קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

Transcript מייצג את הערכה המלאה של חומצה ריבונוקלאית (RNA) התעתיקים המבוטא על ידי הגנום של אורגניזם בזמן נתון ובתנאים סביבתיים וצמיחה מסוימים. כל תא יש החוצה הפרט שלו, אשר משקף הפיזיולוגית הנוכחית המצב המטבולית. אוסף של תאים שנגזר רקמה דומה או איבר משמש במחקר הטרנססקריפט טיפוסי, אבל תא בודד ו-spatially נפתר הטרנססקריפט מקבל הפופולרי¹. הניתוחים הטרנסקריפטאריים מתחילים בהפקת ה-RNA הכולל מרקמה שנבחרה בנקודת זמן מסוימת, ובתנאי גדילה מוגדרים. למטרה זו, אנו ממליצים על שימוש בשיטה שפותחה לאחרונה להפקת RNA הכולל מדגימות גבוהות של עמילן או תוכן סוכר, כגון זרעי דגנים². השוואת הטראנטוסקריפט בין דגימות שונות מביא לזיהוי מולקולות RNA עם שפע שונה. מולקולות RNA אלה נחשבות לגנים בעלי התבטאות מהותית (DEGs). השפע של התעתיקים נגזר גנים סמן ספציפיים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את הסטטוס ההתפתחותי או לקבוע את התגובה של אורגניזם לתנודות סביבתיות. גנים עם שינויים שאין לגילוי ב תעתיק שלהם על פני נקודות הזמן ההתפתחותיות תחת המחקר משמשות לעתים קרובות כהתייחסות או שירות הגנים.

RNA מזוהה בדרך כלל וככמת על-ידי שיטות שונות, כגון בלוק הצפון והיפוך כמותי התגובה שרשרת פולימראז (רביעיית-PCR), אבל שיטות התפוקה הגבוהה הנוכחי הטרנססקריפט מסתמכים בכבדות על הכלאה חומצות גרעין באמצעות טכנולוגיית microarray, כמו גם ברצף RNA (RNA-Seq). רנ א-Seq הוא מאוד פופולרי בהווה משום שהוא מספק מספר יתרונות עבור התפוקה הגבוהה העברת יישומים הטרנססקריפט כפי שנבדקו במקומות אחרים^3,4. למרות שטכנולוגיה ישנה יותר, ביטוי גנטי הפרופיל באמצעות שבבי microarray עדיין נמצא בשימוש נרחב משום שהיא טכנולוגיה מבוססת יותר, הדורשת פחות רקע בביואינפורמטיקה. בהשוואה ל-RNA-Seq, ערכות הנתונים שנוצרו מניסויי microarray קטנות וקל יותר לנתח. בנוסף, היא חסכונית יותר, במיוחד אם מתמודדים עם מספרים גדולים לדוגמה. במעבדה שלנו, אנו משתמשים באופן שוטף בניתוחי טראנסקריפט באמצעות טכנולוגיית microarray כדי לקבוע את התפקיד של מרכזי רגולציה מרכזיים השולטים על הרשתות המולקולריות ומסלולים המעורבים בצמיחה, פיתוח ומטבוליזם של דגנים^5,6,7,8,9. כמו כן, אנו משתמשים בו באופן שגרתי כדי לנהל את הגנום-wide ביטוי ליצירת פרופיל מחקרים כדי להשיג הבנה מכניסטית של התגובה של דגנים דגנים לחצים אביוטיים¹⁰, כמו גם בהתנהלות של האגודה הטרנססקריפט-רחב (מעשה) ואת מיפוי ההצמדה לזהות גנים האחראים איכות דגנים ותזונה^11,12 קבוצות אחרות השתמשו גם בטכנולוגיית microarray במתן ביטוי גן ספציפי לפיתוח אטלס בשעורה¹³,^{אורז 14,15,16}, דורה¹⁷, חיטה¹⁸.

מטרת פרסום זה היא לספק תקציר מילולי קצר ותיאור חזותי מפורט של השיטה שאנו מעסיקים כרגע במעבדה שלנו ליצירת פרופיל הטרנססקריפט של גרגרי הדגנים באמצעות פלטפורמת מיקרוarray של Agilent. שים לב כי פלטפורמות מיקרוarray אחרות זמינות, אך לא יהיו מכוסות בשיטה זו. אנו מתחילים את הפרוטוקול על ידי הצגת תיאור מפורט של הפקת RNA מפיתוח או מונטינג זרעי דגנים. בהתבסס על הניסיון שלנו, קבלת באיכות גבוהה וכמות גבוהה להמרה מוכן לניתוחים הטרנססקריפט במורד הדרך היא לעתים קרובות צוואר הבקבוק בעת שימוש ברקמות זרעי דגנים. ניסינו כמה ערכות החילוץ RNA מסחרית זמין, אבל אף אחד לא סיפק תוצאות משביעות רצון. מכאן, פיתחנו פרוטוקול החילוץ הכימי כדי לקבל תמצית RNA גולמי כי הוא נתון לטיהור טור באמצעות ערכה מסחרית זמין. באמצעות שיטה זו, אנו באופן שגרתי ובאופן שוטף לקבל באיכות גבוהה RNA² (איור 1), אשר יכול לשמש יישומים שונים במורד הזרם כדי ליצור פרופיל transcript.

1. סה כ הפקת וטיהור RNA

הערה: תמיד לעבוד תחת מכסה המנוע כמו שיטה זו כרוכה בשימוש של ממיסים אורגניים נדיפים מזיקים. לחמם את צינור microfuge של nuclease-מים ללא תשלום בשנת 50 ° c בלוק חום לפני תחילת הניסוי. זה מים ללא החכירה משמש כדי elute RNA הכולל מטור ספין בשלב 1.8.

1. הקרקע בנפרד את הדגימות, כל אחד עם לפחות שלושה משכפל ביולוגי, לתוך אבקה עדינה באמצעות מרגמה ומכתש מעוקר הנמצאים מקורר מראש בחנקן נוזלי.
   1. סקופ את הדגימות אבקה באמצעות מרית מתכת קטנה טבל בחנקן נוזלי ומניחים את הדגימות אבקה ב-2.0 mL nuclease microfuge שפופרות חינם, גם טרום טבל בחנקן נוזלי. מיד לאחסן את הדגימות ב-וזמן מקפיא טמפרטורה (-80 ° c) עד היום המוקצה להפקת RNA אצווה (נקודת עצירה).
      הערה: דגימות זרע יכול להיות הקרקע לאבקה יפה עם או בלי dehusking. עבור אורז, אנו לטחון באופן קבוע את הדגימות ללא dehusking כי הקליפה מכילה סיליקה שיכול לסייע במהלך תהליך הגריסה.
      התראה: שלב זה חייב להתבצע במהירות ובתנאים קריוגניים בלבד. אפשרות אחת עבור אוטומציה היא לטחון את הדגימות באמצעות טחנת הכדור קריוגני כדי למזער השפלה והידרדרות באיכות של RNA.
2. להשיג תמצית RNA גולמי באמצעות כ 200 מ"ג של המדגם אבקה המקורי. בנפרד להוסיף כל מדגם nuclease חינם microfuge tube המכיל 750 μL של מאגר החילוץ RNA (100 mM טריס, pH 8.0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1.5% SDS, 1.5% 2-mercaptoethanol) ו-500 μL של פנול: כלורופורם: isoamyl (25:24:1).
   1. מערבבים את כל הדגימות באותו זמן עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל מערבולת רב שפופרת להגדיר במהירות גבוהה. מיד לשמור את כל הצינורות על הקרח לשני דקות.
      התראה: תמיד לעבוד בתוך מכסה המנוע, במיוחד עבור כל השלבים הכרוכים פנול, כלורופורם וממיסים אורגניים אחרים. באופן אידיאלי, השתמש במנוע רחב שיכול להכיל אחד הצנטריפוגה שחקן ספסל, מערבל מערבולת, מערבל מערבולת מרובת שפופרת, ומערבל רוטרי מרובת שפופרת.
3. הפרד את התמצית RNA גולמי מן הפסולת על ידי צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 10 דקות. בצע את כל השלבים הצנטריפוגה באותן הגדרות עבור מקטע זה.
   1. העברה כ 800 μL של סופרנאטאנט לצינור חדש 2.0 mL microfuge המכיל 400 μL של 1.2 M הנאל ו-700 μL של איזופנול. ערבב את הפתרון בעדינות על-ידי היפוך 5x.
   2. מזרז את ה-RNA על ידי הדגירה במקפיא רגיל (-20 ° c) או וזמן מקפיא טמפרטורה (-80 ° c), עבור לפחות 1 h (או לילה).
      עצור או נקודת השהיה: פשוט לשמור את הדגימות ב רגיל-20 ° c מקפיא להשהות למשך כמה שעות. עבור לילה או נקודת עצירה ארוכה, לאחסן את הדגימות במקפיא בטמפרטורה וזמן (-80 ° c).
4. לקבל גלולה גסה RNA על ידי צנטריפוגה ב 18,800 x g עבור 15 דקות. לאחר השלכת supernatant, לטהר את הגלולה הגולמי RNA על ידי טיהור טור באמצעות מיני קיט (טבלת חומרים).
   1. לפזר את הגלולה ב טרי מוכן 450 μL של מאגר RLT (לפני השימוש, להוסיף 100 μL של β-mercaptoethanol לכל 100 mL של מאגר RLT, מוכן טרי יומי). לשפר את הפירוק של כל כדורי על ידי ערבוב כל הצינורות בטמפרטורת החדר במיקסר מערבולת מרובת שפופרת לפחות 5 דקות.
5. לטהר את כריות ה-RNA המומסים על ידי העברת הטור הסגול מיני ספין עם שפופרת אוסף mL 2. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות ב 9,000 x g ולמחוק את העמודה מיני ספין סגול.
   1. הוסף 0.5 נפח של אתנול מוחלט (~ 225 μL) אל הליפוסט הנקי בצינור הגבייה 2 mL. מערבבים את הפתרון באמצעות אותו תיאור פלסטיק על ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים.
6. לאסוף את ה-RNA מטוהרים על ידי העברת הפתרון לעמודת מיני ספין ורודה עם שפופרת אוסף mL 2. צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 15 s כדי לאסוף את RNA על ממברנה סיליקה של הטור הוורוד מינימום ספין. להיפטר לזרום דרך לשטוף את RNA עם 350 μL של מאגר RW1 על ידי צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 15 s.
7. הסרת ה-DNA מזהם גנומית על ידי הוספת 80 μL של DNase מדולל 1 (50 μL של מלאי קפוא DNase + 350 μL של RDD באמצעות ערכת DNase) ישירות על הקרום ולעכל על ידי הדגירה בטמפרטורת החדר עבור לפחות 15 דקות (נקודת הפסקה).
   1. לשטוף את DNase 1 על ידי הוספת 350 μL של RW1 ו מסתחרר ב 9,000 x g עבור 15 s. חזרה פעמיים, אבל הפעם לשטוף עם 500 μl של מאגר rpe. העבר לצינור אוסף חדש של 2 מ"ל ו ספין ב 9,000 x g עבור 2 דקות לייבוש.
8. העבר את עמודת הספין המיובשים לשפופרת אוסף חדשה של 1.5 mL. התחל את תהליך החילוץ עבור תמצית ה-RNA מטוהרים על ידי הוספת 50 μL של nuclease-מים ללא תשלום (prewarmed ב 50 ° c) ו דגירה עבור 3 דקות ב 50 בלוק החום ° c.
   1. לאחר הדגירה, elute את תמצית ה-RNA הכולל על ידי תפרידו ב 9,000 x g עבור 1 דקות. למקם מיד את כל הדגימות על הקרח.
9. לקבוע את הכמות והאיכות של התמצית RNA הכולל על ידי הפעלת מדלל המתאים (בדרך כלל 1:10) ב ננוdrop ו BioAnalyzer באמצעות פרוטוקולי היצרן שלהם. תמציות RNA צריך לפחות ערך RIN של 8.0 וריכוז של 50 ng/μL. איור 1 מראה תוצאה אופיינית עבור תמציות RNA שהתקבלו מעלה שעורה וזרעים.
   נקודת עצירה: אחסן את הדגימות ב-80 ° צ' עד השימוש.

2. הסינתזה של cDNA ולאחריה תמלול והתוויות של cRNA

הערה: שלב זה מתאים לעיבוד 24 דגימות בו. הוא הציע כי השלב כולו מתנהל ברציפות ביום אחד, אבל נקודות עצירה אופציונלי והפסקה מזוהים. הקפידו לחמם מראש שלושה גושי חום microfuge שפופרת ב80 ° c, 65 ° c, ו-37 ° c לפני תחילת השלבים הבאים. הגדרות אלה בטמפרטורה ישתנו כמצוין בשלבים שלהלן. לדוגמה, בלוק החום 37 ° צ' יהיה מוגדר ל-40 ° c לאחר שערבוב הדקר מוכן (או אם הוא כבר הוכן בעבר). להכין אחד צבע מיקס ספייק, T7 יזם לערבב ו cDNA לערבב הורים באמצעות קלט נמוך מהיר Amp ביטוי גן תיוג קיט (ראה טבלת חומרים) מבוסס על הוראות היצרן. הכנה זו תלויה בכמות של הפעלת תמציות RNA, אשר בדרך כלל נע בין 10 כדי 200 ng עבור RNA הכולל או 5 ng עבור PolyA RNA. אנו משתמשים באופן שגרתי ב-50 ng כ-RNA כחומר מתחיל עבור היברידיזציה של microarray² ועבור השיטה שתהיה מתוארת להלן. בהכנת תערובת אב ל -24 דגימות, הוסף 2 תגובות נוספות לחשבון עבור וריאציות ליטוף. תמיד להשתמש nuclease חינם צינורות microfuge ו nuclease ללא מים בשלב זה.

1. בשל תשואה גבוהה, בדרך כלל לדלל את ה-RNA לחלץ 100-קיפול כדי להתאים בתוך הטווח 50-100 ng. בהתבסס על התוצאות של ה-RNA כימות בשלב 1.9, לבצע דילול 1:100 על ידי הוספת 1 μL של מטוהרים לחלץ RNA כדי 99 μL של nuclease-מים ללא תשלום 1.5 בצינור microfuge mL. לקבוע את הריכוז בפועל של דילול זה באמצעות ננו-טיפה.
   1. להפוך את הדילול השני של כל מדגם RNA סך של 1.5 mL microfuge שפופרת לעשות 50 ng של RNA סה כ בנפח הסופי של 1.5 μL. שמור את כל הדגימות על קרח.
2. הכן את מיקס הדקר מבוסס על הוראות היצרן. שלב זה מסוכם גם ב-Pü, et al. 2019². השתמש בבלוק חום של 37 ° c בשביל זה. לאחסן את הדילול הראשון והשני של בצבע אחד לערבב בקרות חיוביות במקפיא טמפרטורה וזמן (-80 ° c) ולעבור רק שמונה מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרות ונשנות.
   1. הכינו את הדילול השלישי והרביעי מדי יום. להפשיר ולאחסן את הדילול השלישי והרביעי של מיקס ספייק על הקרח לפני השימוש.
      הערה: המירו את טמפרטורת בלוק החום 37 ° c ל-40 ° c כאשר מיקס הדקר היה מוכן (או אם היה מוכן בעבר).
3. הכן את T7 יזם לערבב ולאחסן על הקרח לפני השימוש. להלן מספיק עבור 24 דגימות:
   20.8 μL של T7 פריימר יזם
   + 26.0 μL של nuclease-מים ללא תשלום
   = 46.8 μL של אמצעי אחסון T7 מערבבים יזם
4. הוסף 1.8 μL של T7 יזם פריימר מיקס (שלב 2.3) לתוך כל צינור microfuge המכיל 1.5 μL של 50 מדגם RNA משלב 2.1. לערבב את הרכיבים כראוי על ידי ליטוף כמה פעמים. הספרות של ה-RNA תבנית-פריימר לערבב על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס בלוק חום עבור 10 דקות. מיד למקם את הצינורות microfuge על הקרח לקראת השלב הבא.
5. בזמן הצגת ערבוב תבנית-פריימר (שלב 2.4), מראש לחמם את מאגר הסטרנד הראשון 5x ב 80 ° c עבור לפחות 4 דקות. במהירות להכין את הסינתזה cDNA לערבב את התבנית מהירה מערכת התוויות קלט נמוך (ראה טבלת חומרים) מבוסס על הוראות היצרן. להלן מספיק עבור 24 תגובות:
   52.0 μL של מאגר הסטרנד הראשון מחומם לפני 5x (שלב 2.5)
   + 26.0 μL של 0.1 M DTT
   + 13.0 μL של שילוב של 10 מ"מ dNTP
   + 31.2 μL של מיקס לבלוק של RNase
   = 122.2 μL של נפח כולל cDNA סינתזה מאסטר מיקס
   1. הפשרת כל רכיב על הקרח. מערבבים כל אחד מהרכיבים בעזרת מלטף עדין. שמרו את המיקס הראשי בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      התראה: יש למקם מיד את מיקס הבלוק RNase במקפיא של 20 ° c לאחר השימוש.
6. הסר את התמהיל של תבנית ה-RNA לערבוב על הקרח (שלב 2.4) וצנטריפוגה בקצרה בטמפרטורת החדר כדי לסובב את כל התוכן אל החלק התחתון של צינור microfuge. לוותר 4.7 μL של מיקס מאסטר cDNA (שלב 2.5) לכל צינור, ערבוב בזהירות על ידי ליטוף למעלה ולמטה. אמצעי האחסון הכולל כאשר כל הרכיבים נוספים צריכים להיות 8.0 μL.
   1. לסנתז cDNA עבור 2 h ב 40 מעלות צלזיוס בלוק חום. במהלך הדגירה 2 h, להעביר את הטמפרטורה של 65 בלוק החום ° c כדי 70 ° צ' לקראת הפעלת החום (שלב 2.7).
      נקודת השהיה אופציונלית: אחסן את הדגימות ב-80 ° c בלילה. ניתן להמשיך את הניסוי למחרת לאחר הפעלת החום (שלב 2.7).
7. דגירה כל צינור ב 70 מעלות צלזיוס בלוק חום עבור 15 דקות לחום-להשבית את מיקס בלוק RNase. להעביר את הצינורות על הקרח מיד ו הדגירה עבור לפחות 5 דקות.
8. בעוד הדגימות הן על הקרח עבור 5 דקות (שלב 2.7), במהירות להכין את שעתוק לערבב הורים. ניתן לשלב את כל הרכיבים בטמפרטורת החדר, אך להפשיר רכיבים על הקרח. להלן מספיק עבור 24 דגימות:
   19.5 μL של nuclease-מים ללא תשלום
   + 83.2 μL של מאגר תמלול של 5x
   + 15.6 μL של 0.1 M DTT
   + 26.0 μL של שילוב NTP
   + 5.5 μL של T7 RNA פולימראז
   + 6.2 μL של Cyanine 3-CTP (Cy3)
   = 156.0 μL של כמות מלאה של שעתוק מיקס
   התראה: T7 RNA פולימראז יש לשמור במקפיא של 20 ° c וממוקם לאחור מיד לאחר השימוש. יתר על כן, Cy3 הוא רגיש באור. מכאן, ערבוב (שלב 2.9) וחילוק (שלב 2.10) צריך להיעשות בתנאי תאורה נמוכה. בשביל זה, אנחנו בד כ מדליקים אור. ישירות מעל ספסל המעבדה
9. כמו הצינורות היו חשופים חימום פתאומי וקירור (שלב 2.7), בקצרה לסובב את התוכן של כל מדגם באמצעות מיקרוצנטריפוגה לאסוף את כל הנוזל בתחתית כל microfuge tube. הוסף 6 μL של תמלול מיקס (שלב 2.8) על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה. הנפח הכולל של התגובה הזאת צריך להיות 16 μL בשלב זה. מודטה את הצינורות ב 40 ° צ' עבור 2 h כדי להפיק את cRNA Cy3 התווית.
   נקודת עצירה אופציונלית: הצינורות ניתן לאחסן ב-80 ° c לאחר שעתוק.
10. בעת יצירת cRNA (שלב 2.9), הגדר את הטמפרטורה של בלוק החום ל-55 ° c. הוסיפו לפחות שפופרת microfuge אחת של nuclease-מים ללא תשלום בבלוק החום. המים האלה ללא השכירות ישמשו עבור הימנעות cRNA מטוהרים.
11. לאחר תמלול ותיוג cRNA, לטהר את cRNA מתויג באמצעות מיני ערכת RNeasy כמפורט בשלב 3.

3. לטיהור הקרונה

1. לטהר את cRNA מתויג באמצעות מיני קיט RNeasy (ראה טבלת חומרים). הכן את המאגרים בהתאם להוראות היצרן. לדוגמה, מאגר RPE מסופק בערכה בצורה מרוכזת. לפני השימוש, להוסיף 4 כמויות של אתנול מולקולרי כיתה ביולוגיה מוחלטים (96-100%).
2. הוסף 84 μL של nuclease-מים חינם לכל מדגם כדי לכוונן את אמצעי האחסון הכולל ל 100 μL. ואז להוסיף 350 μL של מאגר RLT ו 250 μL של אתנול מוחלט לכל צינור. מערבבים ביסודיות על ידי ליטוף.
3. העבר 700 μL של כל תערובת על העמודה מיני ספין עם צינור האוסף 2 mL. לאסוף את cRNA המסומנת על הקרום על ידי צנטריפוגה ב 4 ° צ' עבור 30 s ב 7,534 x g. להשליך את נוזל הזרימה.
4. שטוף כל דוגמה ב-500 μL של מאגר RPE. צנטריפוגה ולמחוק זרימה-דרך כמו בשלב הקודם. חזור על שלב זה פעם אחת ולאחר מכן עבור לשלב הבא.
5. העבר את עמודת הטווח המצומצם לתוך צינור אוסף חדש. יבש את הדגימות על ידי צנטריפוגה כמו בשלב 3.3.
6. העבר את העמודה מיני ספין לתוך שפופרת nuclease חינם 1.5 mL המסופק עם הערכה. Elute כל מדגם cRNA מתויג על ידי הוספת 30 μL של nuclease-מים ללא תשלום (טרום מחומם ב 55 ° c) ישירות לתוך מסנן קרום. לשפר את המנוע על ידי הדגירה ב 55 מעלות צלזיוס בלוק חום עבור 60 s.
7. לאסוף את cRNA המסומנת על ידי צנטריפוגה בטמפרטורת החדר עבור 30 s ב 7,535 x g. למחוק את עמודת הספין ולסגור כל צינור microfuge. מניחים מיד כל צינור על הקרח.
   נקודת עצירה אופציונלית: ניתן לאחסן את הדגימות ב--80 ° c לאחר הימנעות.
8. לכמת את cRNA עם ננוdrop באמצעות התכונה microarray. הגדר את הדוגמה ל-RNA-40. להשיג את הערכים הבאים והרשומה בגיליון אלקטרוני: cyanine 3 הריכוז צבען (pmol/μL), היחס לספיגת RNA (260 nm/280 nm), ו cRNA ריכוז (ng/μL).
   נקודת עצירה: אחסן מיד את דגימות cRNA ב-80 ° צ' לאחר הקריאה.
9. חשב את התשואה של cRNA ואת הפעילות הספציפית כמפורט בתוך Pü, et al. 2019².

4. הכלאה וסריקה מיקרוarray

הערה: שלב זה לוקח רק 3-4 h ומכאן הכלאה של 24 דגימות ניתן להתחיל לאחר ארוחת הצהריים. מפעיל אחד יכול להפעיל בנוחות עד 4 שקופיות (32 דגימות). הבוקר של היום הבא מוקצה לכביסה וסריקה של שקופיות microarray. ניתן לבצע הקפות נוספות בשעות אחר הצהריים של היום השני. שלב זה חוזר על עצמו עד שכל הדגימות מהוכלא ונסרקות. מומלץ מאוד להשתמש ללא צבע, אבקת לייטקס כפפות לטיפול ועיבוד השקופיות כדי להבטיח כי הדגימות אינם מזוהמים עם פיגמנטים צבעוניים שיכולים להפריע ניתוח microarray. , מלבד מיקרומערכים פנויים מסחרית מערכים מותאמים אישית הבאים תוכננו על ידי הקבוצה שלנו וזמינים עבור הזמנה מ Agilent: סדר קוד 028827 עבור שעורה (Hordeumvulgare), 054269 עבור אורז (Oryzasativa צוללות. יפנית), 054270 עבור אורז (כתוביותOryzasativa ) ו 048923 עבור חיטה (triticumavum).

1. בצע היברידיזציה של המיקרו-מערך באמצעות ערכת הכלאה ביטוי גנטית (ראה טבלת חומרים). הכנת סוכן חסימת 10 x על פי מפרט היצרן². מחלק את הסוכן חוסם 10x לתוך 200 מנות μL ולאחסן ב-20 ° צ' עד השימוש. כל סדרת מחלקים מספיק עד 40 ימינליות והוא יציב עד 2 חודשים.
2. ביום שהוקצה עבור היברידיזציה microarray, הפשרת 1 200 μl סדרת מחלקים של הסוכן חסימת 10x על קרח. בנוסף, לחמם מראש את התנור הכלאה ל 65 ° c ולחמם מראש בלוק חום ל 60 ° c לשימוש במהלך הפיצול cRNA.
3. הכינו את מיקס הפיצול לכל דוגמה כפי שמתואר על ידי היצרן². במעבדה שלנו, אנו משתמשים באופן שגרתי 600 ng של cRNA ליניארי מוגבר Cy3-הכלאה עבור היברידיזציה ב-microarray 8-pack. במקרה זה, הרשימה הבאה מסכמת את הרכיבים של מיקס הפיצול לכל מדגם:
   600 ng של cRNA מוגבר ליניארי, cyanine 3-התווית
   + 5 μL של סוכן חסימת 10x
   כוונן את אמצעי האחסון ל-24 μL עם מים ללא שכירות
   + 1 μL של מאגר פיצול של 25x
   = 25 μL של שילוב מוחלט של פיצול אמצעי האחסון
   1. דגימות לערבב בעדינות באמצעות מערבל מערבולת. סובב את כל הדגימות בקצרה. בעזרת מיקרוצנטריפוגה
4. מודטה את כל הדגימות בבלוק החום 60 ° c בדיוק 30 דקות. מגניב מיד כל צינור על הקרח עבור דקה אחת ואז במהירות להמשיך לשלב הבא.
5. כדי לעצור באופן מלא את תגובת הפיצול, להוסיף 2x GEx מאגר הכלאה HI-RPM לכל צינור. מערבבים בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה, לוקח טיפול גדול לא להציג בועות כלשהן במהלך ערבוב. אנו משתמשים באופן שגרתי 25 μL של מאגר היברידיזציה כדי להפסיק את תגובת הפיצול עבור פורמט מיקרוarray 8-pack.
6. צנטריפוגה את כל הצינורות עבור 1 דקות ב 15,750 x g בטמפרטורת חדר הסביבה. במהירות למקם את כל הצינורות על הקרח ולטעון כל מדגם מהר ככל האפשר.
7. לפני שעזב את המעבדה עבור הדגירה 17 h לילה, להכין את ההרכבה הכלאה² כמפורט בווידאו.
   1. צעד קריטי: העברת כל תערובת היברידיזציה לוותר לאט במרכז של כל אטם היטב, התבוננות בזהירות רבה לא להציג בועות כלשהן במהלך מחלק. אנו משתמשים באופן שגרתי 44 μL של תערובת היברידיזציה עבור תבנית מיקרוarray 8-pack. כמו כן, מקום 44 μL של מאגר הכלאה של 1x בבארות שאינן בשימוש.
   2. הכנס מיד את שקופית המיקרו-מערך עם כיוון נכון על גבי שקופית האטם. זה צריך להיעשות בזהירות רבה כדי לא לשפוך כל נוזל. סגור את הרכבת היברידיזציה בחוזקה וסובב אותו כדי לבדוק אם לא הוצגו בועות אוויר קבוע. כל הבועות צריך להיות נע בתוך השקופית gasket.
8. שימי את הרכבת הכלאה בחדר. בתוך מסובבי התנור הכלאה אם נעשה שימוש במאגר הכלאה של 2x GEx, הגדר את מהירות הסיבוב ל-10 סל ד והhybridize ב-65 ° c בדיוק 17 שעות.
9. שטוף הוכלא מיקרו-מערכים באמצעות ערכת מאגר שטיפת הגנים (ראה טבלת חומרים). הכינו את הביטוי הגנטי מאגרי כביסה 1 ו-2 על בסיס הוראות היצרן². הוסף 2 מ ל של 10% טריטון X-102 לשני המאגרים (אופציונלי לחלוטין אך מומלץ מאוד להפחית את השכיחות של ממצאים לשטוף microarray)².
10. הכן שלושה מכלולים בחדר הכביסה כמפורט בפרסום הקודם². פרטים על כל חדר כביסה ממוקם למטה (שולחן 1).
11. 500 mL של מאגר לשטוף 1 בבקבוק 1 L מגיב ולעזוב בטמפרטורת חדר הסביבה. הכינו בקבוק ותווית נוספים של L 1 ליטר באמצעות האפשרות "כביסה 1 שימוש חוזר במאגר" כדי לשמור את מאגר הכביסה מהתא הראשון. בנוסף, סדרת מחלקים 500 mL של שטיפת מאגר 2 בבקבוק מגיב ומודטה ב 37 באמבט מים מעלות צלזיוס לילה.
    הערה: אל תעזבו את המעבדה בלי להכין את הצעדים 4.9 עד 4.11. הם נחוצים לקראת שלבי הכביסה למחרת.
12. ביום שלמחרת, הכן את מאגרי הכביסה כמפורט בטבלה 2. ממלאים כל מנה עד שלושה רבעים של המאגר המקביל שלהם. כל מאגר כביסה טוב עד 4-5 שקופיות.
13. לאחר בדיוק 17 h של היברידיזציה, לקבל תא הכלאה אחד ולפרק על הספסל במעבדה מרופדת נייר נטול סיבים כפי שמפורט בפרסום הקודם².
    1. צעד קריטי: להעביר את הסנדוויץ מיקרוarray למנה 1. ודא שברקוד של המיקרו-מערך פונה למעלה במיקום משופע, והימנע מהמיזוג של השקופית כולה במאגר. טפל בכל שקופית מיקרוarray מקצותיו והימנע מלגעת בצד הפעיל של השקופית.
    2. הפרד את שתי שקופיות הזכוכית. בעזרת מלקחיים² הנח לשקופית האטם לרדת בעדינות לתוך החלק התחתון של מנה 1, ואילו באותו זמן לוודא ששקופית microarray מוחזקת בחוזקה לשלב הבא.
14. שלב קריטי: הרם לאט את שקופיות המיקרו-מערך והעבר אותו מיד לארון התקשורת המיקרו-מערך במנה 2 כמפורט בפרסום הקודם². קריטי שהשקופיות המיקרו-מערך חשופות לאוויר.
    1. חזור על שלבים 4.13 ו-4.14 עד ששמונה השקופיות נמצאות בארון התקשורת. פזר את שקופיות המיקרו-מערך לאורך המדף. ניתן לבצע שלב זה באמצעות אופרטור אחד שאינו מסייע עד 4 שקופיות. חברו את מחזיק הארון והעבירו את כיוונון המנה כולו לתחילת התהליך המגנטי הראשון. מערבבים בעדינות למשך 1 דקות בדיוק.
15. תוך כדי ערבוב עבור 1 דקות (שלב 4.14), להעביר את הצלחת 3 מתוך החממה מיני 37 ° c ומקום על גבי שטירר המגנטי השני. בעדינות המקום לשטוף מאגר 2 (מתוך 37 מים ° c) על צלחת 3. למנוע היווצרות בועה בעת שפיכת.
    1. לאחר 1 דקות ערבוב נעשה (שלב 4.14), בעדינות ובאיטיות להרים את מתלה השקופית ממנה 2 ולהעביר למנה 3. הסר את מחזיק הארון ומערבבים בדיוק 1 דקות.
16. הרם לאט ובעדינות את מתלה השקופיות ממנה 3. הקפד להימנע היווצרות של טיפות מאגר². נגב את הצדדים של כל שקופית על-ידי נגיעה עדינה בנייר נטול סיבים. מקם כל שקופית עם כתמי אבן בתיבת שקופית וחזור על שלב 4.16 עד שכל שקופיות המיקרו-מערך נמצאות בתיבת השקופיות. יבש במשך כ 15 דקות.
    נקודת עצירה אופציונלית
17. מקם כל שקופית מיקרוarray במחזיק שקופיות, וודא שברקוד פונה כלפי מעלה.
    הערה: רמות האוזון בתוך החדר microarray צריך להיות 50 ppb (100 μg/m³) או פחות. זה אופציונלי אך מומלץ ביותר: השתמש בכיסוי מכשול האוזון כדי למנוע השפלה הנגרמת מפני האוזון של צבעים cyanine.
18. הצב את מחזיקי השקופיות התאספו. בקרוסלה הסורקת טען את הדגימות ברצף, בהתבסס על מספר ברקוד. סרוק את השקופיות באופן מיידי באמצעות סורק מיקרוarray (ראה טבלת חומרים), כפי שמפורט בפרסום הקודם².
19. לאחר ההפעלה, הנושא את הנתונים כתכונה של חילוץ ואימות QC, כפי שמפורט בפרסום הקודם².

שיטה זו ממוטבת להפקת דגימות זרעי דגנים המכילות כמויות משמעותיות של עמילן או סוכרים מזהם. הוא נועד לחלץ RNA סך של 24 דגימות זרעים ליום. זה צריך להתבצע ברציפות ביום אחד, אבל נקודות עצירה אופציונלי והפסקה מזוהים במהלך הפרוטוקול. לחילופין, הקורא יכול להשתמש שלהם ערכות החילוץ המועדף RNA או שיטת החילוץ כימית ידנית. עם זאת, בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו, הצמח זמין מסחרית ערכות החילוץ RNA לא מתאים לזרעים בשל כמויות משמעותיות של עמילן, חלבונים, סוכר ו/או זיהום השומנים. בשיטה המתוארת, הוצאה כימית של רנ א גולמי היא אחריה טיהור טור באמצעות ערכת החילוץ RNA מסחרי. זה בדרך כלל מספק RNA עם איכות גבוהה יותר ותשואה. איור 1 מציג את התוצאה של הפעלת bioanalyzer כדי לבדוק את האיכות של הפקת RNA באמצעות השיטה המתוארת כאן. התוצאות מוצגות לעלה שעורה (דוגמאות 1 ו-2 המייצגות דגימות תוכן של עמילן נמוך) וזרעי שעורה (דגימות 3 ו-4 המייצגים דגימות תוכן של עמילן גבוה). ערך שלמות ה-RNA (RIN) עבור כל הדגימות הוא 10.

איור 1 מראה ג'ל מייצג של תמצית RNA מטוהרים, שם האיכות נבדקה באמצעות bioanalyzer. דגימות 1 ו-2 הן תוצאות אופייניות לדגימות תוכן של עמילן נמוך כגון עלי שעורה, כאשר להקות rRNA נוספות מהכללוסיקות מופיעות בבירור. דגימות 3 ו-4 הן תוצאות מייצגות לדגימות גבוהה עמילן התוכן כגון זרעי שעורה, מציג 18S ו-28S rRNA. אנא שימו לב כי לא ניתן לחשב את ערך RIN האוטומטי עבור רקמות צמחים ירוקות כגון דגימות עלה, בשל rRNA האחרון. עם זאת, היושרה והאיכות הגבוהה יכולים להיות מתוברר באופן חזותי על-ידי העדר מוצרי השפלה, המופיעים בדרך כלל ככתם מולקולרי נמוך. ערך RIN לדגימות הזרעים של העמילן הגבוה כגון זרעי שעורה הוא בדרך כלל 10 באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה.

בנוסף, אנו מציגים כאן גם נתונים מייצגים של ניסוי מסלול הזמן של שתי שעורה העילית של השעורה (sofiara ו ויקטוריה) משמש לניתוח של איכות מרטיבים19. במהלך תהליך ההמלט, העמילן מומר לסוכר. לכן, הדגימות מייצגות רקמות במידות שונות של עמילן ותכולת הסוכר. כאשר תהליך המלט התעשייתי דומה לתהליך הנביטה, נותחו משני קווי שעורה, שונים באיכותם המלבתם. RNAs נלקחו זרעים מונגטינג ב 2, 24, 48, 72, 120, 144 ו 196 h לאחר שתיית במהלך טריפליטים ביולוגיים. הכנת ה-RNA והכלאה של שבב מיקרוarray השעורה המותאם אישית בוצעו כמתואר לעיל. איור 2 מציין את הרשת המנורמלת שנקראה מתוך הכלאה של המיקרו-מערך הניתנים בדוח בקרת האיכות (איור 3) ומתווה ההיסטוגרמה עבור אותות שזוהו. הרשת מעניקה דוגמה של אותות נגזרים מכל פינה של השבב, כולל רקע וספייק-in לקרוא נקודות המשמשות כיול. ההיסטוגרמה מציינת את הסטייה של נקודות הזיהוי עם עוצמות האות המתאימות. הכלאה מוצלחת נותן עקומת גאוסיאנית רחבה עם החוצה מינור בלבד כפי שמוצג באיור. ימינליות שנכשלו יכול לגרום לתזוזה חזקה לקראת צד אחד ("מפלצות ירוקות").

לבסוף, תוצאה מייצגת של הערכים המקובלים מוצגת בטור 4 מתוך איור 3. כדי לציין את המהימנות של הניסויים שבוצעו, התוצאות מוערכות עוד יותר באמצעות תוכנת גנספרינג. הנתונים שנאספו מוצגים כניתוח רכיבים ראשיים (PCA). PCA משלבת את הערכים של נקודות נבחרות (גנים) כמו וקטור. מספר הנקודות המוערכות בהן נעשה שימוש יכול להשתנות ממספר מאות לשבב כולו והוא תלוי בתוכנה שבשימוש. כל שבב (מדגם) יוצר ערך אחד (וקטור) שנבע מעוצמות האות המשולבות של הנקודות שנותחו. לכן, המיקום היחסי בגרף (PCA) מציין את הדמיון בין הדגימות זה לזה. , ככל שדגימות מתקרבות. כך הן דומות יותר משכפל טכני צריך להיות קרוב יותר מאשר אלה ביולוגיים, ומשכפל ביולוגי של מדגם צריך לקבץ קרוב יותר יחד, מאשר דגימות מנקודות זמן שונות, רקמות או תנאים.

איור 1: הקובץ האלקטרופורזה בניתוח מתקבל לאחר בדיקת האיכות של RNA עם Bioanalyzer. דגימות 1 ו-2 הם רקמת עלה שעורה כפי שמצוין על ידי להקות ריבוזומתיים נוספות של כלורלופור. דגימות 3 ו-4 הם שעורה רקמת זרע עם 18S ו 28 rRNA להקות המוצג. גורם מרין אינו מחושב תמיד עבור רקמות ירוקות כגון עלה אבל על פי ג'ל, איכות ה-RNA הוא טוב מאוד. ערך רין לדגימות 3 ו-4 הוא 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מערכת QC מצליחה מהכלאה של מיקרושעורה מוצלחת. A + מציין אותות שאותרו על הרשת מכל הפינות של השבב. ההיסטוגרמה מציגה את מספר האותות המסווגים לפי עוצמת אות (פלואורסצנטית) כלוגריתם לאחר חיסור רקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סיכום בקרת איכות (QC) לאחר הכלאה וסריקה. הערכים עבור שקופית הוכלא ניתנים בעמודה 2 (ערך) וטווח הערכים המקובלים מוצג בעמודה 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שולחן 1: הכנת מכלולים בחדר הכביסה.

שולחן 2: הטמפרטורה הדגירה והזמן לשטוף הרכבות קאמרית.

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.