מאמר שיטה

זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

DOI:

10.3791/60652

⸱

21 בדצמבר 2019

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Research Fellow of Japan Society for the Promotion of Science

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה להקרנה אנטי צהבת B סוכנים ויראליים לעכב את האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת שיטת. מערכת זו מאפשרת זיהוי קל של אינטראקציות חלבון-חלבון והיא מתאימה לזיהוי מעכבי של אינטראקציות כאלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש צורך דחוף סוכנים טיפוליים חדשניים עבור צהבת B וירוס (HBV) זיהום. למרות שהנוקלאונוס הזמינים כרגע (t) מעכבים שכפול ויראלי, אין להם השפעה ישירה על הביטוי של חלבונים ויראליות ששועתק מתוך דנ א ויראלי סגור DNA עגול (cccDNA). כמו לטעון אנטיגן ויראלי גבוהה עשוי לשחק תפקיד זה כרונית ו-HBV הקשורים קרצינובגנזה, המטרה של הטיפול HBV היא לבער חלבונים ויראלי. החלבון HBV התקינה X (HBx) נקשר ל-DNA מארח נזק מחייב חלבון 1 (DDB1) חלבון כדי לבזות תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), וכתוצאה מכך הפעלת תמלול ויראלי מ cccDNA. כאן, באמצעות מפוצל לוציפראז מערכת שיטת הטיפול, אנו מציגים מערכת מקיפה הקרנת מתחם כדי לזהות מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1. הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי קל של הדינמיקה ההדדית בזמן אמת בתוך תאים חיים. טכניקה זו עשויה להפוך להיות מפתח מרכזי כדי לגלות סוכנים טיפוליים חדשניים לטיפול בזיהום HBV.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צהבת B וירוס (HBV) זיהום הוא בריאות הציבור העיקרי הדאגה ברחבי העולם, עם הערכות שנתיות של 240,000,000 אנשים באופן כרוני נגוע HBV ו 90,000 מקרי מוות עקב סיבוכים מן הזיהום, כולל שחמת וקרצינומה hepatocellular (HCC)1. למרות שהסוכנים הטיפוליים הנוכחיים אנטי-HBV, הנוקלאואים (t) ide, מעכבים מספיק שעתוק ויראלי, הם לרוב משיגים את חיסול החלבונים הנגידיים, שהיא המטרה הקלינית ארוכת הטווח. ההשפעה הירודה שלהם על חיסול חלבון נגיפי נובע היעדר השפעה ישירה על תמלול ויראלי מ epiזומביים ויראלי סגור DNA מעגלי (cccDNA) מיני כרומוזומי בגרעין hepatocyte2.

תמלול HBV מופעל ע י חלבון התקינה HBV X (HBx)3. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי HBx מוחלק תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), גורם הגבלה מארח כי חוסם hbv תמלול מ cccdna, באמצעות חטיפת DDB1-CUL4-ROC1 E3 אוביקוויב ליגאז קומפלקס4,5,6. לכן, צעד מכריע בקידום תמלול ויראלי מ-cccDNA נחשב לאינטראקציה HBx-DDB1. תרכובות מסוגלות לעכב את הכריכה בין HBx ו-DDB1 עשוי לחסום תמלול ויראלי, ואכן nitazoxanide זוהה כמדכא של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות מערכת הקרנה שפותחה במעבדה שלנו7.

כאן, אנו מציגים את מערכת ההקרנה הנוחה שלנו משמש לזיהוי מעכבי של HBx-DDB1 אינטראקציה, אשר משתמשת מפוצל לוציפראאז שיטה משלימה7,8. פיצול יחידות משנה מפוצל ל HBx ו DDB1, ואת האינטראקציה HBx-DDB1 מביא את תת היחידות לתוך קרוב ליצור אנזים פונקציונלי שמייצר אות זורח בהיר. כאשר האינטראקציה בין תת היחידות היא הפיכה, מערכת זו יכולה לזהות במהירות HBx-DDB1 חלבונים (איור 1). באמצעות מערכת זו, ספריית מתחם גדול ניתן להקרנה בקלות, אשר עשוי לגרום לגילוי של תרכובות הרומן מסוגל לעכב ביעילות את HBx-DDB1 אינטראקציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ייצוג סכמטי של שיטת הפיצול לוציפראז מוצג באיור 1A, ותהליך העיבוד מתואר באיור 1ב. ניתן למדוד את הדינמיקה ההדדית בזמן אמת ללא האפשרות לפירוק תאים.

1. הכנה לתא

  1. לשמור על התאים הHEK293T תרבותי ב בינונית הנשר שונה ביותר של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% v/v העובר סרום (FBS), 1x פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° c בתוך 20% O2 ו 5% CO2.
  2. זרע 5 x 106 תאים לתוך צלחת 100 מ"מ עם 10 מ ל של dmem ו-מודטה ב 37 ° c לילה.
  3. Transfect 1 μg של HBx ו DDB1 עם פיצול לוציטיות לתוך התאים בהתאם לשיטה הבאה.
    הערה: כמות העירוי של הדנ א הפלסטי עשויה להיות תלויה בעוצר החצייה שבשימוש. המיקום האופטימלי של מפוצל לוציפראז התמזגו חלבון היעד חייב להיקבע מראש. במקרה זה, HBx התמזגו lgbit ב C-הטרמינוס של HBx (HBx-lgbit) ו DDB1 התמזגו smbit ב-הטרמינוס של DDB1 (smbit-DDB1) סיפק את התוצאות הטובות ביותר (כלומר, אותות ללוציפראז המבריקים ביותר). תהליך זה דווח בעבר בפירוט7.
    1. לדלל 1 μg של HBx-LgBit ביטוי ה-DNA פלאמיד 1 μg של SmBit-DDB1 ביטוי ה-DNA פלמיד (טבלת חומרים) ב-dna עיבוי מאגר (טבלת חומרים) לנפח הכולל של 300 μl.
    2. הוסף 16 μL של פתרון שיפור (טבלת חומרים) ולערבב על ידי vortexing עבור 1 s.
    3. מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות.
    4. הוסף 60 μL של העברת מגיב (טבלת חומרים) למדגם ולערבב על ידי vortexing עבור 10 s.
    5. מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 8 דקות.
    6. במהלך הדגירה, מטפי את המדיום התרבותי ממנה (מוכן בשלב 1.2), ומכבסת תאים עם 5 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). הוצא את PBS על ידי שאיפה והוסף 7 מ ל של DMEM.
    7. הוסיפו 3 מ ג של DMEM לצינור המכיל את מכלולי החצייה. מערבבים באמצעות ליטוף ומוסיפים את מכלולי ההעברה אל התא בצלחת 10 ס מ.
  4. דגירה את התאים ב 37 ° c בחממה תחת 5% CO2 עבור 10 h.
  5. Reseed את התאים לתוך צלחת לבן 96 לוחית בגודל 5 x 104 תאים/גם ב 50 μl של בינוני/טוב בהתאם לשיטה הבאה.
    1. הסר את המדיום של תרבות התא שהושקע ושטוף תאים עם 5 מ ל של PBS.
    2. הסר את ה-PBS על ידי השאיפה, להוסיף 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA, ו מודחלת ב 37 ° c עבור 5 דקות לנתק תאים.
    3. הוסף 4 מ ל של DMEM ופזר את המדיום על ידי ליטוף מעל פני השטח של שכבת התא מספר פעמים. . העבר את ההשעיה של התא לשפופרת
    4. בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. . והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מ ל של PBS
    6. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהיפטר supernatant.
    7. לדלל את הגלולה תא עם התרבות התא באגירה בינונית (טבלה של חומרים) שיושלם עם 10% fbs לצפיפות הזריעה של 1.0 x 106 תאים/mL.
    8. פיפטה 50 μL של תא הבולם לתוך כל באר של 96 צלחת הבאר ולהחזיר את התאים לחממה.
  6. התאים הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2 עבור 10 h.

2. הקרנה מורכבת

  1. במהלך הדגירה, לדלל את תרכובות ההקרנה (טבלת חומרים) ו ממס (diמתיל סולפוקסיד [dmso]) בריכוז 13.5 x. לדוגמה, אם המניה היא 10 מ"מ והריכוז ההקרנה הוא 10 μM, להוסיף 1 μL של פתרון מניות כדי 73.1 μL של התרבות התא באגירה בינונית.
  2. הוסף 12.5 μL של המצע זורח (טבלה של חומרים) על כל טוב ומארג עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: כפקדים שליליים, הבארות בשני קצות הצלחת (כלומר, עמודות 1 ו-12) לא אמורות להכיל מצע לא זורח.
  3. למדוד את האור הבסיסי באמצעות לומימטר (טבלת חומרים).
  4. מיד לאחר המדידה הראשונית, להוסיף 5 μL של תרכובות ושליטה DMSO מדולל בשלב 2.1 לכל הבאר.
    הערה: הריכוז הסופי יהיה 10 μm.
  5. מדידת ערכי האור כל 30 דקות עבור 2 h.
    הערה: הצלחת להיות מודקת בחושך בטמפרטורת החדר.
  6. לחשב את אפקטי העכבות על-ידי השוואה עם טיפול DMSO בקרה לאחר נורמליזציה לאותות בסיסיים.
    הערה: הקרנתכל תרכובת בכפולה או בטרילקאט עלולה להפחית את הווריאציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות הנציג בעקבות השימוש בפרוטוקול זה מוצגות באיור 2א, ב. היחס בין האות לרקע היה גדול מ-80 ו-Z פקטור9 (מדד האיכות של הזהב להקרנה בתפוקה גבוהה) היה גדול מ-0.5, והצביע על כך שמערכת שיטה זו הייתה מקובלת עבור הקרנת תפוקה גבוהה. עם הסף שנקבע ל-> 40% עיכוב לעומת הפקד (DMSO בלבד), זיהינו nitazoxanide בתור סם מועמד7. באמצעות מערכת זו, סמים מועמדים טובים יותר ניתן למצוא על ידי הקרנת ספריות אחרות, גד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו שיטת הקרנה נוחה באמצעות מפוצל לוציפראז למצוא מעכבי HBx-DDB1 קשירה. הדינמיקה אינטראקציה ניתן לזהות בזמן אמת בתאי החיים ללא צורך בפירוק תאים. עיכוב של HBx-DDB1 אינטראקציה מוביל שחזור של Smc5/6, אשר גורמת לדיכוי של תמלול ויראלי, ביטוי חלבון, ו cccDNA ייצור7. זה מנגנון הרומן של פעולה אנטי ויראליות יכול להתגבר על מחדלים של טיפולים HBV הנוכחי.

למרות שמספר שיטות זמינות לחקירת אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתאי החיים, בחינת האינטראקציות הללו נותרות קשות10...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים בסיוע ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן (#19H03430 ו#17K09405 לשיטת הפעולה, ו #19J11829 ל K.S.), על ידי גרנט-in-Aid עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים (#18H05024 לשיטת הפעולה), על ידי תוכנית מחקר על הפטיטיס מן הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח, (כדי שיטת פעולה, #JP19fk021005), על ידי תוכנית על פיתוח חדשני ויישום של תרופות חדשות עבור צהבת B (#JP19fk0310102 K.K.) מ-, על ידי הקרן היפנית עבור אנזיולוגיה שימושית ומקרן קוביאשי לחקר הסרטן (כדי שיטת פעולה), על ידי יפן GSK מחקר מענק 2018 (כדי K.S.), ועל ידי מענק מן הקרן מייקאווה מחקר הזיכרון (כדי K.S.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרו-צלחת תרבית תאים, 96 בארות, PS, F-BOTTOMGreiner-Bio-One GmbH655098
DMEMSigma AldrichD6046
DMSOTocris Bioscience3176
מגיב טרנספקציה אפקטןQiagen301425כולל מאגר עיבוי DNA, תמיסת משפר ומגיב טרנספקציה
FBSNichirei
GloMax 96 מיקרופלייט לומינומטרPromegaE6521
HBx– LgBit מבטא DNA פלסמידהמעבדהזמינה על פי בקשה
HEK293T תאיםאוסף תרבית מסוג אמריקאיCRL-11268
NanoBiT PPI מערכות התחלהPromegaN2015כולל Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021מתואר כ"מדיום תרבית תאים חוצץ" בכתב היד
PBSTakaraT900
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא אולדריץ'P0781
ספריית תרופות שאושרה על ידי ה-FDA V2 גרסה 1.0Enzo Life SciencesBML-2841התרכובות ששימשו כאן היו כדלקמן: מקינול, מרקפטופורין הידרט, מסנה, מסטרנול, מטפרוטרנול המיסולפט, מטארמינול ביטרטרט, מטקסלון, מתכולין כלוריד, מתאזולמיד, מתנאמין היפוראט, מתוקרבמול, מטוטרקסט, מתוקסלן, מתסקופולמין ברומיד, מתסוקסימיד, מתיקלוטיאזיד, מתיל אמינולוולינט ומידוט; HCl, מתילרגונובין מלאט, מטולזון, מטירפון, מקסילטין ומידוט; HCl, micafungin, miconazole, midodrine· HCl, מיגליטול, מילנאציפרן ומידוט; HCl, מירטזאפין, מיטוטן, מוקסיפריל ומידוט; HCl, מומטזון פורואט, מופירוקין, נדולול, נפצילין ומידוט; Na, naftifine· HCl, נרטריפטן· HCl, נטמיצין, נביבולול ומידוט; HCl, נלרבין, נפפנק, נביראפין, ניאצין, ניקוטין, נילוטיניב, נילוטמיד, ניטאזוקסאניד, ניטיסינון, ניטרופוראנטואין, ניזטידין, נורטריפטילין ומידוט; HCl, אולסלזין ומידוט; Na, אורליסטט, אוקספרופרוזין, אוקסטריפילין, אוקסיבוטינין כלוריד, אוקסי-טטרציקלין&מידוט; HCl, פליפרידון, פלונוסטרון ומידוט; HCl, paromomycin sulfate, pazopanib· הידרוכלוריד, פמטרקסד דיסודיום, פמירולסט האשלגן, פניצילמין, פניצילין G אשלגן, פנטמידין איזתיונאט, פנטוסטטין, פרינדופריל ארבומין, פרמתרין, פרפנאזין, פנלזין סולפט, פנילפרין, פיטונדיון, פימקרולימוס, פיטבסטטין סידן, ופודופילוקס
SmBit– DDB1 מבטא DNA פלסמידהמעבדהזמינה על פי בקשה
Trypsin-EDTASigma AldrichT4049
175012 שלנו שלנו

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
  2. Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
  3. Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).
  4. Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
  5. Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
  6. Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648(2017).
  7. Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
  8. Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  10. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).
  11. Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
  12. Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
  13. de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115(2014).
  14. Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HBx DDB1 InteractionSplit Luciferase AssayCompound ScreeningProtein Protein InteractionHBV Therapeutic AgentsHEK293T Cell TransfectionLuminescence MeasurementZ Prime ScoreNitazoxanide InhibitionReal Time Detection

מאמרים קשורים