את המקטעים על שקופיות והעבר את השקופיות לתוך התנור ב-70 ° c עבור 2 שעות. לשימוש עתידי, שימור השקופיות ב-20 ° c.
  2. Safranin O וכתמים ירוקים מהיר של סעיפים משותפים
    הערה: השלבים הבאים מכתים מתנהלים ב-RT.
    1. מניחים את השקופיות משלב 5.1.4.3 בארון תקשורת ולבצע את השטיפה הבאים כדי להשקות ב-RT: קסילן עבור 5 דקות (3x), 100% אתנול עבור 2 דקות (2x), 95% אתנול עבור 2 דקות (2x), 70% אתנול עבור 2 דקות, ו 50% אתנול עבור 15 דקות.
    2. כתם ב 0.1% הפתרון הירוק מהיר עבור 5 דקות. לשטוף ב 1% חומצה אצטית עבור 10 s.
    3. כתם ב 0.1% safranin O צביעת פתרון עבור 20 דקות. לטבול את השקופיות בשטף הבא: 95% אתנול עבור 2 דקות (2x), 100% אתנול עבור 2 דקות (2x), ו קסילן עבור 2 דקות (2x).
    4. הר את מקטעי הרקמה ולהתבונן הרקמות תחת מיקרוסקופ.
      הערה: ראה תמונותמייצגות באיור 4א.
  3. אימונוהיסטויוכימיים מכתים כדי להמחיש נויטרופילים
    1. אופים את מקטעי פרפין עבור 2 h ב 78 ° c. מניחים את השקופיות בארון תקשורת ולבצע את שוטף הבא כדי לעבור מחדש ב RT: קסילן עבור 15 דקות (2x), 100% אתנול עבור 5 דקות (2x), 95% אתנול עבור 5 דקות, 80% אתנול עבור 5 דקות, H2O עבור 3 דקות, ו-PBS עבור 3 דקות.
      הערה: אל תתנו לשקופיות להתייבש בכל עת במהלך שלב זה.
    2. הוסיפו טיפה אחת של מאגר חדירות כדי לכסות את הרקמה. מחלקים הדגירה במגש מבוקר לחות ב 37 ° c.
    3. לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x). הימנע שטיפה הרקמה ישירות.
    4. בצע בחום המושרה אנטיגן אפירופה לאחזור באמצעות דוד הלחץ.
      1. סידור שקופיות בארון תקשורת. לטבול שקופיות דוד הלחץ ממולא מאגר אחזור.
      2. שים את הדוד לחץ על תנור מיקרוגל. הגדר את תנור המיקרוגל ב-600 W וחמם את השקופיות במשך 10 דקות.
      3. לאחר הרתיחה, לשמור על השקופיות בדוד להתקרר עד 90 ° c. להוציא את השקופיות ולשטוף אותם ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    5. פעילות peroxidase אנדוגניים כיבוי בהכנה טריים 3% H2O2 בשעה RT עבור 15 דקות. לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    6. לתאר עיגול גדול סביב המדגם עם עט הידרופובי, להימנע מלגעת במדגם. בלוק עם 3% בסרום שור (BSA) בחדר לחות הנשלט ב-37 ° c עבור 60 דקות.
    7. הסר פתרון חסימה. הוסף 50 μL של נוגדן ראשוני מדולל PBS לכל מקטע במהירות. ואז, מודאת השקופיות במגש שבשליטת לחות ב -4 ° c בלילה.
      הערה: יחסי דילול שונים משמשים לנוגדנים שונים (1:25 עבור MPO ו 1:20 עבור NE).
    8. ביום השני, להוציא את המגש ולתת לו לעמוד ב-RT עבור 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    9. הוסף 50 μL של נוגדנים משניים PBS-מדולל לרקמות.
      הערה: יחסי דילול שונים הוחלו: 1:1000 עבור MPO ו-1:1500 עבור NE.
    10. דגירה שקופיות במגש מבוקר לחות ב 37 ° c עבור 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב-PBS עבור 3 דקות (3x).
    11. לפתח ב מדולל 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוך) פתרון עבור 5 דקות. לפקוח עין על התגובה במקרה של פיתוח של צבע כהה. שטפו את השקופיות במים מזוקקים.
    12. מנגד את השקופיות במטאוקסילין במשך 10 שנות. שטוף את השקופיות במי ברז עבור 5 דקות.
    13. לשטוף את האלכוהול חומצה סופר מהיר בידול פתרון עבור 3 s. לאחר מכן לשטוף את מי ברז עבור 10 דקות.
    14. לטבול את השקופיות בשטף הבא ב RT: 80% אתנול עבור 5 דקות, 95% אתנול עבור 5 דקות, 100% אתנול עבור 5 דקות, ו קסילן עבור 15 דקות (2x). תקן את הכיסויים עם פתרון הרכבה. . שימו לב לרקמה מתחת למיקרוסקופ
      הערה: ראה תמונות מייצגות באיור 4ב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאים בעלי הצפק. שנאספו מנוזל ששטיפה של עכברים תאים הושעו מחדש ב 1 מ ל של RPMI-1640 בינוני מלא, שכבתית על שני צעדים (54.8%/70.2%) מעבר הדרגתי דחיסות רציפה (איור 1א), ו centrifuged ב 1,500 x g עבור 30 דקות. נויטרופילים (≥ 95%, ~ 1 x 107 נויטרופילים/עכבר) התגלו מהממשק התחתון (איור 1B).

ניסויים בפאוץ האוויר בוצעו כדי לחק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקולים מפורטים של מאוד מטוהרים נויטרופילים מ דם היקפי7, מח עצם ורקמות18 זמינים במשך זמן רב. כאן אנו לאמץ שיטה של בידוד נויטרופילים מתוך נוזל הצפק19 שבו נויטרופילים בוגרת להישאר מופעל עבור אנטי דלקתיות ומחקרים נוגדי חמצון נוספים.

השתמשנו בניסוי של נרתיק האוויר כדי לחקור את החדירה LPS המושרה של נויטרופילים ב vivo. שיטה זו הוצע כשיטה פוטנציאלית למדידת ישירות חדירת תאים בסביבה דלקתית כללית בvivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (הענקת מספרים 81430099 ו 31500704), שיתוף פעולה בינלאומי ופרויקטים Exchange (גרנט מספר 2014DFA32950), ואת תוכנית המחקר של אוניברסיטת בייג של הרפואה הסינית ( הענק מספרים BUCM-2019-JCRC006 ו 2019-איבב-TD013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1% תמיסה ירוקה מהירהSolarbio8348bמעבירים 20 מ"ג FCF מהיר בבקבוקון אחד לכוס אחרת של 100 מ"ל. מוסיפים 20 מ"ל של H2O לתוך הכוס וממיסים את הכתם על ידי ערבוב ליצירת תמיסה ירוקה מהירה של 0.1%, ומסננים אותו באמצעות מסנן Nalgene PES 75 מ"מ
0.1% Safranin O Staining SolutionSolarbio8348aמעבירים 20 מ"ג של כתם ספרנין O בבקבוקון אחד לכוס של 100 מ"ל. הוסף 20 מ"ל של H2O לתוך הכוס והמיס את הכתם על ידי ערבוב ליצירת תמיסת צביעה של 0.1% ספרנין O, וסנן אותו באמצעות מסנן Nalgene PES 75 מ"מ
0.5 M תמיסת חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), pH 8.0Sigma324506סטרילי
100% אתנולבייג'ינג עבודות
100% מתנולבייג'ינג עבודות
כימיותצינור צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי 15 מ"לפלקון14-959-53A
23 גרם x 1 1/4 אינץ' מחטBD305120
26 גרם x 3/8 אינץ' מחטBD305110
3% אלבומין בסרום בקר (BSA)ממיסים 0.3 גרם BSA ב-10 מ"ל PBS
3% H2O2מערבבים 1 מ"ל 30% H2O2 עם מתנול עם 9 מ"ל ערכת מתנול
3,3'-diaminobenzidine (DAB)ZSGB-BIOZLI-9018
30 גרם x 1/2 אינץ' מחטBD305106
30% H2O2Beijing Chemical Works
5 מ"ל מזרקBDZ683574
50 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטיפלקון14-432-22
50% תערובת אתנול500 מ"ל 100% אתנול עם 500 מ"ל dH2O
54.8% PercollMix 2.74 מ"ל SIP עם 2.26 מ"ל 1& פעמים; PBS, לעמוד במקום
70% אתנולמיקס 700 מ"ל 100% אתנול עם 300 מ"ל dH2O
70.2% פרקולמיקס 3.51 מ"ל SIP עם 1.49 מ"ל 1& פעמים; PBS, לעמוד בשקט
80% אתנולתערובת 800 מ"ל 100% אתנול עם 200 מ"ל dH2O
95% אתנולתערובת 950 מ"ל 100% אתנול עם 50 מ"ל dH2O
תמיסת התמיינות סופר מהירהBeyotimeC0165S
נוגדנים
נוגדנים נגד מיאלופרוקסידאז Abcamab208670
נוגדן אנטי נויטרופילים אלסטאזAbcamab21595
מנתח המטולוגיה אוטומטיSysmexXS-800i
אלבומין סרום בקר (BSA)VWR0332-100G
אדג'ובנט שלם של פרוינד, 10 מ"ג/מ"לסיגמא1002036152
כיסוי החלקהCITOGLAS10212432C
מד עובי חוגהMitutoyo7301
מיקרו-צינורות אפנדורף, 1.5 מ"לסיגמאZ606340
סרום בקר עוברי (FBS) פרימיוםPANP30-1302
מערכת הרדמת גזZS DichuangZS-MV-IV
עז נגד ארנב IgG H& L (HRP)PPLYGENC1309זהו הנוגדן המשני המשמש לצביעה האימונוהיסטוכימית.
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל02-016-1A
תמיסת צביעת המטוקסיליןZSGB-BIOZLI-9609
ליפופוליסכריד (LPS)סיגמאL3012
מדיה ותוספי תזונה
ספרנין שונה O-fast ירוק FCF ערכת כתמי סחוסSolarbioG1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)Sigma47729
תמיסת סטרפטומיצין פניצילין, 100&Invitrogen1514022
PercollGE Healthcare10245207צפיפות שיפוע בינוני
פרמביליזציה מאגרתערובת 100 μ L Triton X-100 עם 1 ליטר dH2O כדי לקבל 0.01% Triton X-100
Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&ערבבו 90% ddH2O עם 10% (אנכי/אנכי) 10&; PBS,
מי מלח בופר פוספט אוטוקלב (PBS), 10 פעמים;יש להמיס 16 גרם NaCl, 0.4 גרם KCl, 2.88 גרם Na2HPO4· 2H2O, 0.48 גרם KH2PO4 (נטול מים) ב-200 מ"ל ddH2O, התאם pH 7.4, אוטוקלאב
מוצרי פלסטיק וציוד
אבקת
Proteose PeptoneOxoid1865317
Retrieval Bufferמערבבים מאגר אחזור A של 18 מ"ל עם מאגר אחזור B של 82 מ"ל, מוסיפים dH2O ל-1000 מ"ל, מכוונים את ה-pH ל-6.0
מאגר אחזור מלאי A ל-IHCממיסים 4.2 גרם חומצת לימון (C6H5O7· H2O) ב-200 מ"ל dH2O
מלאי מאגר אחזור B ל-IHCלהמיס 5.88 גרם טריסודיום ציטראט דיהידראט (C6H5Na3O7· 2H20) ב-200 מ"ל dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758
RPMI-1640 מדיום RPMI-1640% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
Shu Rui U40 מחט הזרקת אינסולין סטרילית חד פעמית 1 מ"לBD328421
שקופיתCITOGLAS10127105P-G
פתרון
מלאי פרקול איזוטוני (SIP)מערבבים 90% (v/v) של פרקול עם 10% (v/v) 10& פעמים; PBS, לעמוד במקום למשך 20 דקות
מאגר כביסה בבדיקתלדלל 0.5M EDTA עד 10 מ"מ עם HBSS
XyleneBeijing Chemical Works
כימיות סטרילית מתווסף ל-10 שקית אוויר

מקורות

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745(2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309(2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330(2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579(2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נדידה של נויטרופיליםבדיקת שקיק אוויר (Air Pouch Assay)דלקת מפרקים מושרית באדג'ובנטצביעה אימונוהיסטוכימיתצביעת מילופרוקסידאזצביעת נויטרופיל אלסטאזכימותקסס של LPSבדיקת fMLPניתוח דלקת מפרקיםדירוג חומרת דלקת המפרקים
מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.