Method Article

עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרלציה היא שינוי חשוב בחלבונים היקפיים כריכת ממברנה. תאי חרקים יכולים להיות מניפולציות כדי לייצר farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בכמויות המאפשרות מדידות ביופיזיקלי של חלבון-חלבון ואינטראקציות חלבונים-השומנים

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרלציה חלבון הוא שינוי מפתח האחראי על המיקוד חלבונים כדי ממברנות תאיים. KRAS4b, אשר מוטציה 22% של סרטן האדם, מעובד על ידי פרנוסילציה ו carboxymethylation בשל נוכחותם של ' CAAX ' מוטיב תיבת ב C-טרמינוס. מערכת baculovirus הנדסה שימש כדי לבטא farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b בתאי חרקים ותיאר קודם לכן. כאן, אנו מתארים את האפיון המפורט והמעשי של החלבון. במיוחד, שימשו כרומטוגרפיה של אהדה והחלפת יונים כדי לטהר את החלבון להומוגניות. ספקטרומטר מסה שלם ומקורי שימש לאימות השינוי הנכון של KRAS4b ולאימות מחייב של נוקלאוטיד. לבסוף, האגודה הממברנה של farnesylated ו carboxyמתילated KRAS4b ליפוזומים נמדד באמצעות ספקטרוסקופית תהודה משטח המשטח.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויי posttranslational ממלאים תפקיד מרכזי בהגדרת הפעילות הפונקציונלית של חלבונים. שינויים כגון זירחון וגליקוציה מבוססים היטב. השינויים השומנים מאופיינים פחות טוב, עם זאת. מעריכים כי ככל 0.5% של כל החלבונים הסלולריים עשויים להיות הסכם1. הפרלציה היא העברה של 15 פחמן farnesyl או 20-פחמן geranylgeranyl שרשרת השומנים לקבלה חלבון המכיל את המוטיב CAAX2. חלבונים מראש היו מעורבים בהתקדמות של מחלות אנושיות מספר כולל הזדקנות מוקדמת3, אלצהיימר4, בתפקוד הלב5, choroideremia6, סרטן7. GTPases קטנים, HRAS, NRAS, ו-קראס1, גרעיני למינציה, ו קינטומטלות cenp-E ו-F הם חלבונים מתחת למצב הבזליים. GTPases קטנים אחרים, כלומר RhoA, Rhoa, Rac1, cdc-42, ו RRAS הם geranylgeranylated ואילו Rhoa יכול להיות farnesylated או Geranylgeranylated9.

GTPase קטן KRAS4b מתפקד כמתג מולקולרי, ביסודו של דבר שידור גורם הגדילה מחילוץ איתות כדי התמרה אות תאיים מסלולים המעוררים צמיחת תאים והתפשטות, באמצעות אינטראקציות חלבונים חלבון מרובים. ישנם שני היבטים מרכזיים של KRAS4b ביוכימיה החיוניים לפעילותה. ראשית, החלבון מחזורי בין התמ ג לא פעיל ומצב פעיל של GTP שבאמצעותו הוא מעורב באופן פעיל עם העריקים. שנית, אזור C-מסוף פולי ליזין ו מעטפת ו carboxyמתילated ציסטאין להפנות את החלבון לקרום פלזמה, המאפשר גיוס והפעלה של מנוכי במורד הזרם. החשבונאי KRAS4b הוא הנהג אונגניים ב הלבלב, המעי הגס, וסרטן הריאות10, וככזה, התערבות טיפולית יהיה יתרון קליני ענק. ייצור של חלבון רקומביננטי שונה באופן אותנטי כי הוא farnesylated ו carboxyמתילמית יהיה לאפשר הקרנה ביוכימית באמצעות KRAS4b בשילוב עם מחליפים ממברנה כגון ליפוזומים או ננודיסקי ליפיד11,12.

Farnesyl טרנספראז (fnt) מזרז את התוספת של farnesyl פירופוספט ל-C-טרמינל ציסטאין במוטיב caax ב KRAS4b. לאחר הפרלציה, החלבון הוא נסחר לרשת האנדופלזמית (ER) שבה האנזים המרה (RCE1) מותיר את שלושת שאריות C-terminal. השלב האחרון בעיבוד הוא מתילציה של משקעים C-terminal החדש של הקרום על ידי חלבון הממברנה ER, isoprenylcysteine מתילגיאז (ICMT). הביטוי של רקומביננטי KRAS4b ב E. coli מביא לייצור של חלבון שלא שונו. ניסיונות קודמים לייצר KRAS4b מעובד הוגבלה בשל התשואות מספיק עבור ניסויים מבניים או תרופות ההקרנה או נכשל לכידה של חלבון בוגר באורך מלא הטבעי13,14. הפרוטוקול המוצג כאן מנצל מהונדסים baculovirus מבוסס תא חרקים מערכת ושיטת טיהור שמייצר מאוד מטוהרים, מעובד באופן מלא KRAS4b בתשואות של 5 מ"ג/L של תרבות התא.

האפיון חלבון זהיר חיוני כדי לאמת את האיכות של חלבונים רקומביננטי לפני היציאה על ביולוגיה מבנית או לימודי סינון סמים. שני פרמטרים מרכזיים של מעובד באופן מלא KRAS4b הם אימות של השינוי הנכון הסכם ואת הזמינות של farnesylated ו carboxyמתילated C-טרמינוס (FMe) לאינטראקציה עם תחליפי ממברנה או שומנים. Electrospray יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS) של KRAS4b-fme שימש כדי למדוד את המשקל המולקולרי ולאשר את הנוכחות של farnesyl ושינויים carboxyמתיל. הספקטרומטר ההמוני היליד, שבו מרססים דגימות באמצעות ממיסים שאינם משפריצו, שימשו כדי להדגים כי KRAS4b-FMe הייתה גם קשורה לקופקטור התמ ג. לבסוף, הספקטרוסקופיית תהודה של פני השטח שימש למדידת הכריכה הישירה של KRAS4b-FMe עם ליפוזומים ללא קיבוע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיהור חלבון

  1. הכינו מאגרי A – H, כפי שנראה בטבלה 1.
מאגר פתרונותסוכן באגירה (כל 20 מ"מ) pH יאסול (ממ)סרדאמיד (ממ)מיכלהשני TCEP
קצתמיכל ביטון7.3300-מיכל 51
Bמיכל ביטון7.330035מיכל 51
Cמיכל ביטון7.3300500מיכל 51
DMES6.0200-מיכל 51
EMES6.0--מיכל 51
FMES6.0100-מיכל 51
GMES6.01000-מיכל 51
Hמיכל ביטון7.3300-11
  1. הכן את חומרי הטיהור (ראה טבלת חומרים): קוקטייל פרוטאז מעכבי ללא edta או מכשירי כלים אחרים; קיבוע טור כרומטוגרפיה של זיקה למתכת (IMAC); טור כרומטוגרפיה להחלפת קטיון (CEX); המסנן 0.45 יקרומטר מזרק; 2 (pH = 7.5); ultracentrifuge מסוגל 100,000 x g; צנטריפוגה במהירות גבוהה שחקן ספסל העליון מסוגל 4,000 x g; יחידות סינון צנטריפוגליים (10 KDa NMWL); ספקטרוסקופיה מסוגל לקרוא ב 280 ננומטר; His6-וירוס איכול טבק (TEV) פרוטאז; ומכשור כרומטוגרפיה המסוגל לערבב שני פתרונות מאגר, להחיל פתרונות על עמודות, ליצור הפרעות במעבר הצבע מעמודה ולאסוף שברים מעמודות.
  2. הפשרת תאים מ ~ 2 L של תרבות תא חרקים שאוחסנו בעבר ב-80 ° c או להשתמש בתאים שנקטפו טרי. ראה ג'ילט et al. 201915 לפרטים על שורות תא החרקים tni. fnl ופרוטוקולי הביטוי. השהה מחדש בקפידה את התאים עם 200 mL של מאגר A עם הוסיף 1:200 v/v מעכב פרוטאז מבלי להציג אוויר או ליצור קצף.
    הערה: שלב 1.3 והשלבים הבאים (פרט לאמור) יש לבצע בטמפרטורת החדר (~ 22 ° c). חשוב כי המדגם להיות הומוגנית כדי לאפשר פירוק מלאה בשלב הבא.
  3. Lyse תא גלולה במיקרופלואידיצר ב 7,000 psi עבור שני מעברים או במערכת לפירוק שווה ערך. שיטות אלטרנטיביות של הליזה לא נחקרו.
  4. הבהרת תאי החרקים מהווה בעייתי בשל נוכחותם של תרכובות המצבות מסננים. לפיכך, הסתבכות (100,000 x g במשך 30 דקות ב -4 ° c) היא מאוד חשובה. יש להימנע משאריות שומנים לבנים על פני הסופרנטאנט, וניתן להסירו או להצטמצם בעזרת מטליות כותנה. לסנן את הנטייה על-ידי מסנן PES 0.45 יקרומטר. השתמש במדגם הבהיר מיד או אחסן ב-80 ° c.
    הערה: גושי שאריות מסננים במהירות ומסננים רבים עשויים להיות נחוצים. אי הקטנת הכמות של חומר זה תוביל ללחץ בחזרה על העמודה הגבוהה בשלבים הבאים.
  5. קבעו את נפח הליפוסט הבהיר והתאימו את המדגם ל-35 מ"מ, בתוספת של 2 מניות של שניים מ'. טען את הדוגמה ב-3 mL/min לעמודת ה-IMAC של 20 מ"ל (הפקודה ' השיא FF 16/10 ') מראש במאגר B עבור שלושה אמצעי אחסון של עמודות (קורות חיים).
  6. למרות שחלבון היעד הוא בדרך כלל לכמת את העמודה, עדיף לאסוף את זרימת הטור לניתוח הבא. שטוף את העמודה עד שרירי ה-Abs280 מגיעים לבסיס קבוע (< 100 מיליוליות יחידות [מאו]) עם מאגר B ב 3 מ"ל/min עבור 20 מ ל (1 קורות חיים) ולאחר מכן עבור ~ 3 קורות חיים ב 4 מ"ל/min עבור שארית שלב השטיפה. בדרך כלל, 60 – 80 מ ל של מאגר B נדרש כדי להשיג ספיגה בסיסית.
  7. Elute חלבון עם 400 mL (20 קורות חיים) הדרגתי מ מאגר B כדי מאגר C בעת איסוף של 8 מ"ל שברים. בדרך כלל, חלבון היעד חומק במחצית הראשונה של מעבר הצבע (איור 1א; לא כל השברים המאוחרים מוצגים).
  8. ניתוח שברים בחלבון באמצעות SDS-עמוד/כתמים Coomassie. הבריכה לשיא שברים ומדיזה את הבריכה לילה מול 2 ליטר של מאגר D ב 4 ° c.
    הערה: pH נמוך הוא קריטי כדי להבטיח כריכת חלבונים בשלב הבא. עם זאת, השינוי pH במהלך דיאליזה זו מתרחשת לאט, וזה צעד נוח עבור הדגירה הלילה. אסטרטגיות חילופי מאגר חלופיות (למשל, ריכוז מאגר גבוה יותר כדי להאיץ את שינוי ה-pH) לא נחקרו. החלבון יתחיל לזרז לאט במשך הזמן בריכוזים נמוכים יותר ובריכוזי מלח נמוכים וכמות קטנה של משקעים היא נורמלית במהלך שלב זה. בגלל זה, אנחנו נמנעים מלהחליף את החוצץ 100 mM הכרחי לכריכה לטור הבא במהלך דיאליזה. במקום זאת, ריכוז של 200 מ"מ משמש לדיאליזה והחלבון מדולל ב-100 מ"מ (ראה להלן) מיד לפני היישום לטור. לא חקרנו אם המשקעים האלה הם ספציפיים לKRAS4b, אבל החלבון שעושה את הזרז מאומת כ-KRAS4b-FMe. על-כן, אנו מציעים להשתמש בריכוז הגבוה יותר במאגר הדיאליזה של כל חלבון מעניין כאמצעי זהירות עד שניתן יהיה לקבוע את יציבותה של חלבון היעד במאגר הכריכה.
  9. הסר את המדגם מדיאליזה וצנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות כדי להסיר את כל הזרז. Dialyzed הסופי, המדגם הבהיר בשלב זה הוא עדיין מעורפל לעתים קרובות, אבל ניתן להחיל ללא עיבוד נוסף על העמודה הבאה CEX.
  10. הכינו טור בורסה 20 מ ל (ראה טבלת חומרים) על-ידי שטיפת קורות החיים של מאגר G, ואז עם שלוש קורות של מאגר F.
    הערה: בעוד אנחנו לא העריכו בקפדנות אחרים שרפים, מספר עמיתים מצאו החלטה גרועה עם שרפים אחרים מאשר שרף ביצועים באיכות גבוהה בספרד.
  11. לדלל 20 מ ל של דגימת דיאליזה לריכוז הסופי של 100 mM על ידי הוספת 20 מ ל של מאגר E ולהחיל את המדגם מדולל לטור חילופי הקטיון.
  12. המשך לטעון את העמודה על-ידי הוספת דגימות טריות מדולל שהוכנו כמתואר לעיל צינור עומס כמו דילול הקודם הוא מתקרב לסוף העומס.
    הערה: דילול המדגם כולו בבת אחת 100 מ"מ הביא לאובדן משמעותי של חלבון היעד בשל משקעים.
  13. לשטוף את העמודה הבסיסית Abs280 עם מאגר F. זה בדרך כלל דורש 3 קורות חיים. החלבון הוא חומק מן העמודה במהלך 400 mL (20 קורות חיים) הדרגתי מ-מאגר F כדי 65% מאגר G, שנאסף 6 מ"ל שברים (איור 1B).
  14. המשך לשטוף את הטור בתוספת 1.5 קורות חיים נוספים (65% מאגר G) לאחר השלמת מעבר הצבע. לבחור שברים חיוביים בהתבסס על שני SDS-עמוד/Coomassie כחול ניתוח הכתם ובדיקה של סימן UV של כרומטוגרמה.
    הערה: מעקב ה-UV מכיל בדרך כלל חמש פסגות. החל בריכוזים נמוכים של מלח, הפסגה הראשונית היא בדרך כלל לא מעובד ו/או חלבון הפרוטפוליל. הפסגות השנייה והשלישית הן תערובת של שתי צורות של חלבון מעובד: הפסגה השנייה היא בעיקר ביניים בינונית (FARN), בעוד השלישי הוא בעיקר חלבון FMe מעובד במלואו של הריבית. פסגות ארבע וחמש לייצג His6-MBP-KRAS4b היתוך חלבונים (כל החלבון הוא בפורמט זה בשלב זה, כמו העיכול לא התרחשה במצב של TEV). אלה אינם N-acetylated בתחנה הסופית והינם פרציום (שיא ארבע) ו-farnesylated ו carboxy ated (שיא 5) ב C-טרמינוס. כמו שיא 2 ושיא ארבע יפיק חלבונים זהים לאחר הסרת תגים (כלומר, KRAS4b-FARN) אלה ניתן למאגר בשלב זה אם תרצה. באופן דומה, שיא שלוש והפסגה ניתן לשלב כדי לייצר הרבה בודד KRAS4b-FMe (איור 1B, איור 2). עם זאת, מומלץ לבצע איגוד זה רק כאשר מאומת החלבון בפסגות הנפרדות אושרה.
  15. לעכל את החלבון ממאגר בשלב 1.15 עם His6-TEV פרוטאז (~ 200 μg של פרוטאז/mL של המדגם.
    הערה: אנו עושים His6-TEV פרוטאז באמצעות פלסמיד ופרוטוקולים הזמינים Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialyze התקציר TEV נגד מאגר A (10 הצינור הדיאליזה kDa MWCO עם מינימום של 40 mL של מאגר A ל-mL של מדגם) עבור 2 h בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לילה ב 4 ° c.
  16. לאחר העיכול והדיאליזה, טען את החלבון ישירות לעמודת ה-IMAC של 20 מ ל עם מאגר A ב-3 מ ל/דקה.
    הערה: לאסוף 7 מ"ל שברים במהלך זה כרומטוגרפיה כולו, כי חלבון היעד יש זיקה נמוכה לעמודה, אבל לא יכול להיות מאוגד לחלוטין שרף. שטוף את העמודה ב-3 מ ל/דקה עם מאגר A לסכום כולל של 3 קורות חיים או עד שתגיע לספיגה בסיסית.
  17. חלבון היעד הוא חומק עם 5 קורות חיים הדרגתי של מאגר C מ -0% – 10%, איסוף 7 מ ל שברים. כאמצעי זהירות, חלבונים מאוגדים נוספים ניתן להתחמק עם 100% מאגר C. שברים חיוביים מזוהים לאחר ניתוח של SDS-PAGE (איור 1ג). בדרך כלל, חלבון היעד חומק מריכוז נמוך של סרדיאזול (כלומר, ב-0% – 10% מאגר C), אך לפעמים חומק משטף הזרימה או הטור.
  18. Dialyze הבריכה האחרונה נגד מאגר H לקבוע את ריכוז החלבון על ידי ספקטרופוטומטר ב 280 nm.
    הערה: הקפד להתחשב בקיומו של הנוקלאוטיד בעת קביעת מקדם המחיקה לשימוש עבור חישוב זה.
  19. החלבון יכול להיות מרוכז ~ 2 – 5 מ"ג/mL באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי (10 K NMWL) ללא אובדן חלבון משמעותי. סנן עם מסנן מזרק μM 0.22. למדוד את ספיגת הפתרון ב A280 כדי לחשב את ריכוז החלבון הסופי (איור 1ד). הצמד להקפאה בחנקן נוזלי ואחסן דגימות קפואות ב-80 ° c.
    הערה: מטהר החלבון מאוגד להתל ג. KRAS4b-FMe ניתן להחליף לתוך GppNHp באמצעות פרוטוקולים שפורסמו בעבר16.

2. הכנה לדוגמא לניתוח מסה ללא שינוי וניתוח מסה

  1. הכנה לדוגמא לניתוח מסה ללא שינוי
    1. הפשרת דגימת חלבון על הקרח לפני הניתוח. עבור ניתוח מסה שלמה, לדלל את החלבון 0.1 mg/mL ב 20 מ"מ אמוניום ביקרבונט (pH = ~ 8.4). עבור ניתוח המוני יליד, לדלל את החלבון לריכוז של 0.1 mg/mL ב 50 mM אמוניום אצטט (pH = ~ 7.5). מערבולת כל מדגם עבור 5-10 s, אז צנטריפוגה ב 12,500 x g עבור 1 דקות כדי גלולה כל חומר מוצק בפתרון. הסר 10 – 20 μL של כל supernatant ולהעביר לבקבוקון זכוכית אוטומטית. כובע כל בקבוקון הדוק כדי למנוע זיהום או אידוי.
      הערה: עבור ניתוח מסה ללא שינוי או ניתוח מסה מקורית, המדגם עשוי להיות התפלה לפני ניתוח באמצעות 10 kDa MWCO ממברנה תאית מסנן כדי להחליף מאגר לתוך מאגר הדילול הסופי.
  2. הכנת ספקטרוסקופיית מסה מורחבת לניתוח מסה
    הערה: לפני הפעלת כל ניתוח על ספקטרומטר המסה, ודא שהוא מכויל לאחרונה. כמו כן, תמיד ללבוש כפפות וציוד הגנה אישי אחרים לפי הצורך כדי למנוע כימיקלים מזיקים וכדי להימנע דגימות מזהם וממיסים. כיול נעשה באמצעות פתרון כיול השיג מסחרית 2 מ"ג/mL צסיום יודיד פתרון מוכן ב-house.
    1. פתח את תוכנת הניתוח וטען את קובץ שיטת הכלים המתאים. עבור ניתוח מסה שלמה של חלבונים KRAS4b, הפרמטרים המתחילים המתאימים הם כדלקמן: מצב חיובי של זיהוי; שלושה מיקרוסריקות, רזולוציה = 70,000; היעד AGC = 3e6; זמן אינטגרציה מרבי = 200 אלפיות הראשונה; וטווח סריקה = 70 – 1800 יחס מסה לתשלום (m/z). עבור ניתוח המוני יליד KRAS4b חלבונים, הפרמטרים המתחילים מתאימים הם כדלקמן: מצב חיובי של זיהוי; 10 מיקרוסריקות, רזולוציה = 17,500; in-מקור התנגשות הנגרמת דיסוציאציה (CID) = 20 eV; היעד AGC = 3e6; אנרגיה התנגשות (לסה נ) = 20; זמן אינטגרציה מרבי = 200 אלפיות הראשונה; וטווח סריקה = 500-10000 מ/z.
  3. הכנת ממיסים כרומטוגרפיים וטורים
    1. הכן את ממיסים הנחוצים. לניתוח מסה שלם ממיס A היא מים עם חומצה פורמית 0.1%. ממס B הוא 80% acetonitrile ו 0.1% החומצה פורמית במים.
    2. הכינו את הממיסים הנחוצים לניתוח המסה הטבעית. ממס A הוא 0.1 M אמוניום אצטט במים ממס B הוא מים.
    3. לאחר ממיסים המתאים מוכנים, לטהר את המערכת כך אבובים הוא מלא ממיסים המתאים וכל בועות האוויר יוסרו מן הקווים.
    4. התקן את העמודה המתאימה (עמודת שלב לאחור עבור ניתוח מסה שלם ועמודת החרגת גודל עבור ניתוח המסה הטבעית). לצורך ניתוח מסה שלם, קצב הזרימה הוא 0.5 mL/min, וטמפרטורת העמודה (באמצעות חימום העמודה) היא 50 ° c. משקל העמודה עבור 15 – 20 דקות. עבור ניתוח המסה הטבעית, קצב הזרימה הוא 0.25 mL/min.
      הערה: עקוב תמיד אחרי הלחץ האחורי של העמודה כדי לוודא שהוא אינו עולה מעל הגבול העליון, שיכול להצביע על קו סתום או על מטריצת העמודות. החלף את העמודה במידת הצורך.
  4. ניתוח לדוגמה
    1. מניחים את דגימת החלבון המוכן בבקבוקון זכוכית בקבוקון אוטומטי לתוך מדף הבקבוקון המתאים באמצעות מערכות LC תעשיה. צור רשימה של מדגם בתוכנית התוכנה עם שיטת המכשיר המתאימה לניתוח הרצוי. לאחר השלמת רשימת המדגם, לחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל בניתוח.
    2. הכנס 1 – 2 μL של דגימה לכל ניתוח, עם מים ריקים לפני ואחרי כל מדגם, כדי להבטיח שלא לבצע את הביצוע.
      הערה: ניתוח המסה ללא שינוי שונה מאוד מניתוח המסה המקורי ודורש הגדרות שונות של שיטות מכשירים. זה בגלל שבניתוח המסה השלם, החלבון הוא "רגוע" בנוכחות של ממיסים אורגניים, ולכן הוא מסוגל לקבל עוד חיובים. קל יותר לפרק ולפתור את התפלגות האיזונושא של מצבי הטעינה. ניתוח המסה הטבעית מספק התפלגות מטען צרה של יוני החלבון, ומבוסס על החלבון, מחייב הגדרות מתח ואנרגיה שונות.
  5. ניתוח נתונים ופירוק חלבונים
    1. לייצא את הספקטרום של המדגם לתוכנה שבה ניתן להפוך את הספקטרום דה מפותל שיציג את המסה שלמה (או המסה הטבעית) של החלבון. המסה ללא שינוי תהיה התפלגות השיא איזוטרופי בשל שפע גבוה של פסגות ספקטרליות טעונה. המסה יליד בדרך כלל יש פסגות מעט מאוד בשל השפע הנמוך של פסגות ספקטרלי טעונה (איור 3ד).
    2. הרחב את טווח יחס המסה-לתשלום (m/z) של הפסגה כדי לוודא שהמסה הנמדדת עקבית עם המסה החזויה. לעיתים, עקב הוספת חיובים לחלבון, ייתכנו וריאציה קלה בין המשקל המולקולרי הצפוי (MW) לבין ה-MW הנצפה. כמו כן, בדומה לניתוחים רבים של ספקטרומטר המסה, כגון נתרן יכולים לתרום למראה של פסגות נוספות בנתונים, אפילו עם דגימות התפלה בקפידה. פסגות שופע נמוכות יותר עם m/z הנמוכה מהצפוי לפעמים נצפו. זה קרוב לוודאי בשל אובדן נייטרלי, שהוא אובדן של קבוצה תפקודית בשל תהליך היינון.
      הערה: כצפוי, יהיו הבדלים בין המסה השלמה לבין פסגות ההמונים הילידים. צג המסה ללא שינוי יראה את ה-MW הצפוי של החלבון. זה לא יהיה מגוואט נוסף של נוקלאוטיד המצורפת או שינויים אחרים. עם זאת, השיא ההמוני יליד יציג את החלבון עם כל נוקלאוטיד הוסיף.

3. ואלידציה של כריכת KRAS4b-FMe ליפוזומים

  1. הכנה ליפוזומים ממברנות
    1. הכינו מאגר המורכב מ-20 מ"מ HEPES (pH = 7.3), 150 מ"מ, ו-1 מ"מ TCEP.
    2. ליפופי חומרים הכנה כוללים 25 מ"מ 1-palmitoyl-2-oleoyl-גליקו-3-פוספהוניל (POPC) ו 10 מ"מ 1-palmitoyl-2-oleoyl-גליטינואו-3--פוספהו-L-סרין (פופס) מניות ב כלורופורם; מכבש השומנים להגדיר עם מחזיק והסקה בלוק; גז ארגון וחנקן נוזלי; אמבט אולטרה-סאונד; מבחנות ברגים מזכוכית עם ליינפי קצף; וקורא צלחות המסוגל לזיהוי פיזור אור דינמי.
    3. הפשרה מניות השומנים ב כלורופורם בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. להכין 1 מ ל של 5 מ"מ 70:30 POPC: ליפוזומים פופס על ידי aliquoting 106 μL של 25 mM POPC (מניות) ו 118 μL של 10 מ"מ פופס (מניות) לתוך בקבוקון זכוכית.
      הערה: אין שומנים עם טיפ פלסטיק, כי הכלורופורם יכול לפזר טיפים פלסטיים מסוימים.
    4. שומנים יבשים תחת זרם קבוע של גז הארגון. סובב לאט את בקבוקון הזכוכית כשאתה מחיל את גז הארגון כדי ליצור שכבה דקה של סרט יבש.
    5. שימו דגימות מתחת לליאופליייזר ואקום כדי להסיר כלורופורם עודף.
    6. ליצור מחדש את השומנים על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר לסרט מיובש ומערבולת התערובות עבור 5 דקות. מייבשים את תערובות השומנים על ידי נדנוד עבור 1 h ב -25 ° c.
      הערה: המדגם יהיה מאוד נחל דלוח עם תוספת של המאגר לשכבת הסרט מיובש של שומנים.
    7. בצעו חמישה מחזורי הקפאה/הפשרה באמצעות הצבת מיכל המדגם בין מי קרח (4 ° צ' או נמוך יותר) לבין אמבט מים חמים (25 ° צ' ומעלה).
    8. מניחים את הבקבוקון לדוגמה באמבט אולטרה סאונד ומsonicate את המדגם עבור כ 0.5 h או עד המדגם הופך למחצה.
    9. הבלטת הדגימות באמצעות מכבש השומנים. הכנס את ערכת ההבלטה כפי שמוצג בהוראות היצרן. הבלטת הדגימות באמצעות נייר סינון של 0.1 יקרומטר. לטעון את הדגימות לתוך מזרק זכוכית אחת ולצרף אותו לקצה אחד של מנגנון ההבלטה. הוסף מזרק ריק בקצה השני של מנגנון ההבלטה. דחף הלוך ושוב 10 – 20x עד הדגימות שלך להפוך לשקוף לחלוטין.
    10. ספין את הדגימות הסופיות עבור 30 דקות ב 20,000 x g כדי להסיר את כל האגרגטים גדולים.
    11. השתמש בפיזור אור דינמי (DLS) כדי לקבוע את הגודל וההומוגניות של הליזומים (אופציונלי). מקום 30 μL של ליפוזומים לתוך הקורא 384 צלחת טוב. ספין הצלחת ב 1,000 x g עבור 30 דקות. מקום הצלחת לתוך קורא צלחת ולאסוף 10 מדידות פיזור אור.
  2. כריכת KRAS4b-FMe ליפוזומים באמצעות משטח תהודה ממשטח (SPR)
    1. להרכיב את החומרים הנדרשים: מכשיר SPR; שבב חיישן L1; 7 x 14 מ"מ צינורות בקבוקון; ובחורים.
    2. הכינו מאגר המכיל 20 מ"מ HEPES (pH = 7.3), 150 mM הנאקל, 1 מ"מ TCEP. הכינו סדרת דילול 2:1 KRAS4b-FMe מ 60 μM – 0.06 μM בנפח כולל של 200 μL (10 הכולל כולל). העבר את הדגימות האחרונות מדולל לתוך צינורות בקבוקון (ראה טבלת חומרים), מניחים את צינורות המבחנה לתוך ארון תקשורת, ולהכניס את הדגימות לתוך כלי spr.
    3. הכנס את שבב החיישן L1 לתוך כלי SPR. חבר את המאגר ואת הממשלה המערכת עם מאגר עבור 7 דקות.
    4. הגדר שיטה אוטומטית באופן הבא:
      1. הגדר את טמפרטורת המכשיר ל-25 ° c.
      2. הפעל את שבב החיישן L1 על ידי שטיפה אותו עם 2 1 דקות זריקות של 20 מ"מ בחורים הומס במים ב 30 μL/min קצב זרימה.
      3. ביצוע מחזורי סטארט-up של 10 1 דקות זריקות של מאגר פועל למים את משטח השבב.
        1. הפקדה את ליפוזומים על שבב החיישן L1 על ידי הזרקת ליפוזומים על תא הזרימה (FC)-2 של שבב L1 עם 2 דקות זריקות ב 5 μL/min. Aim עבור רמת לכידה של לפחות ~ 3,000 יחידות תגובה (רוס).
          הערה: הגדל את זמן ההזרקה עד שתשיג את רמת הלכידה המתאימה.
      4. הכנס שלושה מחזורים של מאגר על שני FC-1 ו-FC-2 עם 1 דקות זריקות ב 30 μL/min.
        1. הכנס את מKRAS4b השונים לסדרת הריכוז הגבוהה ביותר. הכנס את החלבונים באמצעות הזרקת 1 דקות עבור שלב השיוך ו-2 מינימום זריקות עבור שלב הדיסוציאציה בקצב הזרימה 30 μL/min בשני FCs.
        2. צור מחדש את שבב החיישן L1 על ידי שטיפה אותו עם 2 1 דקות זריקות של 20 מ"מ בחורים ב 30 μL/min.
    5. התאם את הנתונים באמצעות תוכנת ההערכה SPR באמצעות מודל כריכה של אתר אחד כדי לקבל התאמה מחייבת לכאורה (עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת הסבר על התאמת נתונים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד המשתנים הגדולים ביותר בפרוטוקול הוא כמות חלבון היעד המבוטאת (His6-MBP-tev-KRAS4b). פרוטוקול זה פותח באמצעות לבודד מתוך קו משולש החוליה הטריקוזוולי , tni-fnl17, המותאמים לצמיחה ההשעיה והוא שואף מנסיוב. בהינתן מגוון רחב של תוצאות שדווחו על פני הקווים השונים תא חרקים עם מערכת הביטוי baculovirus, רצוי Tni-FNL לשמש, לפחות בתחילה, כדי לייצר KRAS4b-Fnl.

חלבון כהה שנודד ~ 65 kDa צריך להיות ברור בתוך שברי ליפוסט, כמו גם את השברים להתחמק (איור 1<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאמור בסעיף תוצאות הנציג, הצעד הקריטי ביותר במהלך הטיהור הוא טיפול במדגם במהלך הזמן שהוא במלח נמוך. הגבלת הזמן שהמדגם נחשף לפחות מ-200 מ"מ והוא יסייע להפחית משקעים ולהגדיל את התשואה למדגם. פענוח תוצאות CEX יכול להיות קשה אם הפרופיל אינו תואם את הציפיות (ראה איור 2). עד שהפרוטוקול הופך לשגרה, מומלץ להקפיד על שברים שאינם נלקחים קדימה מאוחסנים ב-80 ° c עד להשלמת ניתוח המסה ללא שינוי, כדי להבטיח שהחומר הנכון נלקח קדימה. מחוץ לפרמטרים שצוינו לעיל עבור ה-CEX, הפרוטוקול קל יחסית לשנות את שלבי הליזה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים שיבוט והבעה תמיכה מקאריסה Grose, ג'ן Melhalko, ו מאט דרו במעבדת ביטוי חלבון, פרדריק המעבדה הלאומית לחקר הסרטן. פרויקט זה ממומן במלואו או בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה לא. HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, וגם לא מזכיר שמות מסחריים, מוצרים עסקיים או ארגונים המזכירים אישור ממשלת ארצות הברית

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 מ"ל צינורות נעילה בטוחה,22363204אפנדורף
11 מ"מ Cl SS הכנסה משולבת בקבוקוני דגימה אוטומטית ThermoScientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)שומנים קוטביים של AVANTI850457 לרכוש כמניות נוזליות בכלורופורם
1-פלמיטויל-2-אולויל-גליצרו-3-פוספו-L-סרין (POPS)AVANTI POLAR LIPIDS840034 לרכוש כמניות נוזליות בכלורופורם
5427R צנטריפוגהEppendorf
Acetonitrile, HPLC GradeFisher ChemicalA998-1 1L
אמוניום אצטטסיגמא-אולדריץ'09689-250 גרם
גזארגון AirgasARUP
צלחת בדיקה 384קורנינג3544
Biacore T200 מכשירGE Healthcare
כחול Snap-It אטמים, T/SThermo ScientificC4011-54B
ברנסון אולטרסאונד אמבטיהתרמו פישר15-336-1000
קטיון חילופי כרומטוגרפיה (CEX) טורGE Healthcare מדעי החיים29018183HiPrep SP Sepharose ביצועים
גבוהים CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro קורא צלחותWyatt Technologies
Exactive Plus EMR ספקטרומטר מסהתרמו מדעי
חומצה פורמיתסיגמא-אולדריץF0507-500 מ"להשתמש בבקבוקוני מגיב או טוב יותר
בקבוקוני גילסון 7x14 מ"מ צינורותGE HealthcareBR-1002-12
בקבוקוני בורג זכוכית עם ספינותקצף PTFEהתמחויות מדעיותB69302
צנטריפוגה במהירות גבוהה/שולחןThermo Fischer Scientific05-112-114Dהמסוגל עד 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) פרוטאזAddgene92414מטוהר לפי Raran-Kurussi et al. (2017) הסרת תגי זיקה עם TEV פרוטאז. בתוך: ברג'ס-בראון נ '(עורכים) ביטוי גנים הטרולוגי ב- E.coli. שיטות בביולוגיה מולקולרית, כרך 1586. Humana Press, ניו יורק, ניו יורק
עמודה כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית (IMAC) GEHealthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
אספקת מים פנימית, התנגדות Arium AdvanceSartorius Stedimשל 18 MΩ
סט מכבש ליפידיםAVANTI POLAR LIPIDS
גז אוויר חנקן נוזליNI-DEWAR
M110-EHמיקרופלואידיזר מיקרופלואידיקס
MabPac RP UHPLC עמודה, 4 אום, 3.0 x 50 מ"מThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 עמודה, 5 אום, 300 Å, 2.1 x 150 מ"מThermo Scientific088790
MagTran תוכנהתרמו מדעי
מתנול, HPLC כיתהVWR כימיקליםBDH20864.400
NGC מערכת כרומטוגרפיהBioRad78880002NGC QuestTM 100 מערכת כרומטוגרפיה
קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA או כלאטורים אחריםMillipore SigmaP8849
מכסי גומי סוג 3GE HealthcareBR-1005-02
סדרת S חיישן שבב L1GE Healthcare29104993
ספקטרופוטומטרתרמו פישר מדעי13-400-519ספיגת 280nm
אולטרה-15 יחידות מסנן צנטריפוגלי, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES ממברנה
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 מ"ל מסנני צנטריפוגהAmiconUFC501024
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה - L80Kמסוגל ל-100,000 xg
Vanquish UHPLC (משאבה, לב עמודים ומערכת LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
מים, HPLC GradeSigma-Aldrich270733-1Lעשוי להשתמש במקור מים פנימי (ראה להלן)
מזרק Whatman GD/XP PES 0.45 מ"מ filterGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificתוכנת פרוטאומיקה
טבעי' 0 ס"מ עם מחזיק 610023

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758(2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79(2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles