גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

תקציר

לחץ חמצוני הוא אירוע חשוב תחת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים. במחקר זה, אנו מדגימים כיצד לכמת את המתח חמצוני על ידי מדידת מינים הכולל חמצן תגובתי (רוס) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA) כתמים בתוך סרטן המעי הגס שורות התאים כדוגמה. פרוטוקול זה מתאר שלבים מפורטים כולל הכנה של פתרון DCFH-DA, דגירה של תאים עם פתרון DCFH-DA, ומדידה של עוצמה מנורמלת. DCFH-DA כתמים היא דרך פשוטה וחסכונית לזהות ROS בתאים. זה יכול לשמש כדי למדוד את הדור ROS לאחר טיפול כימי או שינויים גנטיים. לכן, הוא שימושי לקביעת לחץ חמצוני תאי על לחץ הסביבה, מתן רמזים למחקרים מכניסטיים.

מבוא

שלושה מינים החמצן תגובתי העיקריים (ROS) המיוצר על ידי חילוף החומרים הסלולריים כי הם של משמעות פיזיולוגית הם סופראוקסיד anion, רדיקלי הידרוקסיל, ותחמוצת מימן¹. בריכוזים נמוכים, הם משתתפים בתהליכי תאים פיזיולוגיים, אבל בריכוזים גבוהים יש להם השפעות שליליות על תא איתות מסלולים¹. הגוף שלנו פיתח מערכות נוגדי חמצון, אשר יעילים נגד ROS מוגזמת. עם זאת, לחץ חמצוני יכול להתרחש כאשר רוס להציף את היכולת הרעלים של הגוף שלנו, אשר תורמת לתנאים פתולוגיים רבים, כולל דלקת, סרטן, ומחלות ניווניות^2,3,4. מטרת שיטה זו היא לקבוע הסלולר הכולל בתאי חסיד באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA) כתמים. הרציונל הוא כי חמצון של DCFH-DA כדי 2 ' -7 ' dichlorofluorescein (DCF) כבר נעשה שימוש נרחב לאיתור ROS סה כולל רדיקלים הידרוקסיל (• או) חנקן דו חמצני (• לא₂). מכונאי, DCFH-DA הוא נלקח על ידי תאים שבהם הסלולר מוחק העלים מקבוצות מרחלקסיל, וכתוצאה מכך DCFH. חמצון של DCFH על ידי ROS ממיר את המולקולה DCF, אשר פולט ירוק פלואורסצנטית באורך הגל של 485 ננומטר ו-אורך הגל של 530 ננומטר. לעומת גילוי של ניאון עם הזרימה cy, ושיטות חלופיות אחרות⁵, היתרונות של שיטה זו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית וקורא צלחת הם שהוא מייצר בבירור תמונות פלורסנט לעין, והוא קל לבצע, יעיל וחסכוני. שיטה זו היתה בשימוש נרחב כדי לזהות ROS סלולריים לחקר מצבים שונים^6,7,8. פרוטוקול זה משמש לזיהוי הכולל של ROS בתאי חסיד. שימוש בשיטה זו כדי לזהות ROS בתאים ההשעיה עשוי להזדקק לשינויים מסוימים.

פרוטוקול

1. זריעת תאים

1. זרע 2 x 10⁵ HCT116 תאים סרטניים המעי הגס לכל טוב בצלחת 24-באר ולשמור על התאים בינונית שונה של הנשר של דולבקה (dmem) לילה ב 37 ° c.
2. החלף את בינונית התרבות עם או בלי 100 μM ברזל גופרתי (FS) או 10 μM דוקסורוביצין (חמצון) המכיל בינונית ו-מודטה עבור 24 שעות.

2. הכנת התמיסה של DCFH-DA

1. התמוססות 4.85 מ"ג של DCFH-DA ב 1 מ ל של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לבצע פתרון במניה 10 מ"מ.
2. לדלל את הפתרון במניה עם DMEM מחומם מראש לתוך 10 μM פתרון עובד ממש לפני הוספתו לבארות.
3. מערבולת הפתרון עובד עבור 10 s.

3. DCFH-DA כתמים

1. הסר את התרופה המכילה בינונית ושטוף פעם אחת עם DMEM.
2. הוסף 500 μL של פתרון העבודה DCFH-DA לתוך כל טוב ומארג ב 37 ° צ' עבור 30 דקות.
3. הסר את פתרון העבודה של DCFH-DA. שטוף פעם אחת עם DMEM ו-2x עם תמיסת מלח באגירה של 1x (PBS).
4. הוסף 500 μL של 1x PBS לכל באר.

4. רכישת הדמיה ומדידת עוצמה

1. קח את התמונות הפלורסנט הנציגה עבור כל טוב באמצעות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) ערוץ על מיקרוסקופ זריחה.
2. לאחר נטילת תמונות, הסירו את PBS והוסיפו 200 μL של מאגר radioimmunoprecipitation (ריפה) לכל באר.
3. דגירה על קרח 5 דקות, לאחר מכן לאסוף תא ליפוסט לתוך 1.5 מ"ל צינורות.
4. צנטריפוגה ב 21,130 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
5. העברת 100 μL של supernatant כדי שחור 96 צלחת באר ולמדוד את עוצמת הזריחה באמצעות זריחה קורא מיקרופלייט באורך גל עירור של 485 nm ו-אורך הגל של הפליטה של 530 nm.
6. העבר 1 μL של supernatant 96 ברור צלחת הבאר המכילה 100 μL של פתרון שיטת חלבון 1x כדי למדוד את ריכוז החלבון באמצעות שיטת ברדפורד⁹.
7. הנרמל את עוצמות הקרינה הפלואורסצנטית עם ריכוזי חלבון.

תוצאות

HCT116 תאים סרטניים המעי הגס טופלו עם 100 μM FS או 10 החמצון μM כדי לגרום לחץ חמצוני⁷. כפי שמוצג באיור 1, הזריחה הירוקה הוגדלה באופן דרמטי על-ידי סה כ והחמצון כצפוי. כדי לכמת את השינוי באינטנסיביות היחסית, התאים היו לאחר לקיחת תמונות מנורמל עם ריכוזי חלבון. עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית גדלה באופן משמעותי על ידי FS או חמצון בתאי HCT116.

דיון

הפרוטוקול הניסיוני המתואר כאן הוא בקלות לעבור למדוד הכולל של הסלולר ROS. השלבים הקריטיים כוללים הפיכת פתרון DCFH-DA טרי והימנעות מחשיפה לאור, מזעור הפרעה למצב התא וכביסה נרחבת של PBS לפני נטילת תמונות. להכנת פתרון עבודה DCFH-DA, פתרון המניה צריך להיות מתווסף D, מחומם מראש לפני הוספת לתוך 24 צלחת הבאר. הסיבה היא כי הפתרונות הישנים היוצרים ברקע גבוה זריחה או חשיפה אור יוביל הלבנה. רוב המחקרים להשתמש 1 x PBS או 1x הנקס מאוזנת פתרון מלח (HBSS) כדי לדלל DCFH-DA ולהשתמש בו כמו מאגר התגובה¹⁰. עם זאת, בעת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Modified Eagle Medium Corning של Dulbecco	, קורנינג, ניו יורק	45000-304
ברזל סולפט Heptahydrate	VWR, רדנור, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL מערכת הדמיה אוטומטית	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	או כל בדיקת חלבון מיקרוסקופ פלואורסצנטי אחר
תמיסת ברדפורד	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	או כל קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי אחר