הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60680

⸱

18 במרץ 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להנחות כיצד לחלץ, לתחזק, ו הנתק מורטין אסטרוציט ו מיקרוגליה תאים ממערכת העצבים המרכזית, ואחריו זיהום עם טפילים פרוטותים.

תקציר

Astrocytes ו מיקרוגלייה הם התאים השופעים ביותר גליה. הם אחראים על תמיכה פיזיולוגית והומאוסטזיס תחזוקה במערכת העצבים המרכזית (CN). העדויות הגדלות של מעורבות שלהם בשליטה של מחלות זיהומיות להצדיק את העניין המתעוררים לשיפור של מתודולוגיות כדי לבודד אסטרוציטים הראשי מיקרוגליה כדי להעריך את התגובות שלהם זיהומים המשפיעים על ה-cn. בהתחשב ההשפעה של טריאנוסומה cruzi (t. cruzi) ו טוקסופלזמה gondii (t. gondii) זיהום ב-cn, כאן אנו מספקים שיטה לחלץ, לתחזק, לנתק ולהדביק murine האסטרוציטים ותאים מיקרוגלייה עם טפילים פרוטותים. תאים שחולצו מתוך היילוד מתוחזקות בתוך מבחנה 14 ימים עם החלפת מדיה דיפרנציאלית תקופתית. Astrocytes ו מיקרוגלייה מתקבלים באותו פרוטוקול החילוץ על ידי דיסוציאציה מכנית. לאחר פנוטיפים על ידי הזרימה cy, לנסות, תאים נגועים בטפילים פרוטותים. שיעור הזיהום נקבע על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית בנקודות זמן שונות, ובכך מאפשר הערכה של היכולת הדיפרנציאלית של תאי גליה כדי לשלוט על הפלישה פרוטוזוא ושכפול. טכניקות אלה מייצגות פשוטה, שיטות זולות ויעילות כדי ללמוד את התגובות של אסטרוציטים ו מיקרוגלייה לזיהומים, פתיחת השדה עבור ניתוח נוירואימונולוגיה נוספת.

מבוא

ה-cn מורכב בעיקר מנוירונים ותאי גלאל1,2,3. Microglia ו אסטרוציטים הם התאים הנפוצים ביותר של גליה ב-cn. Microglia, מקרופאג תושב, הוא החיסוני ואת התאים של הphagocytic ב-cn3,4, בעוד אסטרוציטים אחראים לשמירה על הומאוסטזיס ולהפעיל פונקציות תומכות5.

למרות התאים גליה הידוע באופן קלאסי להיות אחראי על תמיכה והגנה של נוירונים6,7, פונקציות המתעוררים של תאים אלה תוארו בספרות האחרונות, כולל התגובות שלהם זיהומים8,9,10,11. כך, יש דחיפה לפתח שיטות כדי לבודד אלה התאים גליה כדי להבין את הפונקציות שלהם בנפרד.

יש כמה דגמים חלופיים כדי ללמוד תאים גליה ולא התרבויות הראשיות, כמו לספירת תאים מונצח ומודלים vivo. עם זאת, תאים מונצח נוטים יותר לעבור שינויים גנטיים נסחף מורפולוגיים, בעוד במחקרים vivo להטיל תנאים מניפולציה מוגבלת. לעומת זאת, התרבויות הראשיות קל לטפל, טוב יותר להידמות vivo תאים וגם לאפשר לנו לשלוט גורמים ניסיוניים12,13. כאן, אנו לתאר הנחיות על איך לחלץ, לשמור ולנתק את מורטין אסטרוציטים ואת התאים הראשוניים מיקרוגלייה באותו פרוטוקול. יתרה מזאת, אנו גם מספקים דוגמאות לעבודה עם זיהום פרוטותים בתרבויות אלה.

תאי ה-cn שחולצו מעכברים הנמצאים במצב של עד 3 ימים, היו מתורבתים במשך 14 יום על מדיה דיפרנציאלית המאפשרת צמיחה מועדפים של התאים ה אסטרוציטים ו מיקרוגלייה. מאז השאר מיקרוגלייה מעל האסטרוציטים המצורפת, אוכלוסיות תאים היו מונתק מכנית בחממה מסלולית. לאחר מכן, אספנו את כל הסופרנטנט המכיל מיקרוגלייה וטריפסין שנוספו לניתוק האסטרוציטים. תאים גליה מבודדים היו פנופנזה בדרך כלל הוערך על ידי cy, לנסות ומצופה על פי הניסוי הרצוי.

כמו כן סיפקנו דוגמאות על איך להדביק אלה מיקרוגלייה מבודדים ו אסטרוציטים עם טפילים פרוטותים. T. gondii הוא מאוד נוירוטרופי פרוטומי אחראי לטוקסופלזמוזיס14, בעוד T. cruzאני אחראי על מחלת הצ אשר יכול להיות מוביל להתפתחות של הפרעות נוירולוגיות בתוך המוח15,16. יתר על כן, זה גם דווח כי זיהום עם T. gondii17,18 או T. cruzi19,20,21 היו הגורם אני של מוות בחולים בסיכון חיסוני. לכן, ההסבר של התפקיד החיסוני של התאים גליה מתוך ה-cn בשליטה בזיהומים פרוטותים הוא בעל חשיבות רבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים הכרוכים בעכברים בוצעו בהתאם למשפט הלאומי הברזילאי (11.794/2008) ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ושימוש בוועדות (IACUC) של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP).

1. הפקת תאים גליאל, תחזוקה ודיסוציאציה

הערה: מספר העכברים המשמשים להפקת התאים הגליאל תלוי בכמות התאים הדרושים לביצוע הניסויים הרצויים. בפרוטוקול זה, סך של 2.7 x 107 אסטרוציטים ו 4 x 106 מיקרוגלייה התקבלו שישה C57BL/6 עכברים. כל ההליכים בוצעו במצב סטרילי בארון בטיחות II class.

  1. היום הראשון
    1. הכינו תמיסת מלח מאוזנת טהורה של האנק (HBSS) ו-HBSS + 10% של סרום העוברי חום בלתי מופעל (FBS) (ראה טבלת חומרים).
    2. להכין מדיום הנשר השונה של dulbecco (dmem)/f12 (10% fbs + 0.08 מ ל פניצילין + 0.09 mm סטרפטומיצין + 12.5 mm הhepes + 30 מ"מ נתרן ביקרבונט, pH 7.2) ולסנן אותו עם מסנן ב0.22 יקרומטר (ראה טבלת חומרים).
      הערה: יש לאחסן את כל מדיית התרבות ב-4 ° c, אך יש צורך לחמם אותן מראש ב-37 לפני 20 דקות לפני תחילת הניסוי.
    3. לחטא את כל כלי הניתוח (מספריים, מרית ופינצטה) ב החיטוי ולהשתמש 70% אתנול במהלך ההליך.
    4. לשים ילודים (עד 3 יום בן) עכברים בחדר אטום המכיל כותנה ספוגה isof, 5 דקות להרדמה מעמיקה.
    5. רסס את גור העכבר עם 70% אתנול וערוף את ראשו של בעל החיים עם מספריים.
    6. לגרום משונן cut (אחורי לקדמי) עם מספריים לאורך הגולגולת כדי לפתוח אותו ולחשוף את המוח. הפרידו את הגולגולת מהמוח באמצעות מלקחיים. להסיר את המוח באמצעות מיקרו מרית כדי לשמור על שלמות המוח.
    7. מניחים את המוח בצלחת פטרי יבשה (6 ס מ קוטר). להסיר את הנורה ואת המוח הזעיר באמצעות מיקרו מרית. הזיזו את הקליפה לצלחת פטרי אחרת (בקוטר 6 ס מ) המכילה HBSS + 10% FBS (2 מ ל/צלחת פטרי).
    8. חותכים את רקמת המוח לחתיכות קטנות עם מספריים סטרילית באמצעות p1000 מיקרופיפטה להעביר כל רקמת המוח עם HBSS + 10% FBS שונים 15 מ"ל שפופרות חרוט. ודא שאמצעי האחסון הסופי הוא 2 mL/tube. אם לא, להשלים עם HBSS + 10% FBS.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אם כן, צינורות חרועם רקמת ה-CN חייבים להיות ממוקמים על הקרח עד 1 h.
    9. רוחצים את רקמת המוח לחתוך עם 3 מ ל של HBSS + 10% FBS (לכל צינור) ולאחר ההתרוממות. הסר בזהירות את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים.
      הערה: שלב זה נועד להסיר את הפסולת כדי לשחזר את הרקמה המחולצים.
    10. רוחצים את רקמת המוח לחתוך עם 3 מ"ל של HBSS טהור (לצינור) ואחרי היין, להסיר בזהירות את supernatant. חזור על שלב זה 3 פעמים.
      הערה: שלב זה נועד להסיר את הנסיוב הנותר מן השטף הקודם, כמו תאים יהיה טריסינטזציה בשלב הבא.
    11. הוסיפו 3 מ ל טריפסין לצינור ומניחים באמבט מים ב-37 ° c למשך 30 דקות, מנענעת בעדינות את הצינורות כל 5 דקות. הימנע בועות על ידי היפוך או לפתע ערבוב צינורות.
      הערה: שלב זה נועד לעכל את הרקמה שנאספה.
    12. כדי להשבית את הטריפסין, שטוף את הרקמה עם 3 מ ל לצינור של HBSS + 10% FBS, ולאחר שהיה בקבוקי הרקמה, הסר בזהירות את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים.
    13. שטוף את הרקמה עם 3 מ ל לכל שפופרת של HBSS טהור ובזהירות להסיר supernatant. חזור על שלב זה 2 פעמים.
    14. הוסף 7 מ"ל לכל שפופרת של hbss טהור ו המגון לסדר את הרקמה באמצעות מעברים רצופים ב פיפטות: הראשון עם הצינור 10 ml סרולוגית, ואחריו 5 מ ל ולבסוף עם p1000 micropipette.
    15. לאחר הומוקות, צינורות צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    16. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה עם 4 מ ל של HBSS + 10% FBS לכל צינור.
    17. העברת תאים לבקבוקון T-75 מטופל עבור הדבקה מיטבית של תרבות התא (ראה טבלת חומרים).
      הערה: רקמת התהליך מכל בעל חיים לכל בקבוקון.
    18. הניחו את הבקבוקון בחממה ב-37 ° c ו -5% CO2 ל -30 דקות לצורך הדבקות.
    19. הוסף 10 מ ל של שנוספו DMEM/F12 לבקבוקון ו-דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
      הערה: אמצעי האחסון הסופי הוא 14 מ ל לכל בקבוקון.
  2. היום השלישי
    1. הסרת 7 מ ל של התרבות בינונית מ-T-75 בקבוקון ולהוסיף 7 מ ל של חדש שנוספו Dמאמ/F12.
      הערה: מבחנות יכיל הרבה פסולת תאית מראה מעונן.
  3. היום החמישה
    1. להסיר את כל המדיום מ-T-75 בקבוקון ולהוסיף 14 מ ל של חדש שנוספו Dמאמ/F12.
      הערה: בינוני מוחלף מבחנות כדי להסיר הריסות ותאים לא מחסיד.
    2. לאחר כל 48 h, להסיר 6 מ ל של supernatant ולהוסיף 7 מ ל של טריים שנוספו DMEM דיום/F12 בינוני עד יום 14 של תרבות.
  4. . היום ה -14
    1. לאחר הסרת 6 מ ל של סופרנטאנט והוספת 7 מ ל של מדיום טריים בתוספת/F12, סגור את T-75 מבחנות הדוק.
    2. מניחים אותם ברצפה מסלולית שייקר ב 200 סל ד ו 37 ° c לילה כדי מכנית הנתק המיקרוגליה מ astrocytes.
  5. . היום ה -15
    1. לקחת את מבחנות מן השייקר ובמרץ לשטוף אותם עם המדיום שלהם כדי למטב את דיסוציאציה התאים ואת הקציר המספר המירבי של microglia. לאחר מכן, לאסוף את supernatant (המכיל microglia) ולהעביר לשפופרת חרוט 50 mL.
    2. לאחר מכן, להוסיף 4 מ ל טריפסין לתוך כל בקבוקון ו דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c כדי לנתק את האסטרוציטים.
    3. הוסף 5 מ ל לכל בקבוקון של בתוספת Dמאמ/F12 כדי להשבית את טריפסין. לשטוף את מבחנות עם המדיום שלהם ואת התוכן להעביר לשפופרת חרוט 50 mL.
    4. צנטריפוגה את כל הצינורות המכילים מיקרוגלייה הנתק ו אסטרוציטים ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    5. . מחק את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה מיקרוגלייה ב 1 מ ל ו אסטרוציטים ב 10 מ ל של שנוספו dמאמ/F12.
    6. המשך לספירת תאים בתוך תא נויבאואר או מונה תאים אוטומטי. לוחית את התאים עם בתוספת DMEM/F12 בצפיפות הרצויה בלוח התאים התחתון שטוח התחתונה הטבלה (מראש עבור המצורף לתא אופטימלי; ראה טבלת חומרים). התאים הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות כדי לאפשר להם לצרף.
      הערה: שריין 1.5 x 106 של כל אחד מאוכלוסיית התאים כדי לאשר את הטוהר שלהם על ידי זרימה cy, try.
    7. בצע ניתוח ציטומטרי זרימה כדי לאמת את טוהר אוכלוסיית התאים.
      הערה: אנו מחשיבים מיקרוגלייה CD11b+/cd45+/gfap- ו אסטרוציטים CD11b-/cd45-/gfap+. Iba1 ו TMEM119 כתמים עשוי להיחשב על מנת לאפיין במלואו מיקרוגלייה22.
    8. הוסף FMO (זריחה פחות אחת)23 ומדגם לא מוכתם עבור כל האוכלוסייה תא (astrocytes ו microglia) כפקדים של זרימה cy, לנסות שיטת הפעולה.
    9. עבור כל אחד מאוכלוסיית התאים, הזמינו 5x 10 תאים עבור כל הדגימות המוכתמת והבלתי מוכתמות. עבור fmo, הזמינו שתי שפופרות אחרות של מיקרוגלייה המכיל 2.5 x 105 תאים כל אחד ושמור גם שפופרת אחר של 5 x 105 astrocytes.
      הערה: מאחר שמספרי מיקרוגלייה יכולים להיות גורם מגביל, ניתן להשתמש בפחות תאים עבור פקדים בלתי מוכתמים ו-fmo.
    10. צנטריפוגה את כל microtubes ב 450 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה עם 500 μL/microtube של מאגר FACS (פוספט באגירה מלוחים (PBS) + 0.5% בסרום שור (BSA) + 2 מ"מ EDTA, pH 7.2).
    11. צנטריפוגה את כל microtubes ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה עם 100 μl/microtubes של ANTI-CD16/CD32 (שיבוט 93) (1:50) מדולל במאגר facs. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. הוסף 500 μL/microtube של מאגר FACS לתוך כל מיקרוצינורות וצנטריפוגה ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. השעיה מחדש אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מכתים צינורות וגם אסטרוציט fmo הצינור עם 50 μl/מיקרוגלייה של משטח סמנים לערבב: anti-CD45 (PE, שיבוט 30-F11) ו anti-CD11b (efluor 450, שיבוט M1/70) (שניהם מדולל ב 1:100 במאגר facs).
    13. עבור תאים שאינם מוכתמים, השהה מחדש עם אותו כמות של מאגר FACS. עבור מיקרוגלייה fmo, דגירה כל שפופרת מיקרוגלייה עם anti-CD45 או anti-CD11b. דגירה כל הדגימות ב 4 ° c עבור 20 דקות בחושך.
    14. הוסף 500 μL של מאגר FACS לכל מיקרו-צינורית. צנטריפוגה ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את supernatant ולהשעות את הגלולה עם 100 μl/microtube של מאגר קיבעון (ראה טבלת חומרים) עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    15. הוסף 500 μL/microtube של מאגר החדירות 1x (ראה טבלת חומרים) ו הדגירה ב 4 ° c עבור 5 דקות בחושך.
    16. צנטריפוגה את כל המיקרוצינוריות ב 450 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. השעיה מחדש אסטרוציטים ו מיקרוגלייה מכתים צינורות וגם מיקרוגלייה fmo צינורות עם 50 μl/מיקרוגלייה של נוגדן תאיים anti-gfap (APC, שיבוט GA5) ב 1:100 דילול במאגר החדירות 1x. עבור תאים בלתי מוכתמים ו-אסטרוציט fmo, השהה מחדש את התאים באותו כמות של מאגר facs. מודטה את כל הדגימות ב 4 ° c עבור 30 דקות בחושך.
    17. לשטוף את כל הצינורות על ידי הוספת 500 μL/microtube של מאגר חדירות 1x. צנטריפוגה את כל המיקרוצינוריות ב 450 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה מחדש כל מיקרוצינורית ב-200 μL של מאגר FACS. לרכוש 1 x 105 אירועים/מדגם על הזרימה cytometer.
    18. לצורך ניתוח, התאים חייבים להיות מגודרת הראשון על CD11b x CD45 ולאחר מכן GFAP היסטוגרמה.
      הערה: שליטה בלתי מוכתמת ובקרת FMO מועילה לקביעת השערים.

2. זיהום והערכה של שיעורי זיהום

  1. זיהום של תאים גליאל עם T. gondii
    1. צלחת 3 x 104 מיקרוגלייה או אסטרוציטים עם שיושלם dמאמ/F12 ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות בלוח מקדים 96-ובכן שטוח (ראה לוח חומרים).
    2. הדביקו כל אחד מאוכלוסיית התאים בעזרת טכיון מ -T. gondii RH זן המבטא חלבון פלורסנט צהוב (yfp) בריבוי של זיהום (משרד הבית) של 1:1 (טפיל: תא) מדולל ב 200 μl/טוב של תוספת RPMI (3% fbs + 0.16 mm פניצילין + 0.18 mm סטרפטומיצין + 12.5 MM hepes + 30 מ"מ נתרן ביקרבונט, pH 7.2) (ראה לוח חומרים). מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 48 h.
    3. לאחר מכן, למחוק את supernatant ולתקן את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של 1% פאראפורמלדהיד (התחתית) מדולל ב-PBS ב 4 ° צ' עבור 24 h.
    4. החלף את התחתית עם 100 μL/טוב של PBS ב-pH 7.2.
    5. בזהירות להסיר את supernatant ואת התאים הכתם ' גרעינים על ידי pipetting 50 μL/טוב של DAPI (5 מ"ג/mL) מדולל ב-PBS pH 7.2 (1:1000) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    6. החלף פתרון DAPI מכתים עם 100 μL/טוב של PBS (pH 7.2) ולנתח אותו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
  2. זיהום של תאים גליאל עם T. cruzi
    1. צלחת 3 x 104 מיקרוגלייה או אסטרוציטים עם שיושלם dמאמ/F12 ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 שעות בלוח מקדים 96-ובכן שטוח (ראה לוח חומרים).
      הערה: עבור כל נקודה של זיהום, להשתמש בצלחת אחרת.
    2. להדביק את התאים גליה עם טריאואסטיגוטים מ T. cruzi Y זן ב-מע של 5:1 (טפילים: תא) מדולל ב 200 μl/טוב של בתוספת RPMI ו דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 h.
      הערה: שלב זה חשוב עבור הפלישה התא על ידי הטפיל.
    3. הסר את כל supernatant ולשטוף את הבארות על ידי הוספת 200 μL/טוב של בתוספת RPMI כדי להסיר את כל טפילים מסחטות. הסר supernatant ולהוסיף 200 μL/טוב של טריים שנוספו RPMI.
      הערה: שלב זה מתכוון להסיר את כל הטפילים שלא פלשו לתאי החסיד.
    4. התאים הנגועים דגירה עבור 2 h, 48 h ו 96 h כדי להעריך את שכפול T. cruzi בתאי גליה11.
    5. לאחר כל נקודת זמן, להסיר את supernatant ולתקן את התאים עם 100 μL/טוב של מתנול עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להחליף מתנול עם 100 μL/טוב של PBS (pH 7.2).
    6. לאחר קיבעון, להכין את התאים עבור התיקון האימונוoforas כדלקמן.
      1. כדי למנוע התאמה אוטומטית, לטפל בתאים עם 100 μL/טוב של 50 mM NH4Cl מדולל ב-PBS (pH 8.0) עבור 15 דקות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μl/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).
      2. הבא, לחלחל את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של 0.5% טריטון מדולל ב-PBS עבור 15 דקות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).
      3. לאחר מכן, מודלת את תרבות התא עם 100 μL/טוב של פתרון חסימה (5% לא שומן חלב + 2% BSA מדולל ב-PBS [pH 7.2]) עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים).
      4. על מנת להכתים את amastigotes, דגירה עם 30 μL/טוב של אנטי מסחרי נוגדן חד שבטיים (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 חלבון (1:200) מדולל בפתרון חסימת עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
      5. לשטוף את התאים על ידי הוספת 100 μL/טוב של PBS ומיד להסיר אותו (לחזור על שלב זה 3 פעמים). מודלת את הצלחת עם 30 μL/היטב של הנוגדן נגד העכבר משני (1:500) מדולל ב-PBS עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
        הערה: החלבון שאינו מסחרי mAb 2C2 אנטי-Ssp-4 היה מתנה אדיבה מפרופסור ד ר רנאטו א. מורטרה מהמחלקה למיקרוביולוגיה, אימונולוגיה ו פרזיטולוגיה של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו.
      6. הסר בזהירות את הגרעין ואת גרעיני הכתם על ידי הוספת 50 μL/טוב של DAPI (5 מ"ג/mL) מדולל ב-PBS pH 7.2 (1:1000) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      7. החלף פתרון DAPI מכתים עם 100 μL/טוב של PBS-pH 7.2 ולנתח אותו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביוםה -14, התרבות של התאים הגליאל (איור 1א) עברה דיסוציאציהמכנית. אוכלוסיות מבודדות תאים נותחו על ידי הזרמת cy, לדברי CD11b, CD45 ו GFAP סמנים. אנו יכולים להתבונן טוהר של 89.5% עבור האוכלוסייה אסטרוציט ו 96.6% עבור האוכלוסייה מיקרוגלייה (איור 1B). לאחר בידוד, תאים היו מצופים בצלחת 96-היטב שטוח ואחרי 24 שעות הם היו מוכנים להידבק על ידי t. cruzi או t. gondii על פי פרוטוקולי זיהום בהתאמה. כאן סיפקנו זמן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

החשיבות של לימוד תאים גליאל מבודדים פונקציות בהקשרים ביולוגיים נפרדים התרחב בשני העשורים האחרונים. הבנה מעבר לנוירונים הוא עדיין תחום הולך וגדל בביולוגיה של התא, במיוחד תחת זיהומים או מצבים דלקתיים8,9,24. התאים glial חיוניים לא רק עבור הנוירונים תמיכה פיזית (כפי שהיה ידוע בעבר), אבל גם במצבים רבים אחרים פיסיולוגיים כגון אספקת אנרגיה תא העצב, neurometabolism, מעקב החיסונית, גיזום סינפטית, עיצוב ואפנון של הרקמה, בין אחרים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

היינו רוצים להודות לפרופסור ד ר רנאטו A. Mortara מהאוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP) עבור mAb 2C2 אנטי-Ssp-4. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מפונדסאו דה Amparo à Pesquisa do Estado דה סאו פאולו (FAPESP, להעניק 2017/25942-0 ל K.R.B.), Conselho הלאומי דה Desenvolvimento Cientfico e Tecnológico (CNPq, להעניק 402100/2016-6 ל K.R.B.), המכון הלאומי לצ דה ווקאינאס דה ואקנאס (בטלוויזיה/CNPq) וכורדניצ דה אפרטפייטןדה פאויאל מעולה (שכמיות, מימון קוד 001). M.P.A. מקבל מלגת CNPq, A.L.O.P. מקבל האחווה מ שכמיות, ו-I. S. F ו L.Z.M.F.B. מקבל מלגת מ FAPESP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
70% אתנולDinâ נציץ Quí נציץ עכשווי; חתול nea: 2231לעקר
75 ס"מ 2 בקבוקקורנינגחתול: 430720Uחומר פלסטי
96 באר צלחת תרבית תאיםגריינר CellstarCat: 655090תרבית תאים
אמוניום כלוריד (NH4Cl)Dinâ נציץ Quí נציץ עכשווי; חתול nea: C10337.01.AHהסר נוגדן אוטופלואורסצנטי
נגד GFAPAbcamCat.: ab49874אימונופלואורסצנציה נוגדן בקבוק
מסנן עליון 0.22 μ מ"מ CAקורנינגחתול: 430513תרבית מסנן בינוני
סרום בקר אלבומין (BSA)סיגמא אולדריץ'חתול: A7906FACS הכנת חוצץ
CD11b (FITC)BD PharmigenCat.: 553310נוגדן ציטומטריית זרימה
CD45 (PE)InvitrogenCat.: 12-0451-83נוגדן ציטומטריית זרימה
צנטריפוגהאפנדורףחתול: 5810Rצנטריפוגה צנטריפוגה
Eppendorf5415Rצנטריפוגה
Class II ארון בטיחות ביולוגיתPachaneCat: 200ארון בטיחות ביולוגית להליכים סטריליים
CO2 חממהThermoScientific דגם: 3110תחזוקת תאים ראשוניים
צינורות חרוטיים 15 מ"לקורנינגחתול: 430766חומר פלסטי
צינורות חרוטיים 50 מ"לקורנינגחתול: 352070חומר פלסטי
מונה תאים אוטומטישל רוזנת InvitrogenCat: C10281מונה תאים
DAPIInvitrogenCat.: D1306אימונופלואורסצנציה אנטידובי
מיקרוסקופ דיגיטלי מצלמתניקוןחתול: DS-RI1צלם תמונות במיקרוסקופ
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)GibcoCat: 12800-058מדיום תרבית תאים
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא אולדריץ'חתול: E9884FACS הכנת חיץ
F12 תערובת חומרים מזיניםGibcoCat: 21700-026מדיום תרבית תאים
FACS Canto IIBD Biosciencesציטומטר זרימהבלתי זמין
סרום בקר עוברי (FBS)LGC ביוטכנולוגיהCat: 10-bio500-1תוסף מדיום תרבית תאים
Flow Jo (תוכנה)Flow Joגרסת: זרימה Jo_9.9.4ניתוח נתונים
פלואורסצנטיאינטנסיבי ניקוןחתול: C-HGFIמקור פלואורסצנטי
GFAP (APC)InvitrogenCat.: 50-9892-82נוגדן ציטומטריה זרימה
עז - אנטי עכבר IgG (FITC)Kirkeegood& מעבדת פרי (KPL)קטלוג: 172-1806אימונופלואורסצנציה נוגדת
HBSS - תמיסת המלח המאוזנת של האנקג'יבקוחתול: 14175079מדיום תרבית תאים
HEPESסיגמא אולדריץ'חתול: H4034תוסף בינוני תרבית תאים
מאגר קיבוע ICInvitrogenCat: 00-8222-49קיבוע תאים לזרימה ציטומטריה
מיקרוסקופ הפוךניקוןדגם: ECLIPSE TS100מיקרוסקופ
IsofluraneCristá lia Cat: 21.2665הרדמה
מתנולסינת'סבשאיפה חתול: 01A1085.01.BJקיבוע לאימונופלואורסצנציה
מיקרו מריתABC נירוסטהחומר כירורגיבלתי זמין
Microtube 1.5 מ"לAxygenCat: MCT-150-Cחומר פלסטי
נוגדן חד שבטי (mAb) 2C2 anti-Ssp-4לא מסחרילא מסחריתרופת נגד אימונופלואורסצנטי
פיפטה רב-ערוצית (p200)קורנינגקאט: 751630124ריאגנטים לפיפטה
NIS Elements תוכנהNikonגרסה 4.0לרכוש ולנתח תמונות
חלב דל שומןNestléחתול: 9442405תמיסת חסימה לאימונופלואורסצנציה
חממת שייקר אורביטליתתרמו-מדעי: 481 חתול: 11ניתוק מיקרוגליה מאסטרוציטים
פרפורמלדהיד (PFA)סיגמא אולדריץ'חתול: P6148קיבוע לאימונופלואורסצנציה
PBSלא מסחרילא מסחרי מאגר ניטרלי
פניצילין Gסיגמא אולדריץ'חתול: P-7794תוסף בינוני לתרבית תאים
מאגר פרמביליזציה (10x)InvitrogenCat: 00-8333-56חדירות תאים לצלחת פטרי ציטומטריית זרימה
60 מ"מ x 15 מ"מ (חד פעמי, סטרילי)ProlabCat: 0303-8מד pH של חומר פלסטי
KasviK39-1014Bכיול תמיסת pH
RPMI 1640 בינוניGibcoCat: 31800-014מדיום תרבית תאים
מספרייםABC חתול אל חלד: LO9-W4חומר כירורגי
פיפטה סרולוגית 10 מ"לקורנינגחתול: 4101חומר פלסטי
פיפטה סרולוגית 5 מ"לקורנינגחתול: 4051חומר פלסטי
פיפטה חד ערוצית (p1000)גילסון פיפטמןחתול: F123602ריאגנטים פיפטה
יחיד ערוץ פיפטה (p200)גילסון פיפטמןחתול: F123601ריאגנטים פיפטה
נתרן ביקרבונטסיגמא אולדריץ'חתול: S6297תוסף בינוני תרבית תאים
סטרפטומיצין סולפט מלחסיגמא אולדריץ'חתול: S9137תוסף בינוני תרבית תאים
טריטון X-100סיגמא אולדריץ'חתול: T9284חדירות לאימונופלואורסצנציה
TrypsinGibcoCat: 27250-018של אנזימי עיכול
ABC נירוסטהחתול: L28-P4-172חומר כירורגי
אמבט מיםNovatecnicaדגם: 09020095לעכל רקמה ב-37 מעלות; C עם טריפסין
אור חומר דגם פינצטה

מקורות

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191(2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364(2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HBSSDMEM F12
בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.