הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גרימת פגיעה חמורה בכבד חולדות באמצעות פחמן טטרכללוריד (CCl4) חשיפה באמצעות צינורית אורוקיבה

11.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60695

⸱

28 באפריל 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Ophthalmology, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה נפוצה ומקובלת לגרימת פגיעה בכבד חריפה (ALI) באמצעות החשיפה של CCl4 דרך צינור הקיבה. החשיפה CCl4 גורמת ALI דרך היווצרות של מינים חמצן תגובתי במהלך ביומרה בכבד. שיטה זו משמשת כדי לנתח את הפתופסולוגיה של עלי ולבחון אסטרטגיות hepatop, שונים.

תקציר

פגיעה חריפה בכבד (ALI) ממלאת תפקיד מכריע בהתפתחות כשל הכבד, אשר מאופיין בתפקוד כבד של בעיות כגון סיבוכים כגון אנצפלופתיה הכבד סינתזה חלבון לקויי. מודלים בעלי חיים מתאימים חיוניים לבדיקת המנגנון והפתופסולוגיה של עלי ולחקור אסטרטגיות שונות של hepatopquo. בשל יכולתה לבצע טרנספורמציות כימיות, פחמן טטרכלוריד (CCl4) נמצא בשימוש נרחב בכבד כדי לגרום ALI דרך היווצרות של מינים חמצן תגובתי. חשיפה CCl4 ניתן לבצע intraperitoneally, על ידי שאיפת, או דרך שפופרת או באמצעות צינור הקיבה. כאן, אנו מתארים מודל מכרסם, שבו עלי נגרמת על ידי חשיפה CCl4 דרך צינור הקיבה. שיטה זו זולה, מבוצעת בקלות והיא מסכנת סיכון מינימלי. המודל הוא מאוד ניתן לשימוש והוא יכול לשמש רבות כדי לקבוע את היעילות של אסטרטגיות hepatopquo פוטנציאלי ולהעריך סמנים של פציעה בכבד.

מבוא

תדירות העלבונות הרעילים לכבד, בעיקר בשל אלכוהול ושימוש בסמים, גוברת. פגיעה חריפה בכבד (עלי) קשורה לשיעורי תמותה גבוהים וגרמה לחששות קליניים1,2. פציעה רעילה מובילה למוות איתות מסלולים בכבד, וכתוצאה מכך ההיפטציט אפופטוזיס, נמק, או פירופסיס. עלי משחק תפקיד מכריע בהתפתחות כשל הכבד, אשר מאופיין בתפקוד כבד בעיות כולל סיבוכים כגון אנצפלופתיה הכבד סינתזה חלבון לקויי3,4. למרות שמחקרים אחרונים הגדילו את הידע שלנו על השינויים הפיזיולוגיים והפתולוגיים הנלווים לכישלון הכבד, הוא לא הסביר לחלוטין את התכונות הפתומקולריות המשפיעות על מנגנוני מוות התאים. יתר על כן, תרופות אינן זמינות כעת כדי להפוך את ההתדרדרות הפרוגרסיבית בחולים ALI. כיום, הטיפול האפקטיבי היחיד באופן משמעותי הוא השתלת כבד5,6.

על מנת לחקור את המנגנון ואת פתופסיולוגיה של עלי ולבדוק אסטרטגיות hepatopquo שונים, מודלים בעלי חיים שונים משמשים כדי לגרום ALI. מודל בעל חיים מועדפת של עלי לחקות את התהליך הפתולוגי של המחלה באמצעות שיטה אמינה, מאומתת, זולה וקלה להחלה. דוגמאות של מודלים ניסיוניים כוללים סוכני hepatotoxic, הליכים כירורגיים כגון סה כ כריתת העין הכוללת, מלאה או ארעי הליכים, ו-בהליכים מסוימים7,8,9. חומרים מוכרים כוללים את החומר הרעיל של גלטוסמיטין, פרצטמול, תיודרחאמיד, אזובמיתאן ו-CCl4. מאלה, ccl4 נמצא בשימוש נרחב למרות שזה עדיין לא מאופיין היטב10,11,12,13.

CCl4 הוא תרכובת נוזלית אורגנית עם ריח מתוק וכמעט ללא צבע בטמפרטורות נמוכות. חשיפה לריכוזים גבוהים של CCl4 יכול לגרום נזק למערכת העצבים המרכזית, כולל הידרדרות של הכבד והכליות. CCl4 גורם עלי באמצעות טרנספורמציה ביולוגית בכבד, אשר מהווה מיני חמצן תגובתי. זה מתרחש באמצעות האנזים P450 ציטוכרום 2E1, ויוצרים פעילות מטבוליט פעילה וכתוצאה מכך נזק לתא על ידי מקרומולקולה binding, שיפור peroxidation שומנים והפרעה של סידן תאיים הומאוסטזיס14. בנוסף, מודל CCl4 יכול לשמש כדי לעורר את האסטרוציטים ברמה של סינתזה RNA15. הפאטאוטוקסין הזה מנוהל על ידי הצפק, הפנים, דרך הפה, ודרכי העיכול16.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט CCl4המושרה עלי בחולדות באמצעות צינור הקיבה. שיטה זו מעוררת עלי החזקה והניתנת לקריאה, שניתן להשתמש בה כדי לחקור את הפתוגנזה של עלי. קביעת חומרת מחלת הכבד היא בפיקוח על ידי מדידה של הנסיוב גלוטמט-פירואמיאז (GPT), גלוטמית אוקסלואצטט טרנסאמיאז (יש) אנזימים הכולל בילירובין (TB), כמו גם אבחנה היסטולוגית סופית על ידי המטאוקסילין ואאוזין (H & E) רקמות הכבד ויטראז '. חשיפה ל-CCl4 דרך גישה התוך הקיבה מאפשר שיטה מעשית, זולה, פולשנית עם סיכון סכנה מינימלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים נערכו על פי המלצות ההצהרות של הלסינקי וטוקיו ולהנחיות לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים בקהילה האירופית. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת בן-גוריון בנגב.

הערה: דגם CCl4 נוצר ונעשה בו שימוש במחקר הקודם17. ציר הזמן של הפרוטוקול מוצג בטבלה 1.

1. הכנת חולדות להליך הניסיוני

הערה: בחירת הזכרים בוגרים מהספרג במשקל 300-350 גרם.

  1. לקבל אישור לניסויים מתוך הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש (IACUC).
  2. לשמור על החולדות בטמפרטורת החדר (22 ° c ± 1 ° צ'), עם אור 12 h ו 12 h מחזורים כהים. . לספק משקה עכברים ומים ליסיביות
  3. בצע את כל הניסויים בין 6:00 לפנות בוקר לשעה 12:00.
  4. גלח את החולדה וחטא את העור באלכוהול.

2. קביעת הסרום מגיע, מסוג GPT, ו-TB רמות בסיסיות

  1. רדמה
    1. הכינו מערכת מינהל מתמשך. כדי לגרום להרדמה תוודא שמערכת האידוי. מלאה באיזוofלבנה
    2. הלבין את החולדה. בעלת 2% הנחה ודא שהעכברוש מורדם לחלוטין על-ידי התבוננות בתנועה וברפלקס הדוושה בתגובה לגירויים חיצוניים.
      הערה: השתמש ב-1-5% בגין הרדמה ותחזוקה.
  2. . צינורית בעורק הזנב עם צנתר בסול 22
  3. לאסוף דגימת דם 0.5 mL בבסיס. ודא שנפח הדם שאוחזר אינו חורג מהנחיות IACUC.
  4. לבצע ניתוח דם ביוכימיים כולל מדידות של סרום יש, GPT ו-TB, כפי שמתואר בעבר18.
    הערה: בדיקות אנזימי כבד ורמת השחפת בוצעו במעבדה הביוכימית של המרכז הרפואי סורוקה. דגימות דם נותחו באמצעות שיטה פלואורסצנטית על מנתח כימיה (טבלת חומרים).

3. אינדוקציה של פגיעה בכבד חריפה בחולדות

התראה: חשיפה לריכוזים גבוהים של CCl4, כולל קליטה באדים או בעור, יכולים להיות השפעות שליליות על מערכת העצבים המרכזית ולגרום לניוון של הכבד והכליות. חשיפה ממושכת יכולה. לגרום לתרדמת או מוות

  1. הכינו פתרון 50% של CCl4 (לוח חומרים) על ידי ערבוב ccl4 עם שמן זית כרכב ביחס 1:1.
    הערה: הפתרון צריך להיות מוכן על פי הנחיות IACUC עבור תרכובות שאינן תרופות כיתה.
  2. הvivo על ידי מנהל CCl4 באמצעות צינורית בקיבה.
    1. הכנס צינור 16 האורוקיבה (3 ס מ עמוק) דרך חלל אוראלי של החולדה.
    2. לחשוף את העכברוש למינונים שונים של CCl4 על ידי הזרקת מזרק עם אחד מהפתרונות הבאים מדולל לתוך הבטן של החולדה: 1 מ ל/ק"ג (מתון עלי), 2.5 ml/ק ג (עלי מתון), או 5 מ ל/ק"ג (ali חמור) של 50% פתרון. לקבוצת הבקרה הפועלת באמצעות התחזות, חשפו את החולדה לשמן זית של 5 מ ל/ק"ג בלבד.

4. קביעת הסרום יש, GPT, ו TB רמות לאחר 24 שעות

  1. רדמה
    1. הכינו מערכת מינהל מתמשך. כדי לגרום להרדמה תוודא שמערכת האידוי. מלאה באיזוofלבנה
    2. לעשות את החולדות. עם 2% בלבד ודא שהעכברוש מורדם לחלוטין על-ידי התבוננות בתנועה וברפלקס הדוושה בתגובה לגירויים חיצוניים.
  2. לאסוף דגימות דם ב 24 שעות מחשיפה CCl4 .
  3. לבצע ניתוח דם ביוכימיים כולל מדידות של סרום יש, GPT ו-TB.

5. הכבד אוסף לבדיקה היסטולוגית

  1. המתת חסד על ידי החלפת תערובת הגז השראה עם 20% O2/80% CO2. ודא כי CO2 מועברת בקצב מוגדר מראש בהתאם להנחיות IACUC.
  2. להבטיח מוות על ידי בדיקת חוסר דופק ולאשר על ידי שיטה משנית בהתאם הנחיות IACUC.
  3. מניחים את החולדה על לוח מבתר עם המשטח הפנימי שלו פונה כלפי מטה והבטן פונה כלפי מעלה. . תגלח את הבטן של העכברוש
  4. עם אזמל, מפרק את האורך המלא של העור הונרום מן פי הטבעת אל הסנטר. . הפרד את העור לחלל את קיר הבטן עם אזמל מן הרקטום אל הסחוס xyphoid, חשיפת מעיים הבטן.
  5. באמצעות מספריים ומלקחיים, לבודד את הכבד על ידי מבתר אותו מן הרצועות שלה וקבצים מצורפים. החל מתוך הכבד hilum, בזהירות לבצע כריתת המעי הריאה על ידי שחרור כל האונות הכבד מפני קבצים מצורפים. מנתחים וחותכים את כל הרצועות ואת כלי הדם.
  6. . להעביר את הכבד לצלחת פטרי לתקן את הכבד בתמיסה 4% פורמלדהיד באגירה (טבלת חומרים) לפחות 24 שעות.

6. בדיקה היסטולוגית

  1. הכנה לדוגמא
    1. לאחר קיבעון, לחתוך את המדגם לתוך 5 יקרומטר סדרת פרוסה עבה על ידי הפחתת מיקרוטום.
    2. מקם בעדינות את הפרוסות על שקופיות זכוכית עם מברשת רכה, פרוסה אחת לכל שקופית.
    3. לבצע כתמים H & E כפי שתואר בעבר19.
  2. בדוק את הפרוסות מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 200x באמצעות עדשת יעד של 20 מ"מ (טבלת חומרים).
    הערה: מקטעי הכבד צריך להיות מדורגים על ידי פתולוג מיוחד עיוור לפרוטוקול הטיפול. ציון של 0 מצביע על חריגות בכבד, 1 – 2 מציין פציעה בכבד מתון, 3 – 4 מציין פציעה בכבד מתון, ו-5 – 6 מעיד על פציעה חמורה בכבד20,21,22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שחפת, יש, ורמות GPT גדל באופן משמעותי 24 שעות לאחר גרימת עלי (יותר ב-CCl4 מינונים) בהשוואה לפקדים בעלי הפעלה מזויפת (p < 0.001) (איור 1). רמות של TB, הגיע, ו-GPT בתוכנית הבסיסית היו נורמליים ולא היו שונים באופן משמעותי מאשר בקרות מופעל המזויף. ב 24 שעות, כל שלוש קבוצות התערבותית, 1 מ"ל/ק"ג CCl4 (1, 1-2), 2.5 ml/ק"ג ccl4 (3, 3-4), ו-5 מ"ל/ק"ג ccl4 (4, 4-5.75), היה ציון גבוה יותר באופן משמעותי בדירוג היסטולוגית מאשר קבוצת הבקרה המופעלת באמצעות התח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, CCl4 משמש רעלן הכבד כדי לגרום ALI בחולדות. עלי מאופיין על ידי אובדן של הכבד בתוך כימומה ולאחר הדיסתקנה של פונקציות מטבולית וסינתטי של ההכבד. תרופות, וירוסים, רעלים, מחלות אוטואימוניות, מחלות מטבוליות, ובעיות בכלי הדם כל לגרום מוות hepatocyte, ואת התגובה הדלקתית הבאה תורמת הפתוגנזה של עלי.

העלבון הראשוני לכבד מוביל לייצור cy, כימוקין שחרור, והסתננות לאחר מכן של תאים דלקתיים לתוך הכבד. שלושה מסמנים בעלי בדיקות נפוצות להערכת עלי הם GPT, יש ורמות TB. מסוג GPT ו-יש אנזימים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים מכירים בהכרת תודה את ברטה דלגדו, המחלקה לפתולוגיה, המרכז הרפואי סורוקה, הפקולטה למדעי הבריאות, אוניברסיטת בן-גוריון בנגב, לעזרתה במעבדה ובניתוח היסטולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קטטר 22 G BD Neoflon TMBecton Dickinson Infusion Therapy AB
4% תמיסת פורמלדהיד חוצץסיגמא - טכנולוגיות
BD Microtainer SST TM צינורותבקטון דיקינסון וחברה
קרבון טטרכלורידסיגמא - טכנולוגיות חומרי מעבדה של אולדריץ'CAS 56-23-5
איזופלורן, USP 100%Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-ImmunoAnalyzer Olympus (MN, ארה"ב)ניתוח דגימות הדם נעשה בשיטת הקרינה
אולימפוס BX 40 מיקרוסקופאולימפוס
RAT מחטי האכלהORCHID SCIENTIFICS
סט מזרק 1 ו-2 מ"ל MEDI -PLUSשאנדונג זיבו שנצ'ואן רפואי אינסטרומנטס ושות', בע"מ
חומרי מעבדה של אולדריץ'

מקורות

  1. Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
  2. Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
  3. Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
  4. Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
  5. Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
  6. Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
  7. Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
  8. Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
  9. van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
  10. Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
  11. Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
  12. Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
  13. Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
  14. Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
  15. Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
  16. Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
  17. Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
  18. Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
  19. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  20. Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
  21. Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
  22. Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
  23. Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver "function" tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
  24. Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
  25. Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
  26. Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חולדות Sprague-DawleyGOT GPT בנסיובבילירובין כללידירוג היסט פתולוגיצביעת Hematoxylin Eosinאסטרטגיות להגנה על הכבדניתוח אנזימי הכבד
גרימת פגיעה חמורה בכבד חולדות באמצעות פחמן טטרכללוריד (CCl4) חשיפה באמצעות צינורית אורוקיבה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.