בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית
במאמר זה
סיכום
תקציר
בארגון אורגנואידים מציעים מבני רקמה תלת-ממדיים המתארגנים תהליכים פיזיולוגיים בנוחות של מנה. בלוטת החלב מורין מורכבת משני תאים שונים האפיתל תאים, המשרתים פונקציות שונות: החיצוני, תא האפיתל מיוטורי ואת התא הפנימי, הפרשה לומיאל. כאן, אנו מתארים שיטה שבה התאים המרכיבים תאים אלה מבודדים ולאחר מכן משולבים כדי לחקור את התרומה האישית שלהם השושלת כדי בלוטת החלב מורפולגנזה ובידול. השיטה היא פשוטה ויעילה ואינה מצריכה טכנולוגיות הפרדה מתוחכמות כגון מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית. במקום זאת, אנו הקציר ו אנזימטי מעכל את הרקמה, הזרע את האפיתל על מנות תרבות הרקמה מחסיד, ולאחר מכן להשתמש טריסיזציה דיפרנציאל הפרדה מיואפיתל מתאי הלומיאלים עם ~ 90% טוהר. התאים מצופים לאחר מכן במטריצה מחלבת שם הם מסדרים לתוך בילדו, תלת מימדי (3D) אורגנואידים כי ניתן לבדיל כדי לייצר חלב לאחר 10 ימים בתרבות. כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות גנטיות, תאים ניתן לקצור מסוג פראי או מהונדסים גנטית מודלים העכבר, או שהם יכולים להיות מניפולציות גנטית לפני התרבות 3D. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי ליצור אורגנואידים פסיפס המאפשרים חקירה של הפונקציה גן במיוחד ב הלומיאל או מיואפיתל התא.
מבוא
בלוטת החלב (MG) היא כמו עץ, מבנה האפיתל הצינורי המוטבע בתוך משתית עשיר אדיפוציטוטה. האפיתל הביקטיום כולל שכבת הבסיס החיצונית של כריתת המעטפת, תאי האפיתל (מיואקאס) ושכבה פנימית של לומיאל, תאי אפיתל הפרשה (LECs), המקיף לומן מרכזי1. במהלך ההנקה כאשר החוזה החיצוני מיוקל לסחוט חלב מכתשיים למדעי הפנים, ה-MG עובר שינויים רבים הנמצאים תחת שליטתה של גורמי גדילה (למשל, EGF ו-FGF) והורמונים (למשל פרוגסטרון, אינסולין, ו prolactin). שינויים אלה גורמים לבידול של מבנים מיוחדים, מכתשי, אשר מסנתז ומפרישות חלב במהלך ההנקה1. אפיטאליה של הפטמות יכול להיות מניפולציות בשיטות שבהן שברי רקמת אפיתל, תאים, או אפילו תא בסיס אחד מושתלים לתוך מארח מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, סנטה קרוז.
1. יום 1: עיכול בלוטת החלב
- היכונו למסוק את ה-MGs של עכברים נקבה בוגרת 10-14 שבועות של גיל.
- לבצע את הקציר על ספסל פתוח תחת תנאים אספטי.
- לחטא את כל חומרי הניתוח, לוחות שעם, סיכות על ידי אוטוקלינג והספיגה ב 70% אלכוהול עבור 20 דקות לפני הניתוח.
- בעלי חיים מורדם עם נתרן פנטוברביטל (2X מינון הרדמה של 0.06 מ"ג/g משקל גוף) נמסר באמצעות הזרקה תוך הצפק עם מזרק 0.5 מ ל אינסולין.
- לעקוב אחר רמת ההרדמה על ידי צובט את הבהונות של בעל החיים כדי לבדוק תגובה רפלקס ולהתחיל את הפרוטוקול רק לאחר החיה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקירת תרומות ספציפיות של שושלת היוחסין בתאי האפיתל של הפטמות על ידי עשיית שימוש באורגנואידים הפסיפס. כדי להשיג תאים murine הראשי עבור אורגנואידים, האפיתל בלוטת החלב צריך להיות הראשון מבודד הadipocyte עשיר המקיף משתית (איור 1). תהליך זה מתואר בקצרה כאן והוא מתואר גם במחקר שפורסם בעבר18. כדי להשיג מספיק תאים, מומלץ כי #2, 3, 4 ו-5 MGs יוסרו (איור 1א). מפתח צעד .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, שיטה מוצגת המפרט כיצד חוקרים יכולים ליצור תרבויות 3D אורגאיד באמצעות תאי MG הראשי. ההבדל בין זה לבין פרוטוקולים אחרים הוא שאנחנו לפרט שיטה להפריד בין שני, ברורים תאים תא מג: מmyoecs הבסיס החיצוני ו LECs הפנימי. השיטה שלנו מעסיקה טריפסין דו-שלבים (0.05%) טיפול שאנו מכנים. טריסינוניזציה משלים19 הליך זה מאפשר לחוקרים לבודד מיותאס ו-LECs ללא שימוש מתוחכם cytometry ובכך ניתן להשתמש עבור המחקר MGs שנקטפו מתוך מגוון רחב של מינים יונקים שאינם יכולים להיות היטב מאופיין בסמנים הדרושים FACS. היכולת לבוד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לבן אברהמס לסיוע טכני ותמיכה ליבה מאוניברסיטת קליפורניה, סנטה קרוז (UCSC) המכון לביולוגיה של תאי גזע (IBSC). אנו מודים סוזן Strome ואת ביל סאקטון לשימוש שלהם Solamere ספינינג דיסק מיקרוסקופ Confocal וקד. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי מענקים ucsc מן המכון הרפואי הווארד יוז באמצעות מלגות ג'יימס ה. גילהם למחקר מתקדם (S.R.), מ nih (nih GM058903) עבור היוזמה למקסם את התפתחות הסטודנטים (בריאות) ומ הקרן הלאומית למדע עבור מלגת מחקר בוגרת (ה1339067) ובמענק מענק (A18-0370) מוועדת התיאום של מחקר הסרטן (LH).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 15 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן בעל בהירות גבוהה (BD Falcon) | פישר סיינטיפיק | 352096 | |
| 24 באר צלחת חיבור נמוכה במיוחד (קורנינג) | פישר סיינטיפיק | CLS3473-24EA | |
| 35 מ"מ צלחת תרבית תאים בסגנון קל לאחיזה (BD Falcon) | פישר סיינטיפיק | 353001 | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן בבהירות גבוהה (BD Falcon) | פישר סיינטיפיק | ||
| צלחת תרבית תאים קלה לאחיזה קלה (BD Falcon) 60 מ"מ מטופלת | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 ומיקרו; מסננת תאי ניילון M (קורנינג) | פישר סיינטיפיק | 08-771-2 | |
| אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 עט/סטרפטוקוס עובד גם | |
| תוסף B27 ללא ויטמין A (50x) | עכברי Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP | מעבדת ג'קסון | 003291 | |
| מזרק אינסולין BD 0.5 מ"ל | תרמו פישר סיינטיפיק | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 קולגנאז | וורת'ינגטון ביוכימי | LS004206 | |
| פתרון התאוששות תאי קורנינג | פישר סיינטיפיק | 354253 | עקוב אחר הנחיות השימוש – מיצוי מבנים תלת מימדיים מ-Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, ללא פנול אדום | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| חמור נגד עיזים 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | שימוש ב-1:500, אצווה: 1608641, מלאי 2 מ"ג/מ"ל, RRID:AB_2535864 |
| חמור נגד עכבר 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | שימוש ב-1:1000, אצווה: 140554, מלאי 1.4 מ"ג/מ"ל |
| מדיום הנשר השונה של דולבקו: תערובת חומרים מזינים F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) של Dulbecco | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | ללא Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| סרום בקר עוברי | VWR | 97068– 085 | 100% מוצא ארה"ב, דרגת פרימיום, מגרש: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | מכונה מדיה הרכבה בטקסט |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| עז אנטי-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | שימוש ב-1:250, פריט: J1011, מלאי 200 ומיקרו; g/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | השתמש 1:2000, המלאי הוא 20mM |
| אינסולין | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14– CreERtam | מעבדת ג'קסון | 5107 | |
| גורם גדילה מטריג'ל מופחת (GFR); פנול ללא אדום; 10 מ"ל | פישר סיינטיפיק | CB-40230C | לוט: 8204010, ריכוז מלאי 8.9 מ"ג/מ"ל |
| MillexGV יחידת מסנן 0.22 ומיקרו; m | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE זכוכית 8 בארות, זכוכית סטרילית | Millipore Sigma | PEZGS0816 | מגלשות תא אלה נהדרות להסרת אטמים אך מותגים אחרים יכולים לעבוד היטב (למשל Lab Tek II). |
| עכבר אנטי-SMA | Millipore Sigma | A2547 | שימוש ב-1:500, מגרש: 128M4881V, מלאי 5.2 מ"ג/מ"ל, RRID:AB_476701 |
| תוסף N-2 (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048-NaCl | |
| Fisher Scientific | S671-3 | ||
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R& D | 5898-NR-050 | |
| התוכנית הלאומית להורמונים ופפטידים | בלוטת יותרת המוח של הבקר | נרכשה מד"ר פרלו במכון המחקר והחינוך של Harbor-UCLA | |
| מעכב Rho Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| נתרן הידרוקסיד | Fisher Scientific | S318-500 | |
| סרום חמור מסונן | סטרילי Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| סרום חמור מסונן סטרילי | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | בדרגת מעבדה |
| טריפסין EDTA 0.05% | תרמו פישר סיינטיפיק | 25300-062 |
מקורות
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
