הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של תפקוד הזיכרון בפילסוקרפיין-עכברים מבוססי אפילפסיה

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60751

⸱

4 ביוני 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג הליכים ניסיוניים להערכת ליקויי זיכרון בעכברים אפילפסיה הנגרמת על ידי pilocarpine. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את המנגנונים הפתופיזיטיביים של התדרדרות קוגניטיבית הקשורה לאפילפסיה, שהיא אחת הנפוצות ביותר במחלת התחלואה באפילפסיה.

תקציר

ליקוי קוגניטיבי הוא אחד הנפוצים ביותר בתחלואה במחלת האונה הטמפורלית. כדי ללכוד אפילפסיה-הידרדרות קוגניטיבית הקשורים במודל בעל חיים של אפילפסיה, יצרנו מטופל הטיפול בעכברים כרוניים. אנו מציגים פרוטוקול לשלוש בדיקות התנהגותיות שונות באמצעות עכברים אלה: מיקום אובייקט הרומן (NL), זיהוי אובייקט הרומן (NO), ובדיקות הפרדת תבניות (PS) להערכת למידה וזיכרון עבור מקומות, אובייקטים והקשרים, בהתאמה. אנו מסבירים כיצד להגדיר את המנגנון התנהגותי ולספק הליכים ניסיוניים לבדיקות ה-NL, NO, ו-PS בעקבות מבחן שדה פתוח המודד את הפעילויות הlocomotor בסיס של בעלי החיים. אנו מתארים גם את היתרונות הטכניים של המבחנים NL, NO, ו-PS ביחס לבדיקות התנהגותיות אחרות להערכת תפקוד הזיכרון בעכברים אפילפסיה. בסופו של דבר, אנו דנים בסיבות אפשריות ופתרונות לעכברים אפילפטי שאינם מצליחים ליצור קשר טוב עם האובייקטים במהלך הפעלות ההיכרות, שהוא צעד קריטי לבדיקות זיכרון מוצלחות. לפיכך, פרוטוקול זה מספק מידע מפורט אודות אופן ההערכת ליקויי זיכרון המשויכים לאפילפסיה באמצעות עכברים. בדיקות ה-NL, NO ו-PS הן פשוטות ויעילות, המתאימות להערכת סוגים שונים של זיכרון בעכברי אפילפסיה.

מבוא

אפילפסיה היא הפרעה כרונית המאופיינת התקפים חוזרים ספונטנית1,2,3. מכיוון התקפים חוזרים יכולים לגרום ליקויים מבניים ופונקציונליים במוח1,2,3, פעילות תפיסה נורמלית יכול לתרום לתפקוד הקוגניטיבי, שהוא אחד הנפוצים ביותר אפילפסיה הקשורים התחלואה4,5,6. בניגוד לאירועים תפיסה כרונית, אשר ארעי ורגעי, ליקויים קוגניטיביים יכולים להימשך ברחבי החולים אפילפסיה ' חייהם, הידרדרות איכות החיים שלהם. לכן, חשוב להבין את המנגנונים הפתופסולוגיים של אפילפסיה-הידרדרות קוגניטיבית הקשורים.

מודלים שונים של בעלי חיים ניסיוניים של אפילפסיה שימשו כדי להדגים את הלמידה ואת ליקויי זיכרון הקשורים אפילפסיה כרונית7,8,9,10,11,12. לדוגמה, מבוך המים של מוריס, התניה הקשר הקשרית, לוח החורים, מיקום האובייקט הרומן (NL), ובדיקות זיהוי אובייקט הרומן (NO) השתמשו לעתים קרובות כדי להעריך את תפקוד הזיכרון באפילפסיה של האונה הטמפורלית (TLE). בגלל ההיפוקמפוס הוא אחד האזורים העיקריים שבו TLE מראה פתולוגיה, בדיקות התנהגותיות שיכולים להעריך פונקציית זיכרון תלויי ההיפוקמפוס הם לעתים קרובות מעדיפים בחירה. עם זאת, בהינתן כי התקפים יכולים לגרום היפוקאמאל נוירוגנזה ולתרום אפילפסיה הקשורים לירידה קוגניטיבית10, תבניות התנהגותיות עבור בדיקות הפונקציה של היילוד הילוד (כלומר, דפוס הפרדה מרחבית, PS)8,13 יכול גם לספק מידע חשוב על המנגנונים הסלולריים של ליקויי זיכרון באפילפסיה.

במאמר זה, אנו מדגימים סוללה של בדיקות זיכרון, NL, NO ו-PS, עבור עכברים אפילפסיה. הבדיקות פשוטות ונגישות בקלות ואינן דורשות מערכת מתוחכמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה ובוצעו בהתאם למכון הלאומי של מדריך הבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (NIH פרסומים מס ' 80-23).

1. בדיקת מיקום אובייקט הרומן (NL)

  1. הכנת העכברים C57BL/6 או העכבר הטרנסגניים 4 – 6 שבועות לאחר הזרקת פילוקרפין.
    הערה: התקפים חריפה המושרה על ידי הזרקת הצפק (IP) פילוקרפין, בעקבות פרוטוקול מפורט בדו ח הקודם שלנו14.
  2. העבירו את העכברים האפילפטי מחדר הרבייה לחדר ההתנהגות יום אחד לפני תחילת בדיקות ההתנהגות. לאפשר לעכברים לhabituate לפחות 12 h ללילה.
  3. בחדר ההתנהגות, הפרידו עכברים בודדים לכלובים חדשים למגורים בודדים. כתבו את המידע על כל בעל חיים על כרטיס הכלוב ושמרו על בעלי החיים באותם כלובים במהלך בדיקות ההתנהגות. ניתן להעביר במקביל כלובים מרובים באמצעות עגלה.
  4. ביום שלמחרת, התחילו 3 ימים של הרגלה הפעלות (H1-H3) בשעות הבוקר המוקדמות. Acclimate את החיות לאור נמוך בכלובים ביתם לפחות 30 דקות.
  5. הכן תיבת שדה פתוחה עם ממדים חיצוניים של 44 x 44 x 31 ס"מ ובתוך מימדים הפנימי של 43 x 43 x 30.5 ס"מ. ביום 1 של הרגלה (H1), מניחים את מדידת המאיר במרכז תיבת השדה הפתוחה ומתאימים את המאיר ל 60 lux.
  6. רסס את הרצפה והקירות של תיבת השדה הפתוחה עם 70% אתנול ולנגב עם מגבת נייר נקייה כדי להסיר רמזים ריח אפשרי. לאחר מכן המתינו לפחות 1 דקות עד ששאריות האלכוהול התייבשו לחלוטין.
  7. הערכת הפעילות הlocomotor של כל אחד מהעכבר על-ידי ביצוע בדיקת שדה פתוחה.
    1. כדי להקליט ולעקוב אחר ההתנהגות של כל עכבר ניסיוני, השתמש בתוכנת מעקב וידאו על התנהגות בעלי חיים (ראה טבלת חומרים).
    2. לאחר פתיחת תוכנת המעקב אחר וידאו, כיול את גודל תיבת השדה הפתוחה. לאחר מכן, הגדר את האזור למעקב. הגדר 3 s השהיה ו -15 דקות של זמן רכישה כדי להימנע ממעקב אחר הידיים של הניסויים. הוסף את המידע על כל עכבר ניסיוני (קבוצה, מין, גיל, וכו ').
    3. לאחר מכן, הצב בעדינות עכבר ניסיוני בתיבת השדה הפתוחה הפונה לקיר. עשה זאת על ידי הצבת אותו על מכסה הכלוב כדי למזער את הטיפול הקשורים מתח וחרדה. לאחר מכן, שחררו את העכבר ליד הקיר של תיבת השדה הפתוחה שהיא הרחוקה ביותר מהמקום שבו האובייקטים יהיו במהלך הפעלת ההיכרות (שלב 1.9.3.).
      הערה: לאחר שהעכבר נמצא בתיבת השדה הפתוחה, תוכנת המעקב אחר העכבר תזהה אותו באופן אוטומטי ותתחיל בהקלטה. לקבלת מעקב אופטימלי של החיפושים, ניתן למקם את המצלמה ישירות מעל תיבת השדה הפתוחה.
    4. לאחר 15 דקות של הקלטה, להחזיר את החיה לכלוב הבית שלה על ידי הצבת אותו על מכסה הכלוב. נקה את תיבת השדה הפתוחה עם תרסיס האתנול 70% ונגב עם מגבת נייר נקייה בין מבחנים. שחזר את האור הבהיר ולמד את המרחק הכולל של בעל החיים הועבר באמצעות תוכנת המעקב אחר וידאו בהתאם להוראות היצרן.
      1. פתח את תוכנת המעקב אחר וידאו וסרטוני וידיאו. לאחר מכן, לחץ על ניתוח כדי לחשב את המרחק הכולל שהועבר בהתבסס על הכיול של גודל תיבת השדה הפתוח.
  8. ביום 2 וביום 3, בצע את ההפעלות ההרגלה (H2, H3) על-ידי שלבים חוזרים 1.3 עד 1.7.
  9. ביום 4, בצע את הפעלת ההיכרות (F1).
    1. באור העמום, מקם כל אחד מהעכברים בשדה הפתוח הריק במשך 3 דקות. לאחר החזרה הקצרה, החזר את החיה אל כלוב הבית.
    2. במהלך הרגלה, לנקות ביסודיות את האובייקטים עם 70% אתנול ולנגב אותם עם מגבת נייר. המתינו לפחות 1 דקות עד ששאריות האלכוהול יבשו לחלוטין.
    3. מניחים שני עצמים זהים (בובות גומי, עצם A) בזירת השדה הפתוחה במרחק 5 ס מ מהקירות הסמוכים. תקן את האובייקטים באמצעות קלטת דו-צידית. הציגו את העכבר הנסיוני בתיבת השדה הפתוחה, מול הקיר המרוחק מהאובייקטים.
    4. אפשר חיפושי חינם 20 דקות ובאופן ידני למדוד את הזמן שהושקע לחקור את שני האובייקטים באמצעות שני stopwatches עונים. לאחר העכבר מגיע זמן החיפוש המינימלי (30 s) עבור שני האובייקטים, לעצור את ההפעלה F1 ולהעביר את החיה לכלוב הבית שלה. אם העכבר לא מצליח לחקור את האובייקטים עבור 30 s בתוך 20 דקות, להסיר את העכבר מתיבת השדה הפתוחה ולהוציא אותו מהפעלות נוספות.
    5. לאחר הסרת החיה מתיבת השדה הפתוחה, לנקות ביסודיות את הרצפה ואת הקירות של התיבה עם 70% תרסיס אתנול ולנגב אותם עם מגבת נייר.
      הערה: מדוד את הזמן כאשר העכבר נוגע באובייקטים עם שפם, חוטם, או כפות הקדמיות שלו. אל לכמת כזמן גישוש כל התנהגויות שבו החוטם של בעל החיים אינו מצביע לעבר האובייקט, כגון ישיבה על האובייקט, עובר על ידי האובייקט, או נח עם האחוריים שלו מצביע על האובייקט.
  10. ביום 5, בצע את הפעלת הבדיקה של NL.
    1. העבר את העכבר מכלוב הבית שלו לאזור השדה הפתוח לצורך ביטוח במשך 3 דקות. ואז להחזיר את החיה לכלוב הבית שלה.
    2. במהלך הרגלה, לנקות ביסודיות את האובייקטים עם 70% אתנול ולנגב אותם עם מגבת נייר. המתינו לפחות 1 דקות עד ששאריות האלכוהול יבשו לחלוטין.
    3. העבר אובייקט אחד (בובת גומי, אובייקט A) למיקום האלכסוני, במרחק 5 ס מ מהקירות הסמוכים. תקן את האובייקט באמצעות קלטת דו-צידית. העבר את העכבר הנסיוני על מכסה הכלוב שלו לאזור השדה הפתוח ומניחים אותו מול קיר תיבת השדה הפתוחה.
      הערה: מאזן את מיקום האובייקט שהועבר כדי להקטין את ההעדפה הטבועה הפוטנציאלית לכיוון מסוים. לדוגמה, שנה את המיקום של האובייקט המועדף מפגישת ההיכרות עבור מחצית מהחיות הנסיוניות, ועבור שאר החיות, העבר את האובייקט המועדף פחות מהפעלת ההיכרות.
    4. אפשר 10 דקות של חיפוש והקלטה חינם עם מערכת מעקב וידאו. למדוד את הזמן שהושקע לחקור כל אובייקט באמצעות שתי עצירות שעונים ולחשב את יחס האפליה כמו
      figure-protocol-1
      הערה: מדוד את הזמן כאשר העכבר נוגע באובייקטים עם שפם, חוטם, או כפות הקדמיות שלו. אל לכמת כזמן גישוש כל התנהגויות שבו החוטם של בעל החיים אינו מצביע לעבר האובייקט, כגון ישיבה על האובייקט, עובר על ידי האובייקט, או נח עם האחוריים שלו מצביע על האובייקט.
    5. תפוס את הזנב של העכבר ניסיוני ומניחים אותו על מכסה הכלוב שלה להעביר את כלוב הבית שלה. במשך 3 ימים (ימים 6 – 8), הרשו לעכבר לנוח עם גישה חופשית למזון ולמים.
    6. ברגע שהחיה תוסר מתיבת השדה הפתוחה, תנקה ביסודיות את הרצפה והקירות של הקופסה עם תרסיס האתנול 70% ונגב עם מגבת נייר.

2. בדיקת זיהוי אובייקט הרומן (לא)

  1. ביום 9, לבצע הפעלה 15 דקות הרגלה ידי חוזר שלבים 1.2 – 1.7.
  2. ביום 10, בצע את הפעלת ההיכרות (F1).
    1. באור עמום, הנח את העכבר בשדה הפתוח הריק במשך 3 דקות. לאחר שהחזרת את העכבר לאזור השדה הפתוח, החזר אותו באופן זמני לכלוב הבית שלו.
    2. במהלך ההרגלה, לנקות ביסודיות את האובייקטים עם 70% אתנול ולנגב עם מגבת נייר. חכו לפחות 1 דקות. ששאריות האלכוהול יבשו לחלוטין
    3. מניחים שני אובייקטים זהים (50 מ"ל צינורות פלסטיק מלאים 40 mL של מים, אובייקט B) בשדה הפתוח 5 ס מ הרחק מן הקירות הסמוכים. תקן את האובייקטים באמצעות קלטת דו-צידית. הציגו את העכבר הנסיוני בתיבת השדה הפתוחה מול הקיר המרוחק מהאובייקטים.
    4. כמו החיה נחשפת שני אובייקטים שונים (50 mL שפופרת פלסטיק מלאה 40 מ ל של מים, אובייקט B; צנצנת Coplin זכוכית, אובייקט C) במבחן לא, מאזן את האובייקט במהלך ההפעלה F1. לדוגמה, הציגו שני עצמים זהים (צנצנות קופלין זכוכית, עצם ג) לחצי מבעלי החיים בקבוצה.
    5. אפשר חיפושי חינם 20 דקות ובאופן ידני למדוד את הזמן שהושקע לחקור את שני האובייקטים באמצעות שני stopwatches עונים. לאחר העכבר מגיע זמן החיפוש המינימלי (30 s) עבור שני האובייקטים, לעצור את ההפעלה F1 ולהעביר את החיה לכלוב הבית שלה. אם העכבר אינו מצליח לחקור את האובייקטים עבור 30 s בתוך 20 דקות, הסר אותו מתיבת השדה הפתוחה והוצא אותה מהפעלות נוספות.
    6. לאחר הסרת החיה מתיבת השדה הפתוחה, לנקות ביסודיות את הרצפה ואת הקירות של התיבה עם 70% תרסיס אתנול ולנגב אותם עם מגבת נייר.
      הערה: מדוד את הזמן כאשר העכבר נוגע באובייקטים עם שפם, חוטם, או כפות הקדמיות שלו. אל לכמת כזמן גישוש כל התנהגויות שבו החוטם של בעל החיים אינו מצביע לעבר האובייקט, כגון ישיבה על האובייקט, עובר על ידי האובייקט, או נח עם האחוריים שלו מצביע על האובייקט.
  3. ביום שלמחרת (יום 11), בצע את הפעלת הבדיקה ללא.
    1. העבר את העכבר מכלוב הבית שלו לשדה הפתוח למשך שלוש דקות, ולאחר מכן החזר את החיה לכלוב ביתו.
    2. במהלך ההרגלה, לנקות ביסודיות את האובייקטים עם 70% אתנול ולנגב עם מגבת נייר. המתינו לפחות 1 דקות עד ששאריות האלכוהול יבשו לחלוטין.
    3. החלף אובייקט אחד (50 mL שפופרת פלסטיק מלא 40 מ ל של מים, אובייקט B) עם אובייקט אחר (כד הזכוכית, האובייקט C) 5 ס מ מן הקירות הסמוכים. תקן את האובייקטים באמצעות קלטת דו-צידית. העבר את העכבר הניסיוני על מכסה הכלוב אל השדה הפתוח, ומניחים אותו מול הקיר. מאזן את האובייקטים שהוצגו יחד במהלך הבדיקה NO. לדוגמה, החלפת קנקן זכוכית אחת (אובייקט C) עם צינור פלסטיק 50 mL מלא 40 mL של מים (אובייקט B) עבור העכברים שנחשפו שני צנצנות Coplin זכוכית (אובייקט C) במהלך המפגש ההיכרות.
      הערה: איזון מנוגד למיקום האובייקט המוחלף ניתן לבצע גם כדי להקטין את ההעדפה הטבועה הפוטנציאלית לכיוון מסוים. לדוגמה, עבור כל קבוצה של בעלי החיים החשופים לקבוצת שני אובייקטים (אובייקט B או אובייקט C), שנה את האובייקט המועדף בהפעלת ההיכרות עבור מחצית מהחיות הנסיוניות, ועבור שאר החיות, החלף את האובייקט המועדף פחות בהפעלת ההיכרות.
    4. אפשר 10 דקות של חיפושי חופשי ולהקליט אותו באמצעות מערכת מעקב וידאו. למדוד את הזמן שהושקע לחקור כל אובייקט באמצעות שתי עצירות שעונים ולחשב את יחס האפליה.
      הערה: מדוד את הזמן כאשר העכבר נוגע באובייקטים עם שפם, חוטם, או כפות הקדמיות שלו. אל לכמת כזמן גישוש כל התנהגויות שבו החוטם של בעל החיים אינו מצביע לעבר האובייקט, כגון ישיבה על האובייקט, עובר על ידי האובייקט, או נח עם האחוריים שלו מצביע על האובייקט.
    5. תפוס את הזנב של העכבר ניסיוני ומניחים אותו על המכסה כלוב להעביר את כלוב הבית שלה. במשך 3 ימים (ימים 12 – 14), הנח לעכבר לנוח עם גישה חופשית למזון ולמים.
    6. ברגע שהחיה תוסר מתיבת השדה הפתוחה, תנקה ביסודיות את הרצפה והקירות של תיבת השדה הפתוחה עם תרסיס האתנול 70% ונגב עם מגבת נייר.

3. מבחן הפרדת דפוסים (PS)

  1. ביום 15, בצע את הפעלת ההיכרות הראשונה (F1) עבור מבחן ה-PS.
    1. העבר את העכבר מכלוב הבית שלו לאזור השדה הפתוח למשך שלוש דקות, ולאחר מכן החזר אותו לכלוב הבית שלו.
    2. במהלך ההרגלה, לנקות ביסודיות את האובייקטים ולוחית הרצפה המקודד עם 70% אתנול ולנגב עם מגבת נייר. המתינו לפחות 1 דקות עד ששאריות האלכוהול יבשו לחלוטין.
    3. מניחים את צלחת הרצפה (42.5 x 42.5 x 0.5 ס מ) עם רשת רחב (5.5 x 5.5 ס מ) בתיבת השדה הפתוחה ומניחים שני אובייקטים זהים (פלסטיק T-מבחנות מלאים ב 50 mL של מים, אובייקט D) בשדה הפתוח 5 ס מ מן הקירות הסמוכים. תקן את האובייקטים באמצעות קלטת דו-צידית. הציגו את העכבר הנסיוני בתיבת השדה הפתוחה מול הקיר המרוחק מהאובייקטים.
    4. כמו החיה נחשפת שני אובייקטים שונים (T-בקבוקון פלסטיק מלא 50 mL של מים, אובייקט D; בקבוק זכוכית, אובייקט E) במבחן PS, מאזן את האובייקט במהלך הפעלות F1 ו-F2. לדוגמה, הציגו שני עצמים זהים (בקבוקי זכוכית, עצם E) בקומת הרשת הרחבה לחצי מבעלי החיים בקבוצה.
    5. אפשר חיפושי חינם 20 דקות, ובאופן ידני למדוד את הזמן שהושקע לחקור את שני האובייקטים באמצעות שתי עצירות שעונים. ברגע שהעכבר מגיע לזמן הקצוב המינימלי הכולל (30 s) עבור שני האובייקטים, לעצור את ההפעלה F1 ולהעביר את החיה לכלוב הבית שלה. אם העכבר אינו מצליח לחקור את האובייקטים עבור 30 s בתוך 20 דקות, הסר אותו מתיבת השדה הפתוחה והוצא אותה מהפעלות נוספות.
      הערה: מדוד את הזמן כאשר העכבר נוגע באובייקטים עם שפם, חוטם, או כפות הקדמיות שלו. אל לכמת כזמן גישוש כל התנהגויות שבו החוטם של בעל החיים אינו מצביע לעבר האובייקט, כגון ישיבה על האובייקט, עובר על ידי האובייקט, או נח עם האחוריים שלו מצביע על האובייקט.
    6. לאחר סיום המפגש ההיכרות הראשון (F1), לנקות ביסודיות את האובייקטים ואת צלחת הרצפה עם 70% תרסיס אתנול ולהסיר אותם מתיבת השדה הפתוח.
  2. ביום שלמחרת (יום 16), בצע את הפעלת ההיכרות השנייה (F2) עבור מבחן ה-PS.
    1. העבר את העכבר מכלוב הבית שלו לאזור השדה הפתוח למשך שלוש דקות, ולאחר מכן החזר את החיה לכלוב הבית שלו.
    2. במהלך ההרגלה, לנקות ביסודיות את האובייקטים ולוחית הרצפה המקודד עם 70% אתנול ולנגב עם מגבת נייר. המתינו לפחות 1 דקות עד ששאריות האלכוהול יבשו לחלוטין.
    3. מניחים את צלחת הרצפה (42.5 x 42.5 x 0.5 ס מ) עם רשת צרה (2.75 x 2.75 ס מ) בתיבת השדה הפתוחה ומניחים שני אובייקטים זהים (בקבוקי זכוכית, אובייקט E) בשדה הפתוח 5 ס מ הרחק מן הקירות הסמוכים. תקן את האובייקטים באמצעות קלטת דו-צידית. הציגו את העכבר הנסיוני בתיבת השדה הפתוחה מול הקיר המרוחק מהאובייקטים.
    4. לאיזון נגדי, הציגו שני עצמים זהים (פלסטיק T-מבחנות מלאים 50 mL של מים, אובייקט D) על רצפת הרשת הצר.
    5. אפשר חיפושי חינם 20 דקות ובאופן ידני למדוד את הזמן שהושקע לחקור את שני האובייקטים באמצעות שני stopwatches עונים. ברגע שהעכבר מגיע לזמן הקצוב המינימלי הכולל (30 s) עבור שני האובייקטים, לעצור את ההפעלה F2 ולהעביר את החיה לכלוב הבית שלה. אם העכבר אינו מצליח לחקור את האובייקטים עבור 30 s בתוך 20 דקות, הסר אותו מתיבת השדה הפתוחה והוצא אותה מהפעלות נוספות.
      הערה: מדוד את הזמן כאשר העכבר נוגע באובייקטים עם שפם, חוטם, או כפות הקדמיות שלו. אל לכמת כזמן גישוש כל התנהגויות שבו החוטם של בעל החיים אינו מצביע לעבר האובייקט, כגון ישיבה על האובייקט, עובר על ידי האובייקט, או נח עם האחוריים שלו מצביע על האובייקט.
    6. לאחר סיום מושב ההיכרות השני (F2), לנקות ביסודיות את האובייקטים ואת צלחת הרצפה עם 70% תרסיס אתנול ולהסיר אותם מתיבת השדה הפתוח.
  3. ביום הבא (יום 17), בצע את הפעלת בדיקת PS.
    1. העבר את העכבר מכלוב הבית שלו לאזור השדה הפתוח למשך שלוש דקות, ולאחר מכן החזר אותו לכלוב הבית שלו.
    2. במהלך ההרגלה, לנקות ביסודיות את האובייקטים ולוחית הרצפה המקודד עם 70% אתנול ולנגב עם מגבת נייר. המתינו לפחות 1 דקות עד ששאריות האלכוהול יבשו לחלוטין.
    3. מניחים את צלחת הרצפה עם רשת צרה (2.75 x 2.75 ס מ) בתיבת השדה הפתוחה ומניחים שני אובייקטים שונים (פלסטיק T-בקבוקון מלא עם 50 mL של מים, אובייקט D; בקבוק זכוכית, אובייקט E) על צלחת הרצפה 5 ס מ מן הקירות הסמוכים. תקן את האובייקטים באמצעות קלטת דו-צידית. העבר את העכבר הנסיוני על מכסה הכלוב לאזור השדה הפתוח ומניחים אותו מול הקיר.
    4. מאזן את האובייקטים שהוצגו יחד במהלך בדיקת ה-PS. לדוגמה, הצב כל אובייקט (אובייקט D, אובייקט E) בקומת הרשת הצרה כדי להפוך את האובייקט E לאובייקט הרומן בהקשר זה. איזון מנוגד למיקום האובייקט D או אובייקט E (אובייקט הרומן בתבנית הרצפה הצרה) ניתן לבצע גם כדי להקטין את הפוטנציאל להעדפה מולדת לכיוון מסוים. לדוגמה, החלף את האובייקט המועדף מהפעלת ההיכרות השנייה עבור מחצית מבעלי החיים הניסיוניים, ועבור שאר החיות, החלף את האובייקט המועדף פחות מההפעלה השניה של ההיכרות.
    5. אפשר 10 דקות של חיפוש והקלטה חינם באמצעות מערכת מעקב אחר וידאו. למדוד את הזמן שהושקע לחקור כל אובייקט באמצעות שתי עצירות שעונים ולחשב את יחס האפליה.
      הערה: מדוד את הזמן כאשר העכבר נוגע באובייקטים עם שפם, חוטם, או כפות הקדמיות שלו. אל לכמת כזמן גישוש כל התנהגויות שבו החוטם של בעל החיים אינו מצביע לעבר האובייקט, כגון ישיבה על האובייקט, עובר על ידי האובייקט, או נח עם האחוריים שלו מצביע על האובייקט.
    6. תפוס את הזנב של העכבר ניסיוני ומניחים אותו על המכסה כלוב להעביר את כלוב הבית שלה.

4. מכתים קרסיל סגול

  1. לאחר השלמת כל בדיקות ההתנהגות, לסמם את החיה על ידי הזרקת קוקטייל (4:0.5) של קטמין (50 mg/mL) ו xylazine (23.3 mg/mL) הומס מלוחים במינון של 110 mL/ק"ג משקל גוף (IP; 1 מזרק mL; 26 גרם מחט). בדקו את עומק ההרדמה. על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן
  2. לאחר החיה הוא מורדם עמוקות, לבצע הטרנדיאל זלוף עם 4% פאראמפורמלדהיד לתקן את המוח15.
  3. לאחר שהוא סיים את הפרזיה, הוא ערוף את ראשו של בעל החיים עם זוג מספריים15. ואז, להסיר את הגולגולת באמצעות זוג מספריים קשתית כדי לחשוף את המוח. לאחר המוח מבודד, לתקן את זה ב 4% פאראפורמלדהיד לילה, ואחריו הקפאה ב 30% סוכרוז ב 0.01 מ פוספט באגירה מלוחים.
  4. הפוך סעיפים ילתית (30 μm) מהמוח הקפוא באמצעות קריוסטט.
  5. הר רקמות המוח על שקופיות ולבצע סדרה של שלבי המים מ 100% אתנול כדי ברז מים על ידי שטיפת עבור 3 דקות ברציפות ב 100%, 95%, 90%, 80%, 70% אתנול.
  6. דגירה שקופיות רקמות ב 0.1% cresyl הפתרון הסגול עבור 15 דקות.
  7. הסרת כתם מוגזם על ידי האישר את שקופיות רקמות ב 95% אתנול/0.1% חומצה אצטית קרחוני, ולאחר מכן לבטל את הרקמות עם פתרונות של 100% אתנול, 50% אתנול/50% קסילן, ו 100% קסילן.
  8. כיסוי שקופיות רקמות באמצעות מדיום הרכבה זמין מסחרית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לוח זמנים ניסיוני כללי והגדרה להערכת תפקוד קוגניטיבי מוצגים באיור 1. שישה שבועות לאחר המבוא של התקפים המושרה של הפילקרואורן, העכברים היו חשופים ל-NL, NO, ו-PS בדיקות בסדר זה הופרדו על ידי שלושה תקופות מנוחה ביום בין בדיקות (איור 1A). עבור בדיקת NL, שני אובייקטים זהים הוצבו בשדה הפתוח במהלך הפעלת ההיכרות (F1), וביום שלמחרת, אובייקט אחד הועבר למיקום חדש. בבדיקה NO, אובייקט אחד הוחלף באחד חדש במהלך הפעלת הבדיקה. עבור מבחן ה-PS, שתי הפעלות ההיכרות (F1, F2) הציגו שיל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו מתארת הליכים ניסיוניים להערכת תפקוד קוגניטיבי בעכברים עם אפילפסיה כרונית. תבניות התנהגות שונות רבות משמשות להערכת פונקציות הלמידה והזיכרון בעכברים18. מבוך המים של מוריס, הזרוע הרדיאלי מבוך, Y-מבוך, מיזוג הפחד ההקשריים, ובדיקות מבוססות האובייקט הם המבחנים התנהגותיים הנפוצים ביותר ולספק תוצאות אמינות. ביניהם, המבחנים NL, לא, ו-PS הם יעילים, פשוט שיטות להערכת למידה וזיכרון בעכברים אפילפטי8,10. מכיוון שעכברים אפילפטי יכולים להיות בלתי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנחנו מודים לד ר ג'אי-מין לי. על התמיכה הטכנית שלו עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) מענקים ממומן על ידי ממשלת קוריאה (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019R1A2C1003958 A08000167).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 מ"לSung-shimהשתמש עם מחט 26 או 30 מד
70% אתנולDuksanUN1170ספריי לניקוי הקופסה והחפצים
וילוןלהימנעות מרמזים חזותיים מיותרים
Cresyl violetSigmaC5042עבור Cresyl סגול מכתים
קריוטוםLeicaE21040041לרקמות חיתוך
דביק דו צדדילמיקום יציב של החפצים
מדיום הרכבה DPXSigma06522
סדרת אתנולDuksanUN1170הכינו 100%, 95%, 90%, 80%, 70% פתרונות אתנול
צלחת רצפה עם דפוסי רשת צריםLeehyo-bioציוד ניסוי התנהגותי, גודל צלחת: 42.5 x 42.5 x 0.5 ס"מ, גודל רשת: 2.75 x צלחת רצפה 2.75 ס"מ
עם דפוסי רשת רחביםLeehyo-bioגודל צלחת: 42.5 x 42.5 x 0.5 ס"מ, גודל רשת: 5.5 x 5.5 ס"מ
מד תאורהTES Electrical Electronic Corp.1334Aלמדידת תאורת החדר (60 לוקס)
יחידת טיפול נמרץThermocare#W-1
קטמין הידרוכלורידYuhan7003השתמש להרדמת העכבר לזלוף דרך הלב
מנורת LEDLungoP13A-0422-WW-04תאורה לחפצי
חדר הבדיקה ההתנהגותייםבובת גומי, צינור פלסטיק 50 מ"ל, צנצנת קופלין מזכוכית, בקבוק T מפלסטיק,
בקבוק זכוכית קופסת שדה פתוחLeehyo-bioציוד ניסוי התנהגותי, גודל: 44 x 44 x 31 ס"מ
מגבת ניירYuhan-Kimberly47201השתמש לייבוש קופסת שדה פתוחה וחפצים
paraformaldehydeMerck Millipore104005הכינו תמיסה של 4%
פילוקרפין הידרוכלורידSigmaP6503
סרגל השתמש כדי לאתר את האובייקטים בתיבת השדה הפתוח
סקופולמין מתיל חנקתיסיגמאS2250הפוך מלאי פי 10
מערכת חכמה 3.0Panlabמערכת מעקב וידאו
שעון עצרJunsoJS-307למדידת פעילויות חקר של עכברים
סוכרוזSigmaS9378להגנה מפני הקפאה של קטעי רקמות
מלח טרבוטלין המיסולפטסיגמאT2528וידאו מלאי 10X
(מצלמת CCD)VisionVCE56HQ-12הנח את המצלמה ישירות מעל תיבת השדה הפתוח
קסילזין (רומפון)באייר קוריאהKR10381 השתמש כדי להרדים את העכבר לזלוף דרך הלב
קסילןדוקסןUN1307עבור צביעת סגול קרסיל
שחור סרט ציוד ניסוי התנהגותי , הכינו מצלמת

מקורות

  1. Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Mechanisms of disease - Epilepsy. New England Journal of Medicine. 349 (13), 1257-1266 (2003).
  2. Scharfman, H. E. The neurobiology of epilepsy. Current Neurology and Neuroscience Report. 7 (4), 348-354 (2007).
  3. Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nature Reviews in Neurology. 5 (7), 380-391 (2009).
  4. Breuer, L. E., et al. Cognitive deterioration in adult epilepsy: Does accelerated cognitive ageing exist. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 64, 1-11 (2016).
  5. Leeman-Markowski, B. A., Schachter, S. C. Treatment of Cognitive Deficits in Epilepsy. Neurology Clinics. 34 (1), 183-204 (2016).
  6. Helmstaedter, C., Elger, C. E. Chronic temporal lobe epilepsy: a neurodevelopmental or progressively dementing disease. Brain. 132, Pt 10 2822-2830 (2009).
  7. Groticke, I., Hoffmann, K., Loscher, W. Behavioral alterations in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in mice. Experimental Neurology. 207 (2), 329-349 (2007).
  8. Long, Q., et al. Intranasal MSC-derived A1-exosomes ease inflammation, and prevent abnormal neurogenesis and memory dysfunction after status epilepticus. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 114 (17), 3536-3545 (2017).
  9. Lima, I. V. A., et al. Postictal alterations induced by intrahippocampal injection of pilocarpine in C57BL/6 mice. Epilepsy & Behavior. 64, Pt A 83-89 (2016).
  10. Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nature Communication. 6, 6606(2015).
  11. Zhou, Q., et al. Adenosine A1 Receptors Play an Important Protective Role Against Cognitive Impairment and Long-Term Potentiation Inhibition in a Pentylenetetrazol Mouse Model of Epilepsy. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3316-3327 (2018).
  12. Jiang, Y., et al. Ketogenic diet attenuates spatial and item memory impairment in pentylenetetrazol-kindled rats. Brain Research. 1646, 451-458 (2016).
  13. Zhuo, J. M., et al. Young adult born neurons enhance hippocampal dependent performance via influences on bilateral networks. Elife. 5, 22429(2016).
  14. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  16. Muller, C. J., Groticke, I., Bankstahl, M., Loscher, W. Behavioral and cognitive alterations, spontaneous seizures, and neuropathology developing after a pilocarpine-induced status epilepticus in C57BL/6 mice. Experimental Neurology. 219 (1), 284-297 (2009).
  17. Brandt, C., Gastens, A. M., Sun, M., Hausknecht, M., Loscher, W. Treatment with valproate after status epilepticus: effect on neuronal damage, epileptogenesis, and behavioral alterations in rats. Neuropharmacology. 51 (4), 789-804 (2006).
  18. Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice. PLoS One. 11 (1), 0147733(2016).
  19. Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).
  20. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
  21. van Goethem, N. P., van Hagen, B. T. J., Prickaerts, J. Assessing spatial pattern separation in rodents using the object pattern separation task. Nature Protocols. 13 (8), 1763-1792 (2018).
  22. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  23. Moscovitch, M., Cabeza, R., Winocur, G., Nadel, L. Episodic Memory and Beyond: The Hippocampus and Neocortex in Transformation. Annual Reviews in Psychology. 67, 105-134 (2016).
  24. Eichenbaum, H. A cortical-hippocampal system for declarative memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 41-50 (2000).
  25. Brown, M. W., Aggleton, J. P. Recognition memory: What are the roles of the perirhinal cortex and hippocampus. Nature Reviews Neuroscience. 2 (1), 51-61 (2001).
  26. Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
  27. Winters, B. D., Bussey, T. J. Transient inactivation of perirhinal cortex disrupts encoding, retrieval, and consolidation of object recognition memory. Journal of Neuroscience. 25 (1), 52-61 (2005).
  28. Bermudez-Rattoni, F., Okuda, S., Roozendaal, B., McGaugh, J. L. Insular cortex is involved in consolidation of object recognition memory. Learning & Memory. 12 (5), 447-449 (2005).
  29. Akirav, I., Maroun, M. Ventromedial prefrontal cortex is obligatory for consolidation and reconsolidation of object recognition memory. Cerebral Cortex. 16 (12), 1759-1765 (2006).
  30. Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavior Brain Research. 285, 105-117 (2015).
  31. Cohen, S. J., et al. The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory. Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).
  32. Broadbent, N. J., Gaskin, S., Squire, L. R., Clark, R. E. Object recognition memory and the rodent hippocampus. Learning and Memory. 17 (1), 5-11 (2010).
  33. Tuscher, J. J., Taxier, L. R., Fortress, A. M., Frick, K. M. Chemogenetic inactivation of the dorsal hippocampus and medial prefrontal cortex, individually and concurrently, impairs object recognition and spatial memory consolidation in female mice. Neurobiology of Learning and Memory. 156, 103-116 (2018).
  34. de Lima, M. N., Luft, T., Roesler, R., Schroder, N. Temporary inactivation reveals an essential role of the dorsal hippocampus in consolidation of object recognition memory. Neuroscience Letters. 405 (1-2), 142-146 (2006).
  35. Hammond, R. S., Tull, L. E., Stackman, R. W. On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition memory. Neurobiology of Learning and Memory. 82 (1), 26-34 (2004).
  36. Clark, R. E., Zola, S. M., Squire, L. R. Impaired recognition memory in rats after damage to the hippocampus. Journal of Neuroscience. 20 (23), 8853-8860 (2000).
  37. Stackman, R. W., Cohen, S. J., Lora, J. C., Rios, L. M. Temporary inactivation reveals that the CA1 region of the mouse dorsal hippocampus plays an equivalent role in the retrieval of long-term object memory and spatial memory. Neurobiology of Learning and Memory. 133, 118-128 (2016).
  38. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  39. Jeong, K. H., Lee, K. E., Kim, S. Y., Cho, K. O. Upregulation of Kruppel-Like Factor 6 in the Mouse Hippocampus after Pilocarpine-Induced Status Epilepticus. Neuroscience. 186, 170-178 (2011).
  40. Kim, J. E., Cho, K. O. The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).
  41. Jiang, Y., et al. Abnormal hippocampal functional network and related memory impairment in pilocarpine-treated rats. Epilepsia. 59 (9), 1785-1795 (2018).
  42. Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
  43. Detour, J., Schroeder, H., Desor, D., Nehlig, A. A 5-month period of epilepsy impairs spatial memory, decreases anxiety, but spares object recognition in the lithium-pilocarpine model in adult rats. Epilepsia. 46 (4), 499-508 (2005).
  44. Benini, R., Longo, D., Biagini, G., Avoli, M. Perirhinal Cortex Hyperexcitability in Pilocarpine-Treated Epileptic Rats. Hippocampus. 21 (7), 702-713 (2011).
  45. Yassa, M. A., Stark, C. E. Pattern separation in the hippocampus. Trends in Neurosciences. 34 (10), 515-525 (2011).
  46. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  47. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-539 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הערכה של תפקוד הזיכרון בפילסוקרפיין-עכברים מבוססי אפילפסיה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.