יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

Summary

כאן, אנו מציגים כלי שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את אפנון posttranscript של תעתיק בתאי אפיתל הראשי מכתשיים באמצעות מערכת ביטוי inducible בשילוב טכניקה אלקטרופורציה פיפטה.

Abstract

לימוד הרגולציה הפוסט-טראומטית הוא יסוד להבנת האפנון של שליח מסוים RNA (mRNA) והשפעתה על הומאוסטזיס התאים וחילוף החומרים. ואכן, תנודות הביטוי בתעתיק יכולות לשנות את יעילות התרגום ולבסוף את הפעילות התאית של תעתיק. כמה גישות ניסיוני פותחו כדי לחקור את מחצית החיים של mRNA למרות חלק מהשיטות הללו יש מגבלות המונעות את המחקר הנכון של אפנון הפוסטסקריפט. מערכת השראה היזם יכול לבטא גן של עניין תחת השליטה של מיזם סינתטי מוסדר טטרציקלין. שיטה זו מאפשרת שערוך מחצית חיים של mRNA נתון תחת כל מצב ניסיוני ללא מטריד הומאוסטזיס התא. חיסרון משמעותי אחד של שיטה זו הוא הצורך בתאי העברה, אשר מגביל את השימוש בטכניקה זו בתאים ראשוניים מבודדים העמידים מאוד בפני טכניקות העברה קונבנציונליות. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית שימשו בהרחבה כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. המאפיינים הייחודיים והפנוטיפים של תאי הכתשיים הראשוניים הופכים אותו לחיוני לחקר מודולרופהפוסט של גנים המעניינים בתאים אלה. לכן, המטרה שלנו הייתה לפתח כלי הרומן כדי לחקור את מודולונות הפוסט של mRNAs של עניין בתאי האפיתל מכתשיים בתרבות הראשית. עיצבנו פרוטוקול מהיר ויעיל של הזיהום החולף כדי להכניס מערכת הבעה מבוקרת בשיטת פלססקריפט לתאי האפיתל הראשוניים. אסטרטגיית שיבוט זו, המשתמשת באפירופה ויראלית כדי לתייג את המבנה, מאפשרת את האפליה הקלה של בניית הביטוי מתוך זה של mRNAs האנדוגניים. באמצעות מחזור ΔΔ שונה (Cq) שיטה, ביטוי התמליל יכול להיות כימות במרווחי זמן שונים כדי למדוד את מחצית החיים שלו. הנתונים שלנו להפגין את היעילות של הגישה הרומן הזה בחקר הרגולציה הפוסט בתנאים שונים פתופסולוגית בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.

Introduction

מספר טכניקות פותחו כדי לקבוע את מחצית החיים של mRNAs. טכניקת ריקבון הדופק מרדף, אשר משתמשת mRNAs, מאפשר הערכה סימולטני של בריכה גדולה של mRNAs עם הפרעה תאית מינימלית. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת הערכה ישירה של מחצית החיים של תעתיק גן יחיד ולא ניתן ליישם כדי ללמוד את אפנון הפוסטסקריפט של מערכת הגירוי הבאה של mRNA עם גורמי גדילה, ROS, מדאיג, או דלקת¹.

השימוש במעכבי תעתיק, כגון אקטינומיצין D ו-α-אמטין, היא שיטה פשוטה יחסית למדידת קינטיקה של השפלה mRNA לאורך זמן. אחד היתרונות העיקריים של גישה זו על זה של טכניקות קודמות, (כלומר, דופק-מרדף) מסתמך על היכולת להעריך במישרין את מחצית החיים של תעתיק נתון ולהשוות איך טיפולים שונים יכול להשפיע על הקינטיקה השפלה שלה. עם זאת, ההשפעה המשמעותית משמעותית של מעכבי התעתיק על הפיזיולוגיה של התא מייצגת חיסרון משמעותי של הגישה². אכן, עיכוב של התא כולו ההמרה עם תרופות אלה יש תופעת לוואי שלילית של perturbing את הסינתזה של אלמנטים מרכזיים המעורבים ביציבות mRNA, כגון microRNAs (miRNAs), כמו גם את הביטוי וסינתזה של חלבונים כריכת RNA, אשר חשובים עבור השפלה ויציבות mRNA. ההפרעות החמורות של תמלול הגנים על-ידי תרופות אלו עלולות לשנות את עקומות ההשפלה של התעתיקים.

מערכת אינדוקציה היזם מייצג גישה שלישית כדי למדוד את מחצית החיים של mRNA ספציפי. שיטה זו מודדת את ההשפלה של mRNA ספציפי באופן דומה לשיטות המשתמשות במעכבי תעתיק. שני סוגים של מערכות אינדוקציה משמשים לעתים קרובות: סרום המושרה c-fos אמרגן³ ואת מערכת inducible Off⁴. עם מערכת c-fos, השימוש מעכבי שעתוק כי יכול להיות רעיל לתא אין צורך. עם זאת, שיטה זו מחייבת סנכרון של מחזור התא, המונע את הערכת היציבות בפועל של תעתיק במהלך השלב הפנימי⁵. לעומת זאת, מערכת ט-Off מאפשרת ביטוי חזק של גן העניין (הארה) תחת השליטה של מקדם מוסדר טטרציקלין מוסדרים. מערכת זו מחייבת נוכחות של שני רכיבים שחייבים להיות מזוהמים בתא כדי להיות פונקציונלי. באמצע הפלסטיק הראשון (pTet-Off) מבטא את החלבון הרגולטורי tTA-עו"ד, מקדם שעתוק סינתטי היברידית מורכב של prokaryotic מדיכוי TetR (מ Es, האננכיה coli) התמזגו שלושה תחומים ההפעלה הפעלה של חלבון ויראלי HSV VP16. הגוי משוכפל לתוך pTRE-צר באמצע תחת שליטה של מיזם סינתטי (P_הדוק), הכולל את הרצף המינימלי של cytomegalovirus (cmv) יזם התמזגו שבעה חוזר של רצף המפעיל teto. תמלול של הגן במורד של P_הדוק תלוי באינטראקציה של tetr עם tetr. בנוכחותו של טטרציקלין או הנגזרת שלה, דוקסיציקלין, מאבדת מחדש את הזיקה שלה למפעיל Tetr, המוביל להפסקת שעתוק⁴. המאפיינים של מערכת ט-Off להפוך אותו למודל אידיאלי למחקר של ביטוי mrna ספציפי בתאי איקריוטית תוך הימנעות השפעות pleiotropic פוטנציאלי משני העדר רצפים prokaryotic הרגולציה בתא איקריוטית⁶. בדרך כלל, שורות התאים היציבים כפליים (hek 293, הלה וPC12) משמשות עם מערכת זו כדי לשלב עותקים של הרגולטור והתגובה של פלמידים עבור גישה נוחה לביטוי גנטי בשליטה^7,8,9.

מספר דגמים של תאים אפיתל מכתשיים בתרבות שימשו כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. במשך שנים, החוקרים מנוצל באופן נרחב בתאים אנושיים או מכרסמים הראשי^10,11 , כמו גם קווים מונצח תאים כגון A549 אנושי או עכברוש rle-6tn תאים^12,13. למרות שהם בדרך כלל פחות מתרבים וקשה יותר לתרבות לבין transfect, מכתשיים תאי האפיתל בתרבות הראשית להישאר בתקן הזהב למחקר של תפקוד ותפקוד של האפיתל מכתשי בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. אכן, שורות תא מונדמות כגון תאים A549 לא מציגים את המאפיינים המורכבים ופנוטיפים של תאים ראשוניים, ואילו מכתשיים תאי אפיתל בתרבות העיקרית לאחר מכן את המאפיינים העיקריים של האפיתל מכתשי, במיוחד את היכולת ליצור מחסום מקוטב והדוק^14,15. למרבה הצער, תאים אלה עמידים מאוד טכניקות החצייה המקובלת, כגון אלה ניצול ליפוזומים, מה שהופך את השימוש של היזם המושרה מערכת כגון ט-Off מאוד קשה.

אפנון הפוסטסקריפט של mRNAs היא אחת השיטות האפקטיביות ביותר למודוללי במהירות את ביטוי הגנים של תעתיק¹⁶. אזור ה-mRNA 3 ' בלתי מתורגם ' (3 ' UTR) ממלא תפקיד חשוב במנגנון זה. זה הוכח כי, בניגוד ל 5 ' UTR, יש קורלציה אקספוננציאלית בין אורך של 3 ' UTR ואת המורכבות הסלולר ו מורפולוגית של אורגניזם. מתאם זה מרמז כי 3 ' UTR, כמו אזורי קידוד mRNA, כבר נתון בחירה טבעית כדי לאפשר אפנון מורכב יותר ויותר של הפוסטסקריפט במהלך האבולוציה¹⁷. 3 ' UTR מכיל מספר אתרים מחייבים עבור חלבונים ו miRNAs המשפיעים על היציבות והתרגום של התעתיק.

בעבודה הנוכחית, פיתחנו כלי כדי לחקור את התפקיד של תחומים שמרו במידה רבה ב-3 ' UTR של הגוי על שליטה של התעתיק. התמקדנו בערוץ נתרן האפיתל, יחידת יחידת (αENaC), אשר ממלאת תפקיד מפתח בבית מכתשי הפיזיולוגיה האפיתל¹⁸. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית היו בהצלחה משני הצדדים עם שני המרכיבים של מערכת ט-Off, אשר מאפשר ללמוד את התפקיד של 3 ' UTR ביציבות mRNA עם מערכת כי המינימלי משפיע הפיזיולוגיה של התא ואת חילוף החומרים בהשוואה לשימוש של מעכבי שעתוק עם פרוטוקולים אחרים. אסטרטגיית שיבוט פותחה כדי להבדיל את הביטוי של הגוי מתוך הגן האנדוסוגגני באמצעות אפירופה בלתי מפותח (V5). התגובה והפלמידים של התקנות הועברו לאחר מכן לתוך מכתשיים תאי האפיתל באמצעות טכניקת פיפורציה חשמלית. לאחר מכן, הביטוי של התעתיק נמדד על-ידי דגירה של התאים עם דוקסיציקלין במרווחי זמן שונים. מחצית החיים של התמליל הוערך על-ידי RT-qPCR עם שיטת Cq ששונתה באמצעות מוצר העברה של טה-אד mRNA לנורמליזציה. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה ללימוד האפנון הפוסט-ממדי של תעתיק בתנאים שונים והגדרת המעורבות של האזורים הבלתי מתורגמים ביתר פירוט.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול המוסדי בעלי חיים של מרכז המחקר של מרכז אשפוז באוניברסיטת מונטריאול (CRCHUM).

1. עיצוב והדור של התגובה הפלבמיד לבטא את גן העניין (הארה)

1. השתמש וקטור inducible טטרציקלין-off, כגון pTRE-הדוק.
2. לנתח את הרצף של ה-הארה והאתר הכפול (MCS) של הווקטור כדי לזהות את אתרי ההגבלה ב-MCS שאינם נמצאים בפנים בתוך הגוי.
3. בידוד תאים האפיתל הראשי מכתשיים מ זכר הג-דאולי עכברוש הריאות כמתואר בעבר^19,20.
4. לטהר את ה-RNA הכולל מתאי האפיתל מכתשיים על ידי חילוץ RNA בשיטה סטנדרטית, כגון מיצוי פנול/כלורופורם או שימוש בעמודות ספין מבוססות-RNA של סיליקה.
5. הפוך-תעתור את mRNA ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות oligo (dT) ו באיכות גבוהה היפוך הטרנסקריפטאז.
6. השתמש באמינות גבוהה Taq פולימראז ו חפיפה סטנדרטית טכניקות PCR כדי לאגף את הגוי עם שני אתרים שנבחרו זיהוי אנזימים הגבלה באמצעות התחל מעוצב.
   1. יש את התחל הקדמי להכיל את קוזק הקונצנזוס ריבוכמה באתר מחייב²¹ כדי לשפר את רמות הביטוי כדי ללמוד ביטוי חלבון במקביל עם יציבות mrna. יש לכלול בקידוד רצף את האפיופ של ה-V5 במעלה הזרם של הגוי כדי להבחין בביטוי של הגוי המנוכר מביטוי האנדוגניים (שולחן 1).
   2. . לאחר העצירה הנגדית
7. מוטנטים יכולים להיווצר על ידי מחיקה סדרתית לחקור את ההשפעות של 3 אזורים UTR שונים על היציבות של mRNA של הגוי באמצעות להפוך את קידוד התחל באתר פוליאדלציה בהדרגה מוחקת את 3 ' הקצה של הגוי 3 ' UTR (איור 6). לחילופין, ניתן להשתמש במוטגנזה בבימויו של PCR כדי למקד אזור מסוים של עניין ב-3 ' UTR²².
8. לעכל את הווקטור inducible ואת התוספת עם אנזימי הגבלה שנבחרו בעבר בטמפרטורת הדגירה המתאימה עבור 1 h, ואחריו טיפול עם פוספספטאז במהלך התגובה וקטורית עבור 30 דקות כדי למנוע הכנסה עצמית.
9. הפרד את הווקטור מתעכל ומקטעי הוספה על ידי אלקטרופורזה ב 1-1.5% agarose ג'ל (ריכוז בהתאם לגודל של הכנס).
10. באמצעות להב ואור UV, לאסוף את שברי ה-DNA המכיל את ההכנסה הרצויה וקטור להיות ligated.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
11. לטהר את מקטעים שנאספו ג'ל agarose באמצעות ערכת הטיהור PCR המבוססת על סיליקה ולמדוד את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ב 260 nm.
12. Ligate הגוי ואת וקטור inducible עם T4 DNA לליגאז באמצעות וקטור: להוסיף יחס טוחנת של 1:3 כדי להגדיל את ההסתברות של הארכה. דגירה את התגובה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 3 h.
13. הפוך את התגובה הנגדית לתוך E. coli המוסמכת (DH5α).
    1. הוסף 1-10 ng של וקטור גן לצינור המכיל 100 μL של תאים המוסמכים. דגירה את התאים על הקרח 30 דקות ולאחר מכן חום בהלם תאים ב 42 ° c עבור 45 s. מניחים את השפופרת על הקרח עבור 2 דקות ולהוסיף 900 μL של מדיום RT ליברות. דגירה את התאים עבור 1 h ב 37 ° צ' עם טלטול ב 225 סל ד.
    2. התפשטות 100 μL של התגובה על צלחת ליברות אגר עם אנטיביוטי מתאים (למשל, 100 μg/mL אמפיצילין עבור וקטור pTRE-הדוק) כדי לבחור את החיידקים שעברו טרנספורמציה. מודקת את הצלחת הלילה ב 37 ° c.
    3. בחר מושבות בודדות באמצעות לולאת חיסון או 20 μL טיפ ו-דגירה לילה ב 5 mL LB בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה ב 37 ° c עם טלטול. חיידקים שהפך יכול להיות מאוחסן מניות גליצרול ב-80 ° c ביחס של 400:600 של LB בינונית כדי גליצרול.
14. לחלץ את ה-DNA פלמיד באמצעות מבוססי סיליקה בעמודות באמצע ולמדוד את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ב 260 nm. אשר את החדרת הגוי על ידי ניתוח הגבלה והתמצאות והיעדר מוטציות שעשויות להיות מוכוונות במהלך RT-PCR ברצף.

2. התמרה של העירוי של התגובה המבטאת את גן העניין (הארה) לתאי אפיתל מכתשיים ראשוניים

1. לבודד סוג II מכתשיים תאים אפיתל מריאות חולדה.
2. הזרע את התאים בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/cm² ב 100 mm מנות פטרי עם מדיום מינימום חיוני מינימלי (להשלים לזכור). להשלים מחברים הוא מקרן בתוספת עם 10% fbs, 0.08 mg/L tobramycin, septra (3 μg/ml ילדים ו -17 μg/ml סולפאמתוקסאזול), 0.2% נחקו₃, 0.01 M hepes (pH = 7.3), ו 2 מ"מ L-גלוטמין. מתרבות התאים 24 שעות ב 37 ° c ב 5% CO₂ בחממה לחות.
3. ביום למחרת, מקום 500 μL של הגברת המלאה ללא אנטיביוטיקה בכל באר של 12 היטב צלחת חדש ולחמם את הצלחת ב 37 ° c עבור 30 דקות. במהלך שלב זה, חשוב להשתמש סרום העוברי העובר ללא מזהם טטרציקווים או עם רמה נמוכה מדי כדי להפריע התעשייה.
4. להכין צינורות 1.5 mL המכיל את הפלס1 עם inducible גוי (הגוי באמצע) ואת וקטור הרגולציה (g., pTet-Off) על ידי הוספת 1 μg של ה-פלבין הגוי ו 1 μg של וקטור הרגולציה לכל טוב ב RT. עבור ניסויים בהבעה עם חלבונים כריכת RNA (RBP), 1 μg של וקטור קונסטיטוטיבי (g., pcDNA3) המבטא את RBP של עניין נוסף לתמהיל DNA (איור 7).
5. מנושף את המדיום ושטוף בעדינות את התאים עם ה-PBS (ללא סידן ומגנזיום) שחומם ב37 מעלות צלזיוס.
6. הוסף 5 מ ל של 0.05% טריפסין מראש ב 37 ° c ו מודדת את התאים עד התאים מנותקים (2-4 דקות). לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ ל ללא אנטיביוטיקה מלאה.
7. לאסוף את ההשעיה התא בצינור 50 mL, לשטוף את צלחת פטרי עם 4 מ ל של בינוני כדי לאסוף כמה שיותר תאים הנותרים ככל האפשר, ולאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות.
8. והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של PBS. הרוזן וחשב את מספר התאים באמצעות הומוציטומטר.
9. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות בעדינות ומכה את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה במאגר מחדש בריכוז של 4 x 10⁷ תאים/mL. הוסף את התאים מצינור 1.5 mL מוכן בשלב 2.4 בריכוז של 400,000 תאים לכל טוב ובעדינות לערבב אותם על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
10. מניחים את הצינור במכשיר האלקטרופורציה וממלאים אותו ב3.5 mL של מאגר אלקטרוליטי.
11. הכניסו טיפ מצופה זהב לתוך פיפטה על ידי לחיצה מלאה על הבוכנה. בעדינות לערבב את התוכן של שפופרת 1.5 mL ולטפל בזהירות את התאים עם הפיפטה. היזהרו למנוע בועות אוויר להזין את הקצה, כמו זה יגרום הובלה חשמלית במהלך אלקטרופורציה ולגרום לירידה ביעילות הזיהום.
12. הכנס את הפיפטה לתחנת החשמל עד שיהיה צליל לחיצה.
13. בחר את פרוטוקול אלקטרופורציה המתאים לתאי האפיתל מכתשיים, המתאים מתח הדופק של 1,450 V ו 2 פולסים עם רוחב של 20 ms, ולחץ על התחל על מסך המגע.
14. מיד לאחר החצייה, להסיר את הפיפטה ולהעביר את התאים היטב מילא בעבר עם הגברת המלאה ללא אנטיביוטיקה כי כבר מראש עד 37 ° c.
15. חזור על שלבים 2.11-2.14 עבור הדגימות הנותרות.
16. טלטל בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני השטח היטב. מודיית את התאים ב 37 ° c ב 5% CO₂ בתוך החממה לחות. לאחר יומיים, החלף את המדיום בעזרת הגברת המלאה באנטיביוטיקה.
17. אשר את הצלחת התרגום על ידי התבוננות בביטוי של eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית או על ידי זרימה cy, לנסות באמצעות וקטור שליטה (איור 1).
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי ודורש צעד נוסף של העברה באמצעות פלסטלינה שונה המבטא eGFP, כגון pcDNA3-EGFP.

3. אינדוקציה של השעתוק של הגוי

הערה: ניתן לטפל בתאים מראש עם הטיפולים הרצויים לפני השראתי כדי להעריך את השפעתם על יציבות mRNA (איור 5).

1. להכין מניות דוקסיציקלין פתרון של 1 מ"ג/mL במים מוכי. אחסן את פתרון המניה ב-20 ° c מוגן מפני אור. דוקסיציקלין, הנגזרת טטרציקלין, משמש במקום טטרציקלין כי יש לו יותר מחצית חיים (2x) מאשר טטרציקלין. יתרה^מזאת,יש צורך בריכוז נמוך יותר של דוקסיציקלין לצורך הפעלה מלאה של המבצע ט' .
   הערה: דוקסיציקלין יכול להשפיע על ביטוי mRNA של האנדודוגני. כדי לוודא זאת, יש לבדוק את השפעת הטיפול באמצעות דוקסיציקלין על תאים מכתשיים כדי לאשר את היעדר השינויים בביטוי הגוי (איור 2).
2. הכינו פתרון חדש מבית 1 μg/mL בשנת ה72 המלאה של הקרן וחמם אותו ל 37 ° c.
3. החלף את המדיום עם 1 מ ל של זיכרון מלא המכיל 1 מיקרומטר μg/mL כדי לעכב את התמלול של הגוי.
4. דגירה מספר בארות ב 37 ° c ב 5% CO₂ עבור כמויות שונות של זמן מ 15 דקות-6 h כדי להעריך את mrna מחצית החיים של הגוי.
5. בסוף הטיפול, לשטוף את התאים עם הקרח קר PBS ו lyse אותם עם ערכת החילוץ כלורופורם מסחרית פנול-הכלורופורם-RNA על ידי הוספת 500 μL של מאגר לכל טוב וטלטול את הצלחת כדי המגון את התאים.
6. בודד את ה-RNA לפי פרוטוקול היצרן. לקבוע את התשואה RNA וטוהר על ידי ספקטרופוטומטר ב 230, 260, ו 280 nm. דגימות RNA עם 260:230 ו 260:280 יחסי של 1.8 ו 2.0, בהתאמה, נחשבים טהורים.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

4. קביעת יציבות mRNA של הגוי

1. לטפל 1 μg של RNA כולל עם RNAse-חינם DNAse I (כיתה הגברה) כדי להסיר כל סימן של DNA פלמיד שיכול להפריע הגברה הבאים DNA.
   1. בצינור 0.2 mL PCR, לשלב 1 μg של הכולל RNA, 1 μL של 10x DNase מאגר התגובה, 1 μL של DNAse I (1 U/μL), ו RNAse-מים ללא תשלום כדי להשיג נפח כולל של 10 μL.
   2. מודקון את התגובה ב RT עבור 20 דקות.
   3. ביטול הפקודה DNAse אני על ידי הוספת 1 μL של 25 mM EDTA ל 10 μL התגובה ערבוב ו דגירה את התגובה ב 70 ° c עבור 10 דקות.
2. הפוך-תעתור את ה-RNA הכולל של DNA לתוך cDNA באמצעות מסחרית זמינה cDNA ערכת סינתזה עם תערובת של oligo (dT) ו התחל הספר אקראי כדי לשפר את הפוך את היעילות תמלול.
   1. בקצרה, להוסיף 4 μL של מיקס התגובה 5x, 1 μL של היפוך הטרנססקריפט, ו 4 μL של RNAse-מים ללא תשלום 11 μL של ה-DNA הכולל לערבב RNA כדי להשיג נפח התגובה הכולל של 20 μL. לערבב את התגובה היטב על ידי ליטוף אותו למעלה ולמטה
   2. מודסת את התגובה עבור 5 דקות ב 25 ° c, ואחריו 20 דקות ב 46 ° c, ולאחר מכן להשבית את התגובה על ידי דגירה אותו ב 95 ° c עבור 1 דקות. כל תגובה תניב 50 ng/μL של מוצר cDNA.
   3. לדלל את התגובה cDNA לריכוז של 5 ng/μL על ידי הוספת 180 μL של מים ביולוגיים מולקולריים ברמה 20 μL התגובה ערבוב. אחסן את מוצרי cDNA ב-80 ° צ' או להמשיך מיד לבצע PCR כמותי בזמן אמת (qPCR).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
3. העיצוב הקדמי והפוך qPCR ספציפיים לגוי.
   1. בשל הביטוי האנדוגני של הגוי בתאים, התחל צריך להיות מתוכנן כדי להגביר את 100-150 bp האמפר של האפיפי של V5 בשילוב עם הגוי (שולחן 1).
   2. יש להשתמש בצבעי יסוד גנים בעלי התייחסות פנימית גם כפקדי נורמליזציה. בדרך כלל, גנים משק הבית, כגון בטא actin ו-היפוקסאתה פוספוליבואז 1 גנים, משמשים התייחסות גנים. עם זאת, לא ניתן להשתמש באלה עם מערכת אינדוקציה זו עקב וריאציה של יעילות הזיהום. במקום זאת, הביטוי של התעתיק tTA-Ad מוערך לצורך נורמליזציה, משום שהביטוי שלו הוא קונסטיטוטיבי בתאים עקב הפעילות של מקדם cytomegalovirus ירוס. כל שינוי בביטוי שנמדד על ידי qPCR יהיה נציג היעילות של התרגום (התחל: קדימה 5 '-מנות TGA CGA הסוכנות GGA AAC TC 3 ' והפוך 5 '-AGT GGG תאת גת המאלף TGA CC-3; 129 bp amplicon) ויאפשר נורמליזציה של הביטוי של שיבוטים מנוכר (איור 3).
4. הכינו כל תגובת qPCR ב טרילקאט באמצעות מיקס מאסטר בצבע ירוק SYBR.
   1. לדלל את 5 ng/μL cDNA מיקס לריכוז של 1.25 ng/μL באמצעות מים ביולוגיים מולקולריים ברמה.
   2. לשלב 5 μL של שילוב מאסטר בצבע ירוק SYBR (2x), 0.1 μL של מים מולקולריים בביולוגיה מולקולרית, 0.45 μL של 7.5 μM הקדמי, 0.45 μL של 7.5 הפוכה לאחור, ו 4 μL של 1.25 ng/μL cDNA כדי לקבל נפח התגובה הכולל של 10 μL. Mix היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה ב 96 הצלחת היטב PCR. השתמש בסרט דבק אופטי כדי לוודא שמכסה הלוחית חתום וכלה במניעת זיהום והתאיידות.
   3. לסובב את מיקס התגובה בקצרה על ידי צנטריפוגה ולמקם את הצלחת ב-qPCR תרמוטרטרנר.
5. הגבר את ה-V5-מתויג הגברה ו-tTA-Ad באמצעות התנאים הבאים של qPCR: 95 ° c במשך 10 דקות כצעד דנטורציה, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 10 s, 58 ° c עבור 15 s, ו 72 ° c עבור 20 s. עקומת ההיתוך ברזולוציה גבוהה חייב להיווצר לאחר מחזורי הגברה מבוצעים כדי להעריך את טמפרטורת ההיתוך הספציפית של הגברה הרצוי כדי להבטיח את העדר של רעש אמפליקון פסגות.
   1. כלול שולטת שלילית עבור רביעיית ה-PCR על-ידי ביצוע qPCR עם RNA כתבנית ללא היפוך הטרנסקריפטאז לשמש כפקד על זיהום דנ א פוטנציאלי הפלסטיק ו-qPCR ללא cDNA הוסיף לערבב qPCR כדי להבטיח את העדר בולטות או זהמים.
   2. הריכוז האופטימלי cDNA, פריימר יעילות, וריכוז חייב להיות ממוטב על פי הגוי על ידי שיטת עיקול סטנדרטי. לשם כך, בצע דילול סדרתי באמצעות cDNA מתאים לא מטופל (תרבותי ללא דוקסיציקלין). העקומה הסטנדרטית נוצרת על-ידי התוויית ערכי Cq כנגד היומן של גורם הדילול Cq, ויעילות ההגברה (E) מחושבת בהתאם לשיפוע של העקומה הסטנדרטית באמצעות הנוסחה הבאה:
      E = 10^{-1/שיפוע}
      הערה: יעילות הגברה צריכה להיות כ 0.9 עד 1.05. אחרת, יש לעיצוב מחדש של התחל.
6. נתח את נתוני ה-qPCR באמצעות שיטת Cq השוואתית על-ידי נרמול ערכי הביטויים של הגוי לביטוי של tTA-Ad כדי להשיג את רמות הביטוי היחסיות של הגוי ולדווח על ביטויו כאחוז מהביטוי mRNA של הגוי בתאים מאותה חיה בנקודת ההתחלה (t = 0) (איור 4).
7. מחצית החיים נקבע מתוך קבוע הקצב (K) של עקומת השפלה של הגוי mRNA באמצעות המשוואה הבאה:
   t_1/2 = בתוך 2/K.

Results

פרוטוקול זה נעשה שימוש בהצלחה כדי ליצור מערכת הבעה מבוקרת מבחינה מבצעית באמצעות פלסטלינה כדי להעריך את החשיבות של חלקים שונים של αENaC 3 ' UTR באפנון של יציבות תעתיק בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.

הצעד הראשון ביישום של מערכת זו היה ליצור טכניקת העברה מהירה, קלה ויעילה עבור מכתשיים תאי אפיתל בתרבות הראשית, שקשה לשנות את המצב. כפי שמוצג באיור 1, טכניקת הפיפטה אלקטרופורציה המותרת לקצב התייעלות של 25-30%, כ...

Discussion

שיעור הגידול הנמוך של מכתשי תאים אפיתל בתרבות העיקרית כבר מגבלה רצינית לשימוש מערכת ט-Off כדי להעריך את יציבות mRNA בתאים אלה. עם זאת, מגבלה זו היתה להתגבר על ידי הפיפטה אלקטרופורציה, המאפשר 25-30% יעילות הזיהום (איור 1 ואיור 3)²⁶.

המדידה של התעתיק היא בסיסית להבנת האפנון של mRNA נתון והשפעתה על הומאוסטזיס וחילוף החומרים של התאים. וריאציה בביוזמינותה של הגוי עשויה לשנות את יעילות התרגום ויש להם השפעה ישירה על ה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אקטינומיצין D	סיגמא-אולדריץ'	A9415
אמפיצילין	סיגמא-אולדריץ'	A1593
קו בהירהמציטומטר	סיגמא-אולדריץ'	Z359629
כלורופורם - כיתה ביולוגיה מולקולרית	סיגמא-אולדריץ'	C2432
ClaI	ניו אינגלנד ביולאבס	R0197S
ציקלוהקסמיד	Sigma-Aldrich	C7698
DM IL LED מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות פאזה
I, דרגת הגברה	Invitrogen	18068015
דוקסיציקלין היקלאט	סיגמא-אולדריץ'	D9891-1G
Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (D-PBS), ללא סידן ומגנזיום	Wisent Bioproducts	311-425-CL
אתנול - בדרגת ביולוגיה מולקולרית	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	G5516
HEPES pH 7.3	סיגמא-אולדריץ'	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
ערכת סינתזת cDNA iScript	מעבדות Bio-Rad	1708890
איזופרופנול - ביולוגיה מולקולרית כיתה	מרק סיגמא-אולדריץ'	I9516
LB (לנוקס)	מרק סיגמא-אולדריץ'	L3022
LB עם אגר (לנוקס)	סיגמא-אולדריץ'	L2897
L-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'	G7513
ליפופוליסכרידים מ- Pseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, אבקה	Gibco	61100103
מיקרו אמפר אופטי 96 באר צלחת תגובה	מיושמת ביוסיסטמות N8010560
מיקרואמפ סרט דבק אופטי	יישומי ביוסיסטמים 4360954
ארונות בטיחות ביולוגיים MSC-Advantage Class II	ThermoFisher Scientific	51025413
מערכת אלקטרופורזה Mupid-exU	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
מערכת העברת ניאון 10 ומיקרו; L Kit	Invitrogen	MPK1025
ניאון Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RCמוכשר מבחינה כימיתE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 וקטור	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP פלסמיד	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA פולימראז נאמנות גבוהה	Invitrogen	11304011
pTet-Off וקטור מתקדם	Takara Bio	631070
pTRE וקטור הדוק	Takara Bio	631059
תאי אפיתל מכתשית מטוהרים
II ערכת מיצוי ג'ל	QIAGEN	20021
QIAGEN פלסמיד מקסי ערכת	QIAGEN	12162
QIAprep ספין Miniprep ערכת	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 ו-7 Flex בזמן אמת תוכנת מערכת PCR	יישומית ביו-מערכות יישומיות	n.a.QuantStudio
6 Flex מערכת PCR בזמן אמת, 96 בארות	יישומי יישומי ביו-סיסטמס	4485697
חולדה רקומביננטית TNF-אלפא חלבון	R& המגבר; D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
שרימפס אלקליין פוספטאז (rSAP)	ניו אינגלנד Biolabs	M0371S
נתרן ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	S5761
SsoAdvanced אוניברסלי SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System מאושר FBS	Takara Bio	631367
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
מים, ביולוגיה מולקולרית בדרגת	Wisent Bioproducts	809-115-EL