הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש באנלוגי פירימידין, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) עם סמני מחזור התא כדי לקבוע שלבי מחזור התא בפלטפורמת ציטומטריית מסה

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60556

⸱

22 באוקטובר 2021

 , 
1Ohio State Comprehensive Cancer Center, Division of Hematology, The Ohio State University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאים את מדידות מחזור התא לשימוש בפלטפורמת ציטומטריית מסה. עם היכולות מרובות הפרמטרים של ציטומטריית מסה, מדידה ישירה של שילוב יוד מאפשרת זיהוי תאים בפאזה S בעוד סמני מחזור תוך תאיים מאפשרים אפיון של כל מצב מחזור תא במגוון תנאי ניסוי.

תקציר

ויסות שלב מחזור התא הוא היבט חשוב של התפשטות התא והומאוסטזיס. שיבוש מנגנוני הבקרה השולטים במחזור התא הוא מאפיין של מספר מחלות, כולל סרטן. חקר מחזור התא מחייב את היכולת להגדיר את מספר התאים בכל חלק של התקדמות מחזור התא, כמו גם לתחום בבירור בין כל שלב במחזור התא. הופעתה של ציטומטריית מסה (MCM) מספקת פוטנציאל עצום לאנליזה של תא בודד בתפוקה גבוהה באמצעות מדידות ישירות של איזוטופים יסודיים, ופיתוח שיטה למדידת מצב מחזור התא על ידי MCM מרחיב עוד יותר את התועלת של MCM. כאן אנו מתארים שיטה המודדת ישירות 5-יודו-2′-דאוקסיורידין (IdU), בדומה ל-5-ברומו-2'-דאוקסיורידין (BrdU), במערכת MCM. השימוש ב-MCM מבוסס IdU זה מספק מספר יתרונות. ראשית, IdU משולב במהירות בדנ"א במהלך הסינתזה שלו, ומאפשר מדידה אמינה של תאים בשלב S עם דגירות קצרות של 10-15 דקות. שנית, IdU נמדד ללא צורך בנוגדנים משניים או צורך בפירוק DNA. שלישית, ניתן לשלב צביעת IdU בקלות עם מדידה של ציקלין B1, חלבון רטינובלסטומה פוספורילציה (pRb) והיסטון H3 פוספורילציה (pHH3), אשר ביחד מספקים תיחום ברור של חמשת שלבי מחזור התא. שילוב של סמני מחזור תאים אלה עם מספר הפרמטרים הגבוה האפשרי עם MCM מאפשר שילוב עם מדדים רבים אחרים.

מבוא

ציטומטריית מסה מאפשרת זיהוי של כ-40 פרמטרים תוך ניצול הרזולוציה הגבוהה והאופי הכמותי של ספקטרוסקופיית מסות. נוגדנים המסומנים במתכת משמשים במקום נוגדנים מצומדים פלואורופורים המאפשרים מספר גבוה יותר של ערוצים ומייצרים זליגה מינימלית 1,2. ל-MCM יתרונות וחסרונות ביחס לניתוח מחזור התא בהשוואה לציטומטריית זרימה. אחד היתרונות העיקריים של MCM הוא שמספר הפרמטרים הגדול מאפשר מדידה סימולטנית של מצב מחזור התא על פני מספר רב של סוגי תאי T אימונופנוטיפיים שונים בדגימות הטרוגניות מאוד. MCM שימש בהצלחה למדידת מצב מחזור התא במהלך המטופויזיס נורמלי במח עצםאנושי 3 ומודלים מורינים טרנסגניים של מחסור בטלומראז4. ניתוח מצב מחזור התא בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הראה כי מחזור התא מתואם עם תגובות ידועות לטיפולים קליניים, ומספק תובנה in vivo לגבי מאפיינים תפקודיים שיכולים לסייע בבחירת טיפול5. יתרון שני של ניתוח מחזור תא ציטומטרי מסה הוא היכולת למדוד מספר רב של סמנים פונקציונליים אחרים שעשויים להיות מתואמים עם מצב מחזור התא. עבודות אחרונות הצליחו לקשר בין סינתזת חלבונים ורנ"א לבין מצב מחזור התא באמצעות שימוש בנוגדנים מתויגים ב-IdU ובמתכת ל-BRU ול-rRNA6. סוג זה של ניתוח פרמטרי ביותר המודד את מצב מחזור התא על פני אוכלוסיות רבות ברצף של התמיינות יהיה כמעט בלתי אפשרי עם טכנולוגיית ציטומטריית הזרימה הנוכחית. החיסרון העיקרי של MCM הוא היעדר כתמי DNA או RNA דומים לאלה המשמשים בציטומטריית זרימה פלואורסצנטית (למשל, DAPI, Hoechst, Pyronin Y וכו '). צבעים פלואורסצנטיים יכולים לתת מדידות מדויקות יחסית של תכולת הדנ"א והרנ"א, אך דיוק זה אפשרי רק בשל השינויים בתכונות הפלואורסצנטיות של צבעים אלה המתרחשים באינטרקלציה בין בסיסי נוקלאוטידים. לפיכך, ניתוח MCM אינו מסוגל למדוד את תכולת הדנ"א או הרנ"א בדיוק דומה. במקום זאת, ניתוח מחזור תא ציטומטרי מסה מסתמך על מדידות של חלבונים הקשורים למצב מחזור התא כגון ציקלין B1, חלבון רטינובלסטומה פוספורילציה (pRb), והיסטון H3 פוספורילציה (pHH3) בשילוב עם מדידה ישירה של אטום היוד משילוב IdU בתאים בשלב S. שתי גישות מדידה אלה מניבות תוצאות דומות מאוד במהלך התרבות תאית רגילה, אך עלולות להיות צורמות כאשר התקדמות מחזור התא משתבשת.

מדידת מספר התאים בכל שלב במחזור התא חשובה להבנת התפתחות תקינה של מחזור התא, כמו גם הפרעה במחזור התא, אשר נצפתה בדרך כלל בסרטן ובמחלות אימונולוגיות. MCM מספק מדידה אמינה של גורמים חוץ-תאיים ותוך-תאיים באמצעות נוגדנים מתויגים מתכתית; עם זאת, מדידת פאזת S הייתה מוגבלת מכיוון שאינטרקלטור הדנ"א המבוסס על אירידיום לא היה מסוגל להבדיל בין דנ"א 2N לדנ"א 4N. על מנת להגדיר את שלבי מחזור התא, פיתח בהבהאני שיטה המשתמשת ב-IdU בעל מסה של 127, הנמצאת בטווח של ציטומטר המסה ומאפשרת מדידה ישירה של תאים בשלב S3. מדידה ישירה זו עוקפת את הצורך בנוגדנים משניים או בשימוש בחומרים דנטורינג DNA כגון חומצה או DNase. בשילוב עם סמני מחזור תוך תאיים, הוא מאפשר רזולוציה גבוהה של התפלגות מחזור התא במודלים ניסיוניים.

פרוטוקול זה מתאים מדידות מחזור תא מפרוטוקולי ציטומטריית זרימה נפוצים עבור MCM. השיטות שלנו מספקות דרך נוחה ופשוטה לכלול פרמטרים של מחזור התא. שילוב IdU של דגימות חוץ גופיות דורש רק 10 עד 15 דקות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, שהוא קצר יותר מרוב פרוטוקולי צביעת BrdU הממליצים על זמני דגירה של מספר שעות 3,7. ניתן לתקן דגימות משולבות של IdU ו- BrdU באמצעות מייצב פרוטאומי ולאחר מכן לאחסן אותן למשך זמן מה במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. הדבר מאפשר לאחסן מספר גדול של דגימות מוכתמות ב-IdU לצורך ניתוח אצווה ללא ירידה באיכות הדגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מניות IDU

  1. יש להמיס 5-יודו-2'-דאוקסיורידין (IdU) ב-DMSO לריכוז של 50 מילימול. מסנן סטרילי, aliquot לתוך צינורות 10-50 μL, ולאחסן ב -80 ° C
  2. מוציאים את IdU מהמקפיא ומפשירים בטמפרטורת החדר. לדלל IdU ב RPMI-1640 כדי ליצור פתרון עבודה בריכוז סופי של 1 mM. פיפטה למעלה ולמטה או מערבולת לערבב.
    1. בדרך כלל, לדלל את ה- IdU המרוכז למדיה שבה התאים מתורבתים (למשל DMEM, IMDM וכו ') או לדלל אותו ל- PBS להוספה ישירות לדגימות דם היקפיות או מח עצם. שלב טרום דילול זה מאפשר ערבוב של DMSO עם המדיה המימית של התאים המעניינים.
      הערה: הריכוז הסופי של IdU במהלך הדגירה צריך להיות 10 מיקרומטר; ניתן להוסיף תמיסה של 1 מ"ל ביחס של 10 מיקרוליטר לכל 1 מ"ל מדיה.

2. דגירה ושימור דגימות IdU

  1. יש לשמור דגימות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס. הוציאו את הדגימה מהאינקובטור והעבירו את הדגימה למכסה מנוע בטיחות ביולוגית.
  2. הוסף 10 μL של 1 mM IdU לכל 1 מ"ל של דגימה.
    1. לקבלת צלחת 6 בארות, הוסף 30 μL של 1 mM IdU ל 3 מ"ל של מדיה תרבותית בכל באר. ניתן להשתמש ב-IdU גם ישירות בשאיפה של מח עצם, כמו גם במחקרי מורין4.
  3. החזירו את הדגימה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. לשמור על התאים בתנאי הגידול האופטימליים המעניינים במהלך חשיפת IdU על מנת לקבל את המדידה המדויקת ביותר של שלב S.
  4. לאחר הדגירה של IdU, הסר את הדגימה והעבר לצינור חרוט.
  5. סובבו את הדגימה במהירות של 400 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לשאוף את supernatant ו resuspend ב 200 μL של PBS.
    1. במידת הצורך, בצעו בשלב זה כתם חי/מת (באמצעות ציספלטין) כדי לסמן תאים מתים לפני קיבוע והקפאה.
      הערה: צביעה חיה/מתה של רודיום אינה מתפקדת היטב לאחר חדירת מתנול, ולכן היא אינה מומלצת לשימוש בניתוחי מחזור התא.
  7. הוסף 18.75 μL של 16% paraformaldehyde (PFA) ל- PBS לקבלת ריכוז סופי של 1.5% PFA. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. סובבו את הדגימה כלפי מטה במהירות של 400 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. שאפו את תמיסת PBS/PFA והשהו מחדש את הדגימה ב-500 μL של מדיה לצביעת תאים (CSM; 1x PBS עם 0.5% BSA ו-0.02% נתרן אזיד) + 10% DMSO לפני ההקפאה.
    1. אם אתה משתמש במייצב פרוטאומי מסחרי, הוסף 280 μL של מייצב פרוטאומי לדגום מרחף מחדש ב 200 μL של PBS (1:1.4). יש לדגור על דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן להכניס ישירות לטמפרטורה של -80°C.
      הערה: הוכח כי IdU משתלב ביעילות בתוך דגירה של 10-15 דקות ב-37°C. דגירות IdU ארוכות יותר מ 10-15 דקות יפחיתו בהדרגה את הרזולוציה של אוכלוסיות פאזות S ו- G2, כאשר תאים המסומנים ב- IdU עוזבים את שלב S ומתקדמים לשלב G2 או M. ראינו גם כי דגירה ארוכת טווח עם IdU יכולה לגרום למוות תאים ולממצאים במחזור התא. עיבוד התאים וצביעת הנוגדנים לאחר שילוב IdU מספיקים כדי לשטוף שאריות IdU שלא שולבו בתאים בשלב S. לא ראינו רקע יוד משמעותי בעת שימוש בפרוטוקול in vitro המתואר כאן; עם זאת, לעתים רחוקות מאוד ראינו זיהום יוד בדגימות קליניות. זה עשוי להתרחש מהליכים רפואיים, כגון חומר ניגוד יוד בסריקת CT, או מתרופות המכילות יוד. במידה ונצפו כמויות גדולות של רקע IdU, אין להריץ את הדגימה כדי למנוע נזק לגלאי ציטומטר המסה.

3. צביעת דגימות לציטומטריה המונית

  1. הסר את הדגימות מ -80 ° C ולאפשר להפשיר לפני צביעת פני השטח.
    1. אם אתם משתמשים בשיטת הקיבוע SmartTube, הפשירו את הדגימות בטמפרטורה של 0-4°C כדי למנוע קיבוע נוסף ככל שהדגימות מתחממות.
  2. לאחר הפשרת הדגימות, העבירו כ-1-2 מיליון תאים לצינור FACS של 5 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את צינור FACS ב 600 x גרם במשך 5 דקות, ולמלא את צינור FACS עם מדיה צביעת תאים (CSM) כדי לשטוף את התאים. חזור על הפעולה פעם נוספת.
    1. אם ידוע שהתאים נדבקים זה לזה, הוסיפו 400 U/mL של הפרין לשטיפות CSM כדי למנוע מגע בין תא לתא, אך הדבר אינו הכרחי.
  4. לדגור על התאים עם סוכן חוסם FC, 5 μL של הסוכן לכל 100 μL של תאים, במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הכינו תערובת של נוגדנים שיכתימו את פני השטח, או החלק החוץ תאי, של התאים. תערובת הצביעה הכוללת תסתכם ב-100 מיקרוליטר ל-1-2 מיליון תאים בכל בדיקה. תערובת הצביעה תאזן בהתאם עם CSM והפרין בשפופרת הקוקטייל וה-FACS.
    הערה: הוספת CSM בשלב זה תפחית גם תוצרי צביעה לא ספציפיים8. תערובת צביעה זו תלויה לחלוטין במטרות מעניינות ופנוטיפ פני השטח (למשל, מחקר המערב תאי T ישתמש בתערובת פני השטח של CD45, CD3, CD4, CD8 וכו '). פרוטוקול מפורט של עיבוד דגימות וצביעה ניתן למצוא ב- Behbehani and McCarthy et al.9,10.
  6. מוסיפים את תערובת צביעת פני השטח לתאים ודגרים בטמפרטורת החדר תוך ניעור מתמשך במשך 30-60 דקות.
  7. לאחר הצביעה, מלא את צינור FACS עם CSM, וסובב כלפי מטה ב 600 x גרם במשך 5 דקות.
  8. שטפו פעמיים נוספות עם CSM, סובבו את הדגימה במהירות של 600 x גרם במשך 5 דקות ושאפו כל שטיפת CSM.
  9. תקן את הנוגדנים החוץ תאיים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS עם 10% CSM ו 1.5% PFA.
  10. מלא את שפופרת FACS המכילה את תערובת PBS/CSM/PFA ב- CSM. סובבו מטה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ושאפו את supernatant.
  11. מוסיפים מתנול ב -20 מעלות צלזיוס.
  12. מערבל את הדגימה במשך 1-2 דקות כדי להשיג השעיה של תא בודד וודא שכל גושי התאים הושעו מחדש.
  13. בעוד הדגימה מסתחררת לאט, הוסיפו במהירות 1 מ"ל מתנול קר כקרח באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר עם קצה מסנן.
  14. החזק את צינור ה- FACs לאור וודא שאין גושים נראים לעין; צפוי מעוננות. כל גושים יהפכו את הדגימה לבלתי שמישה לניתוח MCM עוקב.
  15. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של -20°C למשך 10-20 דקות.
  16. הכינו את תערובת הצביעה התוך-תאית במהלך תקופה זו. תערובת הצביעה התוך-תאית תהיה תלויה במטרות המעניינות. לניתוח מחזור התא, כלול CyclinB1, pRb, Ki67 ו- pHH3 בתערובת צביעה זו, אך ניתן להוסיף סמנים תוך-תאיים אחרים לפי הצורך.
  17. לאחר 10-20 דקות ב -20 ° C, להסיר את הדגימה, להוסיף 1.5 מ"ל של PBS ולמלא את השאר עם CSM.
  18. צנטריפוגו את הדגימה 600 x גרם במשך 5 דקות, ושאפו את הסופרנטנט.
  19. שטפו פעמיים נוספות עם CSM, סובבו את הדגימה ב-600 x גרם במשך 5 דקות ושאפו את הסופרנאטנט בכל פעם.
  20. לאחר שטיפת CSM האחרונה, צנטריפוגה את הדגימה ולהשאיר נפח שיורי של כ 50 μL.
  21. מוסיפים את תערובת הנוגדנים המוכנה (בדרך כלל מוסיפים 50 מיקרוליטר קוקטייל מכתים נוגדנים כדי להגיע לנפח צביעה סופי של 100 מיקרוליטר) לדגימה ודגרים על משטח ניעור במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  22. לאחר הצביעה להוסיף CSM וצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות.
  23. שאפו את ה-CSM, שטפו שוב עם CSM, הסתובבו ב-600 x גרם במשך 5 דקות, שאפו את ה-CSM, ואז הוסיפו PBS.
  24. לאחר השלמת הצביעה התוך-תאית מכניסים את התאים לתמיסת אינטרקלטור המקבעת את הנוגדנים לתאים ומכתימה את הדנ"א של כל תא כדי לאפשר זיהוי. תמיסת האינטרקלטור מכילה אינטרקלטור אירידיום טהור לא איזוטופי (pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine) שנוסף מתמיסת המלאי של היצרן בריכוז של 500 מיקרומטר. לדלל את מלאי האירידיום 1:4000 בתמיסה של PBS ו-1.5% PFA. הוסף את תמיסת אינטרקלטור אירידיום ב 100-200 μL למיליון תאים על מנת להכתים באופן שווה ולמנוע הכתמת יתר.
    הערה: האירידיום בתמיסת אינטרקלטור זו מיועד לזיהוי תאים לגידור סינגלט, אין להשתמש בו לכתמים חיים/מתים. אם רוצים כתמים חיים/מתים, יש לבצע אותם לפני הקיבוע, כפי שצוין לעיל ובמקארתי ואחרים.9.
  25. אחסנו את הדגימות בתמיסת אינטרקלטור במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים לפני רכישת הדגימה ב-CyTOF.

4. פעולת ציטומטר המוני

הערה: פעולת ציטומטריית מסה יכולה להיות ספציפית למכונה. תמיד מומלץ לבדוק את המדריך למשתמש של CyTOF לפני הפעולה. בנוסף, ישנם כיום שני מאמרים של JoVE העוסקים בהפעלה ותחזוקה של מכונות 9,11.

  1. בדוק את הנבולייזר עבור כל סתימות, סדקים, ואי סדרים אחרים לפני הפעלת ציטומטר המסה.
  2. חבר את הנבולייזר לציטומטר והתחל את הליך החימום. אין להפעיל את ציטומטר המסה ללא נבולייזר במקום.
  3. זרמו מים דרך קווי הדגימה ברגע שציטומטר המסה סיים להתחמם. תא ההתזה צריך להגיע לכ-200°C לפני ביצוע כוונון או ניתוח דגימה.
  4. מים זורמים במשך 5-10 דקות. לאחר 5-10 דקות, טען את פתרון הכוונון ובחר את מנהל הכוונון. פתרון הכוונון הוא תמיסה המכילה ריכוזים קבועים של מתכות ומשמשת לאופטימיזציה של ציטומטר המסה לפני רכישת הדגימה
  5. במנהל הכוונון, בחר תצוגה מקדימה לאחר שפתרון הכוונון הגיע לרשומת פגיעה במצב יציב כדי להתחיל בתהליך הכוונון האוטומטי.
  6. לאחר סיום הכוונון, טען את הדוגם במים ואפשר למים לזרום דרך קווי הדגימה במהלך עיבוד הדגימה. פרוטוקול מפורט לתפעול וכוונון ציטומטר יומי ניתן למצוא ב- Leipold11.
  7. לעיתים, הכוונון האוטומטי לא יתכוונן לביצועי מכונה מיטביים. חזור על הליך הכוונון כדי לתקן זאת.
  8. שטפו את הדגימה עם CSM פעם אחת ובמים טהורים שעברו דה-יוניזציה פעמיים לפני רכישת הדגימה. שטיפה במים חשובה כדי להסיר שאריות מלח מה-PBS/CSM.
  9. בדוק את הרגישות ואת זרימת הדגימה באמצעות חרוזי שיווי משקל שסופקו על ידי היצרן, חרוזי פוליסטירן עמוסים בריכוזי מתכת ידועים.
  10. שנה את מצב הרכישה מכוונון למצב לכידת אירועים. הגדר את מגבלת הזמן להפסקת הרכישה על 120 שניות. המתן 45 שניות לפני בחירת הקלט.
  11. הציטומטר ההמוני יפסיק את איסוף הדגימה באופן אוטומטי לאחר 120 שניות. השתמש במציג חלקת הגשם כדי לבדוק את עוצמת Eu151 ו- Eu153.
  12. יש לדלל חרוזי שיווי משקל במים טהורים שעברו דה-יוניזציה ביחס של 1:20.
  13. לפני רכישת הדגימה, בדוק את מנהל הניסוי. השתמש במנהל הניסוי כדי להקצות שמות לערוצים ולהוסיף ערוצים להקלטה.
    1. ודא שערוץ 127-I נוסף אם אתה משתמש ב- IdU.
    2. שים לב שחיוני להגדיר את ציטומטר המסה כדי למדוד את הפרמטרים הדרושים (למשל, IdU) לפני רכישת הדגימה. אם ערוצים לא נבחרו מראש, הנתונים לא ייאספו מכל ערוץ שלא נבחר ולא ניתן יהיה לשחזר אותם.
  14. לדלל את התאים לריכוז של כ 1-2 x 106/מ"ל באמצעות 1:20 מים טהורים deיוניזציה ותערובת חרוזים שיווי משקל. העבירו את התאים דרך צינור ה-FACS שבראשו המסנן כדי להסיר את שאריות הגושים.
  15. טען את הדגימה ושנה את זמן הרכישה.
  16. לחץ על תצוגה מקדימה והמתן להתייצבות ספירת האירועים לשנייה.
    1. אל תפעיל אירועים העולים על 400 אירועים בשנייה, זה יוביל לכמויות משמעותיות של כפילויות ופסולת. בדרך כלל אנו אוספים לפחות 20,000 עד 50,000 אירועים תאיים, אך המספר האופטימלי יהיה תלוי בתכנון הניסוי. צביעה של עד 2 מיליון תאים תניב בדרך כלל 300,000 עד 400,000 אירועים תאיים. שים לב שלא כל האירועים יהיו תאים (יהיו אירועי פסולת וחרוזים הכלולים בספירת האירועים).
  17. לאחר השלמת רכישת הדגימה לטעון פתרון שטיפה, להתחיל אינדוקציה דגימה לרוץ במשך 5-10 דקות. לאחר 5-10 דקות יש להפסיק את השראת הדגימה ולהזרים מים למשך 10-20 דקות. תמיסת שטיפה היא תמיסה חלשה של חומצה הידרופלואורית שנועדה להסיר מתכת שיורית מקווי הדגימה.
  18. כבה את ציטומטר המסה והסר את הנבולייזר. נבולייזר יהיה חם, לטפל במהלך הטיפול.

5. ניתוח נתונים

  1. על מנת להסיר חרוזים וגם לתקן עבור סחף אות במהלך רכישת דגימה, לנרמל את קבצי FCS באמצעות תוכנת Fluidigm או היישום שפותח על ידי Finck12.
  2. העלה את FCS ל- Cytobank או לתוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה אחרת. ניתן להשתמש בקבצי FCS בכל תוכנה תואמת, למטרות פרוטוקול זה כל gating וניתוח נוסף נעשה ב- Cytobank13.
  3. לפני שניתן לשרטט שערי מחזור תאים, להוציא כפילים או פסולת תאים מניתוח במורד הזרם, ניתן לעשות זאת באמצעות התרשים הדו-צדדי של אורך האירוע לעומת 191-Ir (איור 1a). התאים ייצרו אוכלוסייה מובחנת ובהירהבגובה רב שניתן להשתמש בה כדי להרחיק כפילים ופסולת. זהו שער הסינגלט. שיטת gating זו מסירה בדרך כלל כ- 50-60% מאירועי התא הכפול, כך שייתכן שיידרשו אסטרטגיות נוספות כדי להסיר את אירועי התא הכפול הנותרים.
    1. שנה את קנה המידה של אורך האירוע (מינימום ומקסימום) כדי לגרום לתאים להיראות בולטים יותר כדי לסייע בגידור סינגלט.
    2. הסר עוד כפילויות ופסולת באמצעות פרמטרים גאוסיאניים, שיוריים והיסט. שארית גבוהה יותר עם היסט נמוך יותר היא גם פסולת וכפילים, וגידור סביב אוכלוסייה זו יכול להסיר עוד יותר כפילים ופסולת (איור 1b,c).
  4. שלב S – שלב S הוא השער הקל ביותר לציור אך גם החשוב ביותר. צייר שער זה באמצעות חלקה דו-צדדית של IdU לעומת pRb, Ki67 או cyclinB1. תאי IdU+ בשלב S יוצרים אוכלוסייה נפרדת כאשר מסתכלים על החלקות הדו-צדדיות האלה (איור 2b).
  5. G0/G1-phase, G2/M-phase gating – קבע את שערי הפאזה G0/G1 ו-G2/M בחלקת IdU לעומת CyclinB1 והשימוש בשילוב IdU חיוני לקביעת הגבול בין שערי הפאזה G0/G1 ו-G2/M. שלב G0/G1 יהיה CyclinB1נמוך/IdU- ושלב G2/M יהיה CyclinB1גבוה/IdU-. צביעת CyclinB1 טובה תראה אוכלוסייה טבעית בין אוכלוסיות G0-G1 ו- G2-M; עם זאת, זה ישתנה בין דגימות וסוגי תאים בתנאי ניסוי. בתנאי ניסוי בהם התפלגות מחזור התא עשויה להיות מושפעת ויש פחות הפרדה בין שלב CyclinB1, G0/G1 ושלב G2/M, שימוש בפאזה S יאפשר gating עקבי עבור סוגי תאים מסוימים בכל ניסוי ספציפי. שיטה זו מפורטת להלן.
    1. התווה רק את התאים בשלב S ב- CyclinB1 לעומת IdU כדי לעזור לבסס את ההפרדה בין פאזת G0/G1 לשלב G2/M. ציירו שער על האוכלוסייההגבוהה CyclinB1 וכווננו עד שבערך 5% העליונים של אוכלוסיית שלב S יהיו בתוך השער (איור 2c). זה יוצר את נקודת השבירה בין שערי הפאזה G0/G1 ו-G2/M (איור 2e,f). האוכלוסייה הפעילה תשתנה לאוכלוסיית העניין והחלק המתגורר בתוך השער הקודם יהיה אוכלוסיית שלב G2/M ואילו השאר תהיה אוכלוסיית שלב G0/G1.
  6. G0-phase gating – קבע את שלב G0 בתרשים pRb לעומת IdU. שלב G0 ייוצג על ידי אוכלוסיית pRbנמוכה/IdU. אוכלוסיית רוכבי האופניים הפעילה תהיה בעלת ביטוי גבוה של שילוב pRb ו-IdU, ניתן לשרטט את שער שלב G0 על גבול זה כפי שהוא מתבטא בדרך כלל בשתי אוכלוסיות נפרדות (איור 2g,i).
    1. הגדירו את שלב G0 על-ידי הפיכת אוכלוסיית שלב ה-S שצוירה קודם לכן (איור 2b) לאוכלוסייה הפעילה וציור שער המשלב את 90-100% העליונים של האוכלוסייההגבוהה pRb. זוהי אוכלוסיית האופניים pRb+ (איור 2i), אוכלוסיית ה-pRbהנמוכה מחוץ לשער זה היא אוכלוסיית G0 (איור 2j).
    2. אם pRb אינו זמין או שאינו ניתן להקלטה, השתמש ב- Ki67 לעומת IdU כדי לבסס את אוכלוסיית שלב G0. ציור שער המייצג את רוב האוכלוסייה בשלב S ושימוש בשער זה כגבול עבור Ki67 לעומת IdU, שאר האוכלוסייה תהיה שלב G0 (איור 3a).
  7. גאטינג שלב M – קבע את שלב M בחלקה הדו-צדדית IdU לעומת pH3. שלב M מייצג חלק קטן מאוד של תאים, והוא מגודר על אוכלוסיית ה-pH3הגבוהה (איור 2d).
  8. שילוב IdU נכשל או לא היה אפשרי – אם IdU אינו זמין, הגדר מחזור תאים ולא מחזור שברים באמצעות Ki67 ו- pRb. Ki67 ו-pRb, בתנאים רגילים, יוצרים שתי אוכלוסיות נפרדות: Ki67 גבוה/pRbגבוה ו-Ki67 נמוך/pRbנמוך. האוכלוסייה החיובית הכפולה מייצגת את אוכלוסיית רוכבי האופניים הפעילה, בקורלציה עם G1-phase, S-phase, G2-phase ו-M-phase. האוכלוסייה הנמוכה הכפולה מייצגת את האוכלוסייה שאינה רוכבת אופניים, בקורלציה לשלב G0 (איור 3b).
    הערה: לא ניתן להגדיר כל שלב בנפרד באמצעות Ki67 לעומת pRb, אך ניתן לקבוע השפעות ניסיוניות על אוכלוסיות הרכיבה היחסיות / לא על אופניים.
  9. ניתוח מחזור התא – לאחר הקמת השערים, יצא את הערכים המספריים מהשערים לניתוח נוסף. את האחוזים בכל מחזור ניתן להשיג על ידי הפחתת האוכלוסיות הבודדות מהאוכלוסיות המשולבות. ניתן להחסיר את אחוז ה-G0-phase, המשורטט על ה-pRbהנמוךשל ה-IdUהנמוך, מ-G0/G1-phase, המשורטט על CyclinB1lowIdUneg, כדי למצוא את אחוז ה-G1-phase. באופן דומה, אחוז פאזות G2 נגזר מהחיסור של שער פאזת M משער פאזת G2/M. זה ייצור ערכים מספריים עבור כל שלב מחזור תא בודד; G0, G1, S, G2 ו-M. הערכים המספריים שנוצרו עבור כל שלב מחזור תא בודד יכולים לשמש לניתוח נוסף כגון גרפים וניתוח סטטיסטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות שימוש בתאי HL-60 ובשאיפת מח עצם אנושית ניתן להראות כיצד תנאי ניסוי יכולים להשפיע על התפלגות מחזור התא וניתוחו. ראשית, יש לבסס את אסטרטגיית ה-gating כדי להדגים כיצד נגזרים שלבי מחזור התא. באיור 1 אנו מראים את הקמתו של שער סינגלט, שהוא חשוב בהפרדת פסולת תאית וכפילים, ויוצר אוכלוסיית תא יחיד. עבור קווי תאים, שער סינגלט הוא כל מה שצריך כדי לעבור לניתוח מחזור התא (איור 2a). עבור דגימות אנושיות, אוכלוסיות אימונופנוטיפיות בדרך כלל צריכות להיקבע לפני ניתוח מחזור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדוגמאות המובאות כאן מדגימות כיצד להשתמש בפלטפורמת MCM כדי לנתח את התפלגות מחזור התא. כמו כן, הוכח כי ניתוח מחזור התא רגיש לתנאי ניסוי כגון זמן וטמפרטורה, וזהו שיקול חשוב שחוקרים חייבים לקחת כאשר הם שוקלים MCM עבור ניתוח מחזור התא שלהם14. דגימות שהושארו באחסון לפרק זמן קצר, לא יותר משעה, יהיו בעלות שילוב IdU דומה למצבן הרגיל. דגימות במערכת סגורה לפרקי זמן ארוכים, כשעתיים, יפחיתו את שילוב IDU, אולם השברים המחזוריים והלא מחזוריים היחסיים לא ישתנו ויאפשרו ניתוח מחזור תאים גס. אחסון קריוגני והפשרה לאח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ד"ר Behbehani מקבל תמיכה נסיעות מ Fluidigm. Fluidigm רכשה גם ריאגנטים וחומרים לשימוש במעבדה.

תודות

המחברים רוצים להודות למאמציהם של פאלאק סכרי, חוסאם אלח'לאיילה, הסיאוצ'י צ'אנג וג'סטין לייברגר על תמיכתם הניסיונית. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מלגות פלוטוניה (Pelotonia Fellowship Program). כל הדעות, הממצאים והמסקנות המובעים בחומר זה הם של המחבר(ים) ואינם משקפים בהכרח את אלה של תוכנית מלגות פלוטוניה".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין בסרום בקר (BSA)SigmaA3059רכיב של
צנטריפוגהThermo Scientific75-217-420צנטריפוגה לדוגמא
Cleaved-PARP (D214)BD BiosciencesF21-852זיהוי תאים אפופטוטיים
ציקלין B1BD BiosciencesGNS-1G2 רזולוציה
דימתילסולפוקסיד (DMSO)סיגמאD2650Cryopreservative
EQ ארבעה אלמנטים חרוזי כיולFluidigm201078תקן מתכת פנימי לביצועי CyTOF
צינור FACS עם מסננת רשתקורנינג08-771-23מסננת תאים להסרת גושים/פסולת לפני הפעלת CyTOF
סרום בקר עוברי (FBS)VWR97068-085תוסף צמיחת תרבית תאים
HeliosFluidigmCyTOF מערכת/פלטפורמה
HeparinSigmaH3393תוסף צביעה למניעת צביעה לא ספציפית
IdU (5-Iodo-2&-prime;-deoxyuridine)SigmaI7125משלב ב-S-phase
Ki-67eBiosciencesSolA15אישור של G0/G1
MaxPar Multi Label KitFluidigm201300ערכת תיוג מתכת, מחברת מתכות לנוגדנים
Microplate ShakerThermo Scientific88880023ערבוב דגימות במהלך צביעת
Paraformaldehyde (PFA)שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazineFluidigm201192זיהוי תאים במהלך רכישת CyTOF
p-H2AX (S139)MilliporeJBW301איתור נזק ל-DNA
p-HH3 (S28)BiolegendHTA28M-phase
רזולוציה פוספט חוצץ מלח (PBS)Gibco14190-144תמיסת שטיפה לתרבית תאים ורכיב של תמיסת קיבוע
p-Rb (S807/811)BD BiosciencesJ112906G0/G1 רזולוציה
מייצב פרוטאומיSmartTube IncPROT1מדגם קיבוע
RPMI 1640Gibco21870-076מדיום גידול תרבית תאים
נתרן אזידAcros OrganicsAC447810250רכיב של מאגר CSM/נוגדנים, ביוציד
CSM

מקורות

  1. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  2. Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
  3. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  4. Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).
  5. Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
  6. Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).
  7. Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
  8. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
  9. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).
  10. Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).
  12. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  13. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).
  14. Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
  15. Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
  16. Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).
  17. Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח מחזור התאסימון ב-IdUCyclin B1Rb מפוספורהיסטון H3 מפוספורציטומטריית זרימהניתוח תא בודדשגשוג תאים
שימוש באנלוגי פירימידין, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) עם סמני מחזור התא כדי לקבוע שלבי מחזור התא בפלטפורמת ציטומטריית מסה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.