מאמר שיטה

3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים

DOI:

10.3791/60712

⸱

25 בינואר 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi", INGM

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3d-DNA דגים ססגוניות מייצג כלי להמחיש המקום גנומית מרובים בתוך גרעיני תלת-ממד משומרים, חד משמעית הגדרת אינטראקציות הדדית שלהם לוקליזציה בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור קשת רחבה של תאים ראשוניים אנושיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השאלה העיקרית בביולוגיה התא הוא ארגון גנומית בתוך החלל הגרעיני וכיצד אדריכלות כרומטין יכול להשפיע על תהליכים כגון ביטוי גנים, זהות תא ובידול. גישות רבות שפותחו כדי ללמוד את ארכיטקטורת 3D של הגנום ניתן לחלק לשתי קטגוריות משלימות: לכידת כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידה (C-טכנולוגיות) והדמיה. בעוד הראשון מבוסס על לכידת קונפורמציה כרומוזום ואינטראקציות DNA האבובית באוכלוסייה של תאים קבועים, האחרון, מבוסס על הזריחה DNA באתרו היברידיזציה (דג) על גרעיני תלת-ממד, מאפשר הדמיה עכשווית של הילה מרובים ברמת תא בודד (ססגוניות), בחינת האינטראקציות שלהם והפצה בתוך הגרעין (3d דג DNA מרובה צבעים). הטכניקה של 3D דג ה-DNA מרובת צבעים יש מגבלה של המחשה רק כמה מראש מראש, לא מאפשר ניתוח מקיף של האדריכלות הגרעינית. עם זאת, בהינתן את החוסן של תוצאותיה, 3D מרובת צבעים דג DNA בשילוב עם 3D-מיקרוסקופיה ושחזור תמונה היא שיטה אפשרית כדי לאמת את התוצאות C-טכנולוגיה מבוססת לחקור באופן משמעי את המיקום והארגון של המקום המסוים ברמת תא בודדת. כאן, אנו מציעים צעד אחר צעד שיטה של 3D מרובת צבעים דג DNA מתאים למגוון רחב של תאים הראשי האדם ולדון בכל הפעולות המעשיות, צעדים מכריעים, מושגים של 3D הדמיה וניתוח נתונים הדרושים כדי להשיג מוצלח אינפורמטיבי 3D תלת-צבעי דגי דנ א בתוך הקשרים ביולוגיים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryotes גבוה יותר צריך לדחוס באופן שיטתי וקומפקטי כמות עצומה של מידע גנטי ברגע 3d החלל של הגרעין1,2,3,4. היום, אנו יודעים כי הגנום הוא מרחב הורה בתאים ותחומים הקשורים טופולוגית5 וכי רמות מרובות של קיפול DNA ליצור קשרים בין אזורים גנומית שונים שעשויים לכלול לולאה כרומטין היווצרות6,7. הלולאה הדינמית 3d של כרומטין יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים שונים כגון שעתוק8,9, בידול ופיתוח....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה לבדיקת דנ א והליכי תיוג עם ניק תרגום

  1. לטהר ולנקות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACs), פלמידים או מוצרי PCR עם ערכות ספציפיות (טבלה של חומרים), להשעות מחדש ב ddh2O, בדוק על ידי אלקטרופורזה על ג'ל agarose וככמת.
  2. לבצע את התרגום ניק על 1.5 ליטר 2 μg של ה-DNA משלב 1.1 בנפח הסופי של 50 μL על ידי ערבוב כל ריאגנטים ב 0.5 mL מחייב נמוך שפופרת DNA לפי לוח 1.
    הערה: בדיקה מתויג ישירה יכולה לשפר את האות ליחס הרעש. ערכות לייצר בעקיפין ובאופן ישיר מתויג בדיקה עם מגוון fluorochromes אלקסה על ידי ניק תרגום הם מסחרית זמין.
  3. שילוב התרגום ניק במיקסר תרמית ב -16 ° c במשך זמן תלוי באורך של חומר ה-DNA המתח....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה של 3D דג ה-DNA דגים תיאר במאמר זה מאפשר הדמיה עכשווית של הרוח גנומית שונים בתוך שנשמרו גרעיני תלת-ממד (איור 1B). פרוטוקול זה מתיר את מדידת המרחקים בין האללים, ובין גנומית שונים כדי להעריך את קרבתו המרחבית, ולאמוד את מיקומם בתוך החלל הגרעיני (למשל, מרחק המקום מן הסנטאיד או הפריפריה של הגרעין)16. עם זאת, ישנם שלבים קריטיים רבים שחייבים להיות מוגדרים במדויק ובמיוחד עבור כל סוג תא המשמש; מומלץ מאוד להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבים הבאים להצלחה של 3D דג.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה הנוכחית מתארת את הפרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע דג DNA תלת-צבעי תלת-ממדי על מגוון רחב של תאים ראשיים אנושיים. למרות שדגי ה-dna הוא טכנולוגיה בשימוש רחב, 3d דג ה-dna דגים על שנשמרו גרעיני interphase תלת-ממד עדיין קשה לבצע במעבדות רבות, בעיקר בשל המאפיינים של דגימות בשימוש23,24.

בדיקה ניק תרגום הוא צעד בסיסי עבור מוצלח 3D-DNA דג מרובה צבעים; מצעים שונים רבים (BAC, fosmid, פלאמיד, PCR מוצרים) ניתן להשתמש בתגובה זו, ואת העיתוי של התגוב.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בסיוע הטכני של מתקן הדימות INGM (המכון הפוליטכני של המרכז הטכנולוגי "רומיאו אד אנריקה" (INGM), מילאנו, איטליה), במיוחד C. Cordiglieri, לקבלת סיוע במהלך 3D תמונות דג DNA מרובת צבעים רכישת. עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים כדי לבי: התוכנית הדגל האיטלקי epigen, האגודה הצרפתית דשנה Myopathies (afm-שידור, גרנט nr 18754) ו ג'ובאני ricercatori, משרד הבריאות האיטלקי (GR-2011-02349383). עבודה זו נתמכת על ידי המענק הבא פ: Fondazione קאריפלו (באנדו ג'ובאני, גרנט nr 2018-0321).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות 24 בארותThermo Fisher Scientific142475
צלחות 6 בארותThermo Fisher Scientific140675
Anti-Digoxigenin 488DBADI7488
b-MercaptoethanolSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
ביוטין 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (אלבומין בסרום בקר)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD21490
חומצות דאוקסיריבונוקלאית גדיל יחיד מאשכי סלמוןSigmaD7656
דקסטרן סולפט (אבקה)סנטה קרוזsc-203917A
דיגוקסיגנין 11 d-UTPרוש11093088910
DMEMתרמו פישר סיינטיפיק21969-035 500 מ"ל
DNA פולימראז Iתרמו פישר סיינטיפיק18010-017
DNase ISigmaAMPD1
dNTPs (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
אתנולסיגמא02860-1L
FBS HycloneThermo Fisher ScientificSH30109
תמיסת פורמלדהידSigmaF8775-25 מ"ל
פורממידסיגמאF9037
גלוטמיןתרמו פישר Scientific25030-024 100 מ"ל
גליצרולסיגמאG5516-100 מ"ל
גליקוגןתרמו פישר סיינטיפיקAM9510
HClסיגמא30721
cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
אינסולין סיגמא אנושיI9278-5 מ"ל
MgCl2Sigma63069
NaAc (נתרן אצטט, pH 5.2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldehydeSigma158127-25G
PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט)SigmaP4417
פניצילין/סטרפטווידיןתרמו פישר סיינטיפיק15070-063 100 מ"ל
פפסיןBioradP6887
PhasePrep BAC DNA ערכתSigmaNA0100-1KT
תמיסת פולי-L-ליזיןSigmaP8920
ProLong Diamond AntifadeMountant Thermo Fisher ScientificP36970
PureLink מיצוי ג'ל מהיר & PCR טיהור קומבו ערכתתרמו פישר מדעיK220001
PureLink מהיר פלסמיד מיני-פרפ ערכתתרמו פישר סיינטיפיקK210010
RNAse קוקטיילתרמו פישר מדעיAM2288
גומי צמנטBostik
שקופיותVWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647תרמו פישר סיינטיפיקS21374
תלת-נתרן ציטראטסיגמא1110379026
Tris-HClסיגמאT3253-500 גרם
טריטון X-100סיגמאT8787-250 מ"ל
טווין 20סיגמאP9416-100 מ"ל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-rang....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAFISH

מאמרים קשורים