Method Article

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

DOI:

10.3791/60744

⸱

February 2nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכמה מודלים הטרנסגניים של דגי hepatocellular (HCC), hepatomegaly ניתן לצפות במהלך שלבי הזחל המוקדמים. בדיקת גודל הזחל הכבד ב דג זברה מודלים HCC מספק אמצעים כדי להעריך במהירות את ההשפעות של תרופות ומניפולציות אחרות על פניטיפים הקשורים אונאוגן. כאן אנו מראים כיצד לתקן הזחלים דג זברה, לנתח את הרקמות סביב הכבד, צילום כבדים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, למדוד את אזור הכבד, ולנתח את התוצאות. פרוטוקול זה מאפשר כימות מהירה ומדויקת של גודל הכבד. כאשר שיטה זו כרוכה במדידת אזור הכבד, הוא עשוי להמעיט בערכם של עוצמת הכבד, ומתודולוגיות משלימות נדרשות כדי להבדיל בין שינויים בגודל התא ושינויים במספר התאים. טכניקת החיתוך המתוארת בזאת היא כלי מצוין להמחיש את הכבד, הבטן והלבלב בעמדותיהם הטבעיות לצורך מספר יישומים בזרם המים, כולל כתמים immunofluorescence והיברידיזציה באתרו. האסטרטגיה המתוארת עבור כימות הכבד הזחל היא ישימה היבטים רבים של התפתחות הכבד והתחדשות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם העיקרי הנפוץ ביותר של הכבד1 ואת הסיבה המובילה השלישית לתמותה הקשורות לסרטן2. כדי להבין טוב יותר מנגנונים של hepatocarcinogenesis ולזהות HCC therapeutics פוטנציאלי, אנחנו ואחרים פיתחנו בעלי החיים הטרנסגניים שבהם הביטוי הספציפי hepatציט של אונגנס כגון β-catenin3,4, קראס (רובוטית v12)5,6, myc7, או Yap18 מוביל HCC בבעלי חיים למבוגרים. ב זה zebrafish, הגדלת הכבד הוא ציין מוקדם ככל 6 ימים הפריה הפוסט (dpf), מתן פלטפורמת נתיישב לבדיקת ההשפעות של תרופות ושינויים גנטיים על הצמיחה אונגן מונחה הכבד. מדידה מדויקת ומדויקת של גודל בכבד זחל חיוני לקביעת ההשפעות של המניפולציות האלה.

גודל הכבד והצורה ניתן להעריך חצי-כימות הזחלים של דג זברה קבוע על ידי CY3-SA תיוג9 או ב חיים דג זברה הזחלים באמצעות hepatocyte-כתבים פלורסנט ספציפיים הניתוח מיקרוסקופ5,6. השיטה האחרונה היא מהירה יחסית, והיעדר דיוק שלה ניתן לטפל על ידי צילום ומדידת האזור של כל כבד באמצעות תוכנה עיבוד תמונה7,10. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית מיקום אחיד כל הזחלים לחיות בניסוי כזה שאזור כבד דו מימדי הוא ייצוג מדויק של גודל הכבד. טכניקה דומה לכמת את גודל הכבד כוללת שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אור לכמת את עוצמת הזחל הכבד8, אשר עשוי להיות מדויק יותר לזיהוי הבדלים בגודל כאשר הכבד מורחב לא אחיד בממדים שונים. מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) יכול לשמש כדי לספור את מספר החומרים המסומנים fluorescently וסוגים אחרים של תאי הכבד בזחל כבדים8,11. בשיטה זו, כבדי זחל הם במאגר והנתק, כך מידע על גודל הכבד בודדים וצורה הוא איבד. בשילוב עם שיטת קביעת גודל כבד אחרת, FACS מאפשר הבדלה בין מספר התאים המוגבר (היפרפלזיה) וגודל התא גדל (היפרפרס). כל השיטות הללו מעסיקים טכנולוגיה פלואורסצנטית יקרה (מיקרוסקופ או סדרן תאים) ו, למעט תיוג CY3-SA, דורשים תיוג של hepatocytes עם כתב פלורסנט.

כאן אנו מתארים בפרוטרוט שיטה לכמת את השטח של הזחל הכבד באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ותוכנה עיבוד תמונה3,12,13,14. פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויקות של אזור הכבדים הבודדים באתרו ללא שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. במהלך ניתוח גודל הכבד, אנו מעוורים את זהות התמונה כדי להפחית את הטיית החוקר ולשפר את הקשיחות המדעית15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים בעלי חיים מתבצעים בעקבות הליכים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת יוטה.

1. תיקון הזחלים

  1. בשעה 3 – 7 ימים הפריה פוסט (dpf), להרוג הזחלים עם טריקיין מתיונין (0.03%) ולאסוף עד 15 הזחלים בצינור 2 מ"ל באמצעות פיפטה זכוכית משאבת פיפטה.
  2. שטוף הזחלים פעמיים עם 1 מ ל של קר (4 ° c) 1 x פוספט מאגור מלוחים (PBS) על קרח. עבור כל כביסה, להסיר את הנוזל ככל האפשר מן הצינורית עם צינור זכוכית משאבת פיפטה, ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של הערוץ הקר לצינור.
  3. להסיר כמו PBS ככל האפשר באמצעות משאבת זכוכית ומשאבה פיפטה, ולהוסיף 1 מ ל קר (4 ° צ') 4% פאראפורמלדהיד (כחול) ב PBS.
    התראה: המטה הוא מטרד וחשוד מסרטן. יש לענוד כפפות בעת טיפול בתחום הכרומטוגרפיה, ולטפל בפתרונות מרוכזים בתוך מכסה כימי.
  4. מודטה ב -4 ° c לפחות לילה (אבל עד מספר חודשים) עם נדנדה עדינה.

2. מבתר רקמות סביב הכבד

  1. להסיר את הזחלים מתוך החול על ידי שטיפה 3x עם 1 מ ל של קר (4 ° c) PBS ונדנדה עבור 5 דקות בין rinses.
    הערה: זה בסדר לשמור את הזחלים ב-PBS ליום או יומיים ב -4 ° c.
  2. לתוך באר אחת של. צלחת זכוכית באורך 9 היטב
  3. להסיר את העור מסביב לכבד.
    1. השתמש מלקחיים עדינים להחזיק זחל על גבו (בטן למעלה), מחזיק משני צדי הראש בעדינות ככל האפשר. ואז להשתמש מלקחיים עדין מאוד ביד השנייה כדי לתפוס את העור רק על הלב.
    2. למשוך את העור באלכסון לכיוון הזנב של הדג ואת החלק התחתון של המנה בצד שמאל או ימין של הדג. חזור לצד השני (ימין או שמאל).
    3. המשך לתפוס כנפיים של העור משיכת למטה/בחזרה עד כל העור מלנומה על גבי או ליד הכבד הוסרו.
  4. להסיר חלמון, אם קיים.
    1. עבור 5 – 6 הזחלים dpf, להרים את החלמון בחתיכה אחת על ידי החזקת הדג עם מלקחיים עדינים על גבו ושימוש מלקחיים בסדר מאוד לעורר את החלמון בעדינות.
    2. במשך 3 – 4 הזחלים של הזחל, לגרד את החלמון בחתיכות. להחזיק את הדג עם מלקחיים עדינים על גבו ולהשתמש מלקחיים עדין מאוד ללטף את החלמון, החל הצד הגחוני.
  5. מניחים הזחלים לגזור PBS קר טרי באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה.

3. הדמיה

  1. כדי הר הזחלים, יוצקים מספר mL של 3% מתיל תאית על המכסה של צלחת פטרי נקייה פלסטיק.
  2. השתמש בפיפטה זכוכית ומשאבת הפיפטה כדי להוסיף זחלים למתיל תאית, והוסיפו כמעט PBS עם הזחלים האפשריים.
  3. תחת מיקרוסקופ מבתר על הגדלה נמוכה, השתמש מלקחיים עדינים כדי לכוון את הדג כך שהם שוכב בצד ימין שלהם, פונה שמאלה.
    הערה: ודא כי הדג מונחה בצורה מושלמת בצד שלהם או שמידות הכבד אינן מדויקות.
  4. . תצלם כל דג
    1. ודא כי הדג להצטלם מיושר בצורה מושלמת, עם עין אחת ישירות מעל העין השנייה. במקרה הצורך, להשתמש מלקחיים עדינים להקיש בקלילות על הראש או זנב של דגים כדי להתאים את הכיוון. אם הזנב של הדג הוא כפוף, להסיר את הזנב על ידי צובט אותו בחוזקה עם מלקחיים כדי להסיר אותו כך הדג מניח.
    2. התקרבות להגדלה גבוהה והתמקד בכבד, וודא שקווי המתאר של הכבד גלויים בבירור.
    3. הצמד תמונה ושמור את הקובץ.
    4. חזור על הפעולה עבור כל הדגים, ודא שההגדלה זהה עבור כל תמונה.
    5. צלם תמונה של מיקרומטר תוך שימוש באותה הגדלה (ראה איור 2ח').

4. ניתוח תמונה

  1. למדוד את האזור של הכבד של כל דג באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
    1. עיוורון כל הכבד תמונות כדי למנוע הטיית חוקר פוטנציאלי ולקדם את הקשיחות המדעית15. שלב זה יכול להיעשות באופן ידני על-ידי חבר מעבדה אחר או באמצעות תוכנית מחשב (חומר משלים). שינוי שם של קבצים באופן אקראי וליצור "קובץ רנדומאלי" המכיל רשימה של שמות הקבצים המקוריים ושמות הקבצים העיוורים התואמים.
    2. פתח קבצים אקראיים לפי הסדר, החל בקובץ 1.
    3. בחרו בכלי בחירה ביד חופשית והתווה כל כבד.
    4. הקש Ctrl-M כדי למדוד את האזור של כל הכבד.
    5. עבור כל כבדים שלא ניתן למדוד באופן מדויק, הוסף מדידה של מציין מיקום (קטנה מאוד או גדולה מאוד, כך שניתן יהיה להוסיפה בקלות בהמשך).
    6. שמור את המידות בקובץ טקסט ("קובץ מדידות").
  2. לבטל את העיוורון ולנתח נתונים
    1. פתח "קובץ מדידות" ו "קובץ אקראיות" בתוכנית גיליון אלקטרוני.
    2. הוסף עמודה חדשה ב"קובץ המדידות" והוסף את שמות הקבצים המקוריים עבור הקבצים העיוורים, באמצעות "קובץ האקראיות". שמור קובץ זה כ-"קובץ מדידות שלא עיוורו".
    3. מיין נתונים לפי שם קובץ מקורי.
    4. הקפד לא לכלול מדידות כבד אשר תמונות היו לקוי (ראה איור 2א – G).
    5. במקרה הצורך, המירו ערכי מדידה לקנה מידה רצוי (mm2, לדוגמה).
      1. פתחו את סרגל הסרגל בתוכנת עיבוד התמונה.
      2. השתמשו בכלי קו ישר למדידת 1 מ"מ בסרגל הסרגל. תוכנת עיבוד התמונה יהיה למדוד באותם יחידות כמו הכבדים (פיקסלים), מתן פקטור ההמרה.
      3. השתמש בפקטור ההמרה כדי להמיר מדידות בקובץ המדידות הבלתי עיוור.
    6. באמצעות תוכנית הגיליון האלקטרוני או הדבקת נתונים בתוכנת גרפים וסטטיסטיקה מדעית, קבע ממוצע וסטיית תקן וחשב ערך p (ים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי מיוחד המופעל β-catenin (Tg (fabp10a: pt-β-cat) מופעל באמצעותשלושה אחים שאינם טרנסגניים הורדמים באזור 6 dpf ובכבד שימוש במיקרוסקופיה ברייטפילד ובתוכנת עיבוד תמונה. דג הטרנסגניים הגביר באופן משמעותי את גודל הכבד (0.0006 ס"מ2) לעומת האחים הלא-טרנסגניים שלהם (0.0004 ס"מ2, p < 0.0001; איור 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקוונפיקציה של גודל הכבד היא קריטית במחקרים שמטרתם הבנת התפתחות הכבד, התחדשות, ו אונגנזה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא טכניקה מהירה יחסית, קלה וזולה לכמת את גודל הכבד בזחל צראדג. הפעלת זהירות מתאימה תוך ביצוע היבטים מסוימים של הפרוטוקול יכולה לסייע בדיוק מוגבר של תוצאות ולהקטין את התסכול.

קיבעון תקין של הזחלים הוא חיוני כלפי קבלת דגימות ביולוגיות משומרים היטב ומניעת התפוררות שלהם. דילול של 4% בכיוון הערוץ יכול להתרחש כאשר PBS לא מוסרת לחלוטין לפני הוספת התחתית לזחלים שוטפים. שימוש בפתרונות בעלי כי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היינו רוצים להכיר במרין הובס ועל משאבי בעלי החיים מרוכז של דג (הצאר) באוניברסיטת יוטה על מתן גידול בדגים, שטח מעבדה, וציוד לביצוע חלקים של מחקר זה. התרחבות הצאר נתמכת בחלקו על ידי NIH גרנט 1G20OD018369-01. אנחנו גם רוצים להודות רודני סטיוארט, קלואי לים, לאנס גרהאם, קודי ג'יימס, גארט nickum, ואת סרטן הצייד המכון (hci) דג זברה מתקן לטיפול דג זברה. אנחנו רוצים להודות לקנת קומפאס לקבלת עזרה בתכנות R. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מענקים מן הקרן לסרטן הצייד (בשילוב עם גרנט P30 CA042014 הוענק מכון סרטן הצייד) (KJE) ו-NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מצלמה לניתוח מיקרוסקופLeica, למשל
ניתוח מיקרוסקופLeica, למשל
מלקחיים עדינים (Dumont #5)Fine Science Tools11254-20
צנרת זכוכיתVWR14672-608
תוכנת ניתוח תמונהJ/FIJIניתן להוריד את ImageJ/FIJI בחינם: https://imagej.net/Welcome
Methyl celluloseSigmaM0387
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
תמיסת מלח חוצצת פוספטספקים
משאבת פיפטהVWR53502-233
צלחות פטרי מפלסטיקארה"ב סיינטיפיק בע"מ2906
פיירקס צלחת זכוכית תחתונה עגולה 9 בארותVWR89090-482
תוכנה לעיוורון קבציםRפרויקט R ניתן להוריד בחינם: https://www.r-project.org/
תוכנת גרפים וסטטיסטיקה מדעיתגיליון אלקטרוני GraphPad Prism
Microsoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)Western Chemical200-226
מלקחיים עדינים מאוד (Dumont #55)כלי מדע עדינים11255-20
שוניםתוכנית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).
  17. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liver Size QuantificationBrightfield MicroscopyZebrafish LarvaeTissue DissectionImage AnalysisPFA FixationMethylcellulose MountingFreehand SelectionScale Bar CalibrationHepatocellular Carcinoma

Related Articles