3d-DNA דגים ססגוניות מייצג כלי להמחיש המקום גנומית מרובים בתוך גרעיני תלת-ממד משומרים, חד משמעית הגדרת אינטראקציות הדדית שלהם לוקליזציה בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור קשת רחבה של תאים ראשוניים אנושיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
השאלה העיקרית בביולוגיה התא הוא ארגון גנומית בתוך החלל הגרעיני וכיצד אדריכלות כרומטין יכול להשפיע על תהליכים כגון ביטוי גנים, זהות תא ובידול. גישות רבות שפותחו כדי ללמוד את ארכיטקטורת 3D של הגנום ניתן לחלק לשתי קטגוריות משלימות: לכידת כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידה (C-טכנולוגיות) והדמיה. בעוד הראשון מבוסס על לכידת קונפורמציה כרומוזום ואינטראקציות DNA האבובית באוכלוסייה של תאים קבועים, האחרון, מבוסס על הזריחה DNA באתרו היברידיזציה (דג) על גרעיני תלת-ממד, מאפשר הדמיה עכשווית של הילה מרובים ברמת תא בודד (ססגוניות), בחינת האינטראקציות שלהם והפצה בתוך הגרעין (3d דג DNA מרובה צבעים). הטכניקה של 3D דג ה-DNA מרובת צבעים יש מגבלה של המחשה רק כמה מראש מראש, לא מאפשר ניתוח מקיף של האדריכלות הגרעינית. עם זאת, בהינתן את החוסן של תוצאותיה, 3D מרובת צבעים דג DNA בשילוב עם 3D-מיקרוסקופיה ושחזור תמונה היא שיטה אפשרית כדי לאמת את התוצאות C-טכנולוגיה מבוססת לחקור באופן משמעי את המיקום והארגון של המקום המסוים ברמת תא בודדת. כאן, אנו מציעים צעד אחר צעד שיטה של 3D מרובת צבעים דג DNA מתאים למגוון רחב של תאים הראשי האדם ולדון בכל הפעולות המעשיות, צעדים מכריעים, מושגים של 3D הדמיה וניתוח נתונים הדרושים כדי להשיג מוצלח אינפורמטיבי 3D תלת-צבעי דגי דנ א בתוך הקשרים ביולוגיים שונים.
מבוא
Eukaryotes גבוה יותר צריך לדחוס באופן שיטתי וקומפקטי כמות עצומה של מידע גנטי ברגע 3d החלל של הגרעין1,2,3,4. היום, אנו יודעים כי הגנום הוא מרחב הורה בתאים ותחומים הקשורים טופולוגית5 וכי רמות מרובות של קיפול DNA ליצור קשרים בין אזורים גנומית שונים שעשויים לכלול לולאה כרומטין היווצרות6,7. הלולאה הדינמית 3d של כרומטין יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים שונים כגון שעתוק8,9, בידול ופיתוח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה לבדיקת דנ א והליכי תיוג עם ניק תרגום
- לטהר ולנקות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACs), פלמידים או מוצרי PCR עם ערכות ספציפיות (טבלה של חומרים), להשעות מחדש ב ddh2O, בדוק על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose וככמת.
- לבצע את התרגום ניק על 1.5 ליטר 2 μg של ה-DNA משלב 1.1 בנפח הסופי של 50 μL על ידי ערבוב כל ריאגנטים ב 0.5 mL מחייב נמוך שפופרת DNA לפי לוח 1.
הערה: בדיקה מתויג ישירה יכולה לשפר את האות ליחס הרעש. ערכות לייצר בעקיפין ובאופן ישיר מתויג בדיקה עם מגוון fluorochromes אלקסה על ידי ניק תרגום הם מסחרית זמין. - שילוב התרגום ניק במיקסר תרמית ב -16 ° c במשך זמן תלוי באורך של חומר ה-DNA המתח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השיטה של 3D דג ה-DNA דגים תיאר במאמר זה מאפשר הדמיה עכשווית של הרוח גנומית שונים בתוך שנשמרו גרעיני תלת-ממד (איור 1B). פרוטוקול זה מתיר את מדידת המרחקים בין האללים, ובין גנומית שונים כדי להעריך את קרבתו המרחבית, ולאמוד את מיקומם בתוך החלל הגרעיני (למשל, מרחק המקום מן הסנטאיד או הפריפריה של הגרעין)16. עם זאת, ישנם שלבים קריטיים רבים שחייבים להיות מוגדרים במדויק ובמיוחד עבור כל סוג תא המשמש; מומלץ מאוד להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבים הבאים להצלחה של 3D דג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה הנוכחית מתארת את הפרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע דג DNA תלת-צבעי תלת-ממדי על מגוון רחב של תאים ראשיים אנושיים. למרות שדגי ה-dna הוא טכנולוגיה בשימוש רחב, 3d דג ה-dna דגים על שנשמרו גרעיני interphase תלת-ממד עדיין קשה לבצע במעבדות רבות, בעיקר בשל המאפיינים של דגימות בשימוש23,24.
בדיקה ניק תרגום הוא צעד בסיסי עבור מוצלח 3D-DNA דג מרובה צבעים; מצעים שונים רבים (BAC, fosmid, פלאמיד, PCR מוצרים) ניתן להשתמש בתגובה זו, ואת העיתוי של התגוב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מכירים בסיוע הטכני של מתקן הדימות INGM (המכון הפוליטכני של המרכז הטכנולוגי "רומיאו אד אנריקה" (INGM), מילאנו, איטליה), במיוחד C. Cordiglieri, לקבלת סיוע במהלך 3D תמונות דג DNA מרובת צבעים רכישת. עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים כדי לבי: התוכנית הדגל האיטלקי epigen, האגודה הצרפתית דשנה Myopathies (afm-שידור, גרנט nr 18754) ו ג'ובאני ricercatori, משרד הבריאות האיטלקי (GR-2011-02349383). עבודה זו נתמכת על ידי המענק הבא פ: Fondazione קאריפלו (באנדו ג'ובאני, גרנט nr 2018-0321).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחות 24 בארות | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| צלחות 6 בארות | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| ביוטין 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (אלבומין בסרום בקר) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| חומצות דאוקסיריבונוקלאית גדיל יחיד מאשכי סלמון | Sigma | D7656 | |
| דקסטרן סולפט (אבקה) | סנטה קרוז | sc-203917A | |
| דיגוקסיגנין 11 d-UTP | רוש | 11093088910 | |
| DMEM | תרמו פישר סיינטיפיק | 21969-035 500 מ"ל | |
| DNA פולימראז I | תרמו פישר סיינטיפיק | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| אתנול | סיגמא | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| תמיסת פורמלדהיד | Sigma | F8775-25 מ"ל | |
| פורממיד | סיגמא | F9037 | |
| גלוטמין | תרמו פישר Scientific | 25030-024 100 מ"ל | |
| גליצרול | סיגמא | G5516-100 מ"ל | |
| גליקוגן | תרמו פישר סיינטיפיק | AM9510 | |
| HCl | סיגמא | 30721 | |
| cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| אינסולין סיגמא אנושי | I9278-5 מ"ל | ||
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (נתרן אצטט, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט) | Sigma | P4417 | |
| פניצילין/סטרפטווידין | תרמו פישר סיינטיפיק | 15070-063 100 מ"ל | |
| פפסין | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA ערכת | Sigma | NA0100-1KT | |
| תמיסת פולי-L-ליזין | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade | Mountant Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink מיצוי ג'ל מהיר & PCR טיהור קומבו ערכת | תרמו פישר מדעי | K220001 | |
| PureLink מהיר פלסמיד מיני-פרפ ערכת | תרמו פישר סיינטיפיק | K210010 | |
| RNAse קוקטייל | תרמו פישר מדעי | AM2288 | |
| גומי צמנט | Bostik | ||
| שקופיות | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | תרמו פישר סיינטיפיק | S21374 | |
| תלת-נתרן ציטראט | סיגמא | 1110379026 | |
| Tris-HCl | סיגמא | T3253-500 גרם | |
| טריטון X-100 | סיגמא | T8787-250 מ"ל | |
| טווין 20 | סיגמא | P9416-100 מ"ל |
מקורות
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-rang....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
