ב Vivo זיהום עם לישמניה מלכותית כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הידור כדי להעריך את הזיהום עורית של עכברים עם לישמניה אמזונואנסיס. זוהי שיטה אמינה למחקר והתקפה של טפיל, המאפשרת מבט מערכתי של התגובה המארחת בעלי החוליות לזיהום.

תקציר

לישמניה spp. הם פרזיזומין טפילים שגורמות leishmaniases, מחלות הקיימות ספקטרום רחב של ביטויים קליניים מן עורית לנגעים בקרביים. כיום, 12,000,000 אנשים מוערכים להידבק לישמניה ברחבי העולם ומעל 1,000,000,000 אנשים חיים בסיכון של זיהום. לישמניה אמזונואנסיס היא אנדמיים במרכז ובדרום אמריקה ובדרך כלל מובילה לצורה העורית של המחלה, אשר ניתן לדמיין ישירות במודל של בעל חיים. לכן, הזנים L. אמזונואנסיס הם מודלים טובים עבור לימודי עור לישמניה משום שהם גם מעובדים בקלות בתוך מבחנה. C57BL/6 עכברים לחקות את ה- L. אמזונאנסיסמונחה התקדמות המחלה נצפתה בבני אדם נחשבים לאחד מדגם העכברים הטובים ביותר של זנים עבור לישמנית עורית. ב המארח בעלי החוליות, טפילים אלה לאכלס מקרופאגים למרות מנגנוני ההגנה של תאים אלה. מספר מחקרים להשתמש מקרופאג מחוץ לגופית הזיהום בחני להעריך את הטפיל הנגועים בתנאים שונים. עם זאת, הגישה החוץ-גופית מוגבלת למערכת תא מבודדת המתעלמת מתגובת האורגניזם. כאן, אנו לקמפל בשיטה זיהום vivo murine המספקת סקירה פיזיולוגית מערכתית של אינטראקציה מארח-טפיל. הפרוטוקול המפורט של זיהום vivo של C57BL/6 עכברים עם L. אמזונואנסיס כולל בידול טפיל לתוך amastigotes, עכברים הרגליים footpad, התפתחות נגעים, ונחישות עומס טפיל. אנו מציעים זו שיטה מבוססת היטב כשיטה הנאותה ביותר עבור מחקרים פיסיולוגיים של המערכת החיסונית מטבולית התגובות לישמניה עורית.

מבוא

Leishmaniases הם ברחבי העולם מחלות זיהומיות טפיליות המייצגים אתגרים חשובים במדינות מתפתחות מזוהים כאחד המחלות הטרופיות החשובים ביותר מוזנחים על ידי ארגון הבריאות העולמי^1,2. הleishmaniases מאופיינים בביטויים של עורית, מיוקורסל ו/או הקרביים. לישמניאזיס העורית נגרמת בדרך כלל על ידי L. אמזונואנסיס, ל' מקסיאנה, ל. braziliensis, ל. גויאנאנסיס, ל' מייג, ל' טרופיקה ו -L. אתיופיקה³. צורה זו של המחלה היא לעתים קרובות ריפוי עצמי בבני אדם בשל אינדוקציה של תגובה חיסונית המגן הסלולר. עם זאת, התגובה החיסונית הסלולר עלול להיכשל, ואת המחלה י....

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש במכון הביומדע של אוניברסיטת סאו פאולו (CEUA 342/2019), ונערכו בהתאם להמלצות ולמדיניות הטיפול והשימוש בחיות מעבדה של סאו פאולו המדינה (ליי Est, 11.977, de 25/08/2005) ו הממשלה הברזילאית (ליי הפדרלי 11.794, de 08/10/2008) כל השלבים המתוארים בסעיפים 1-5 צריכים להתבצע בתוך ארונות זרימה למינארי. ציוד הגנה אישי צריך להיות מנוצל תוך התמודדות עם לישמניה לחיות טפילים.

1. בבידול חוץ גופית של L. אמזונואנסיס פרוסטיטיס לתוך האקסון^15,20,35,36

תוצאות

לישמניה פרוטוזומין טפילים קיימים בשתי צורות התפתחותיות במהלך מחזור החיים שלהם חסרי חוליות מארחים בעלי חוליות: promastigotes, צורות מתרבים למצוא לומן של זבוב הנקבה; והאמסטיגוטים, הצורות המתרבים שנמצאו בחללים הפרזיטאטיים של תאי המארחים היונקים. Promastigotes יש גוף מוארך של כ 1.5 יקרומטר רוחב ו 20 יקרומטר ארוך, עם שכאלילום המתעוררים בדרך כלל מן הגפיים הקדמי. Amastigotes יש גוף מעוגל או דמוי החל בגודל מ 2-6 יקרומטר אורך ו 1.5-3 יקרומטר ברוחב, ובעלי הדגל בלתי נראה^12.......

דיון

הvivo הזיהום המתואר בפרוטוקול זה מאפשר לכל חוקר להעריך vivo עורית לישמניתבהתחשב האינטראקציה המארחת טפיל בתרחיש מערכתי. השיטות הללו שימשו על ידי קבוצות רבות^{22,24,27,29,31,32,34,49} וכאן הערכנו פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לתקנן שיטה זו תוך התחשבות במגבלות התשתית .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 96 בארות	Greiner bio-ne	655180	צלחת תחתונה שטוחה להגבלת בדיקת דילול
אדנין	סיגמא	A8626	תוסף נוסף לקליפר מדיה של תרבית תאים M199
	Mitutoyo	700-118-20	קליפר למדידת עובי
בקבוק תרבית תאים	קורנינג	353014	בקבוק תרבית תאים בנפח 25 ס"מ2 לגידול
צנטריפוגת	Eppendorf	5804R	ציוד המשמש להפרדת דגימות על סמך צפיפותו
CO2 incubator 34 & deg; C	Thermo Scientific	3110	אינקובטור לאמסטיגוטים התמיינות
אתנול	Merck	K50237083820	חומר חיטוי לפריטים כלליים
סרום בקר עוברי	Gibco	12657-029	תוסף נוסף לצינור מטחנת רקמות זכוכית M199
	תומס סיינטיפיק	3431 E04	צינור לאיסוף ושיבוש רקמת
כרית כף הרגל הנגועהתוסף גלוקוז		Synth G1008.01.AH	נוסף למדיית תרבית תאים M199
		GraphPad Prism	תוכנה המשמשת להתוויית הנתונים ולחישוב מובהקות סטטיסטית
תוסף hemin	Sigma	H-2250	נוסף למדיה של תרבית תאים M199
תוסף HEPES	Promega	H5303	נוסף לחממת מדיה של תרבית תאים M199
25 ° C	Fanem	347CD	אינקובטור לגידול פרומסטיגוטים
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	TMS	ציוד המשמש לניתוח חזותי של תרביות פרומסטיגוט ואמסטיגוט
איזופלורן			הרדמה נדיף לעכברים (3-5%)
ארון זרימה למינרית	Veco	VLFS-09	ארון בטיחות ביולוגית המשמש לאזור עבודה אספטי
תא M199 אמצעי תרבית	Gibco	31100-035	אמצעי תרבית תאים לגידול לישמניה
צינור מיקרו-צנטריפוגה	Axygen	MCT150C	מיקרו-צינור המשמש לאיסוף דגימות, עיבוד ואחסון
פיפטה רב-שאנלית	Labsystems	F61978	פיפטה רב-ערוצית המשמשת להגבלת בדיקת דילול
NaHCO3	Merck	6329	תוסף נוסף למדיית תרבית תאים M199
NaOH	Sigma	S8045	תוסף נוסף למדיית תרבית תאים M199
תא נויבאואר HBG		2266	המוציטומטר לספירת מתלה הטפיל
מיקרוסקופ אופטי	Nikon	E200	ציוד אופטי המשמש לספירת פרפילים
	טפיל Bemis	349	פלסטיק גמיש ועמיד לאיטום צלחת
פניצילין/סטרפטומיצין	תוסף גיבקו	15140122	נוסף למדיית תרבית תאים M199
צלחות פטרי	TPP	93100	צלחת סטרילית לניתוח ערכת פיפטמן רקמת כרית כף הרגל
	גילסון	F167360	ערכת מיקרופיפטה המכילה ארבעה פיפטורים (P2 P20 P200 P1000)
בקנה מידה	Quimis	BG2000	ציוד המשמש לשקילת כרית כף הרגל שנאספה אזמל נגעים
	Solidor	10237580026	אזמל לחיתוך ואיסוף רקמת כרית כף הרגל
פיפטה סרולוגית 10 מ"ל	Nest	327001	פיפטה סטרילית המשמשת להעברת נפחי מיליליטר קצות
	Axygen		קצה פיפטה המשמש להעברת נפחי מיקרוליטר
Trypan blue	Gibco	15250-061	צבע המשמש לספירת טפילים ברי קיימא
טריפטיקאז פפטון	תוסף Merck		נוסף למזרק טוברקולין מדיה תרבית תאים M199
	BD	305945	מזרק עם מחט 27G לחיסון תרחיף הטפיל

של כרית כף הרגל טפיל לישמניה, תוכנת חומר