מאמר שיטה

מתקשר לטווח ארוך-מיפוי מעגל בסיוע של היפוקולוס נוירונים בצבע כחול ואדום הוזז

6.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60760

⸱

7 בפברואר 2020

 , 
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

במאמר זה

סיכום

מיפוי מעגל בסיוע (CRACM) הוא טכניקה מדויקת עבור מיפוי פונקציונלי של הקרנות נוירואליות ארוכת טווח בין קבוצות מבחינה אנטומית ו/או גנטית מזוהה של נוירונים. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש CRACM כדי למפות את הקשרים שמיעתי גזע המוח, כולל השימוש של opsin העביר אדום, ChrimsonR.

תקציר

כאשר חוקרים את המעגלים העצביים, מגבלה סטנדרטית של הגישה מלחציים מחוץ למבחנה היא כי אקסונים ממקורות מרובים הם לעתים קרובות מעורבים, מה שמקשה על בידוד תשומות ממקורות בודדים עם גירוי חשמלי. עם זאת, על ידי שימוש במתקשרים מיפוי מעגלים (CRACM), מגבלה זו ניתן כעת להתגבר. כאן, אנו מדווחים על שיטה להשתמש ב-CRACM כדי למפות תשומות עולה מתוך גרעיני גזע שמיעתי נמוך המוח ואת תשומות מערכת למעמד מזוהה של נוירונים בתוך הקולקולוס הנחותים (IC), הגרעין המוח המימדי של מערכת השמיעה. ב-IC, מקומי, מבוקר, בסדר עולה, ויורד האקסון הם שזורים היטב ולכן ההבחנה עם גירוי חשמלי. על-ידי הזרקת מבנה ויראלי לביטוי כונן של מתקשר בגרעין טרום-סינפטית, ואחריו הקלטה של מהדק המדבקות כדי לאפיין את הנוכחות והפיזיולוגיה של מתקשרים-הבעת כניסות סינפטיות, תחזיות ממקור מסוים לאוכלוסייה מסוימת של הנוירונים IC ניתן למפות עם דיוק ספציפי לסוג תא. אנו מראים כי גישה זו פועלת עם כרונוס הן, מתקשר כחול המופעל באור, ו ChrimsonR, מתקשר אדום הוזז. בניגוד לדיווחים הקודמים מן המוח הקדמי, אנו מוצאים כי ChrimsonR הוא הנסחרות במורד האקסונים של נוירונים שבלול הראשי גרעין העיקרי, המציין כי ChrimsonR עשוי להיות כלי שימושי עבור ניסויים CRACM בגזע המוח. הפרוטוקול המוצג כאן כולל תיאורים מפורטים של ניתוח הזרקת וירוס בתוך המוח, כולל קואורדינטות סטריאוטקאית עבור זריקות המיקוד על הגרעין שבלול הראש ו IC של עכברים, וכיצד לשלב את כל ההקלטה התא השלם מהדק הקלטה עם הפעלת המתקשר כדי לחקור תחזיות לטווח ארוך כדי נוירונים IC. למרות פרוטוקול זה מותאם לאפיון תשומות שמיעתי ל-IC, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור תחזיות לטווח ארוך אחרים בגזע השמיעה ומעבר.

מבוא

חיבורים סינפטית הם קריטיים לתפקוד המעגל העצבי, אבל הטופולוגיה המדויקת והפיזיולוגיה של הסינפסות בתוך מעגלים עצביים קשים לעתים קרובות לחקור ניסויים. הסיבה לכך היא גירוי חשמלי, הכלי המסורתי של האלקטרופיזיולוגיה התאית, הפעלת אקטונים ללא אבחנה ליד האתר גירוי, וברוב אזורי המוח, אקסונים ממקורות שונים (מקומי, עולה, ו/או יורד) משתלבים. עם זאת, על ידי שימוש במתקשרים החוצה מיפוי מעגלים (CRACM)1,2, מגבלה זו יכולה כעת להתגבר על3. מתקשר (ChR2) הוא ערוץ יון סלקטיבי המופעל באור, שנמצא במקור ב-אצה Chlamydomonas ריינהרטהירוק. ChR2 יכול להיות מופעל על ידי אור כחול של אורך הגל סביב 450-490 ננומטר, להשבית את התא באמצעות הקטיון. ChR2 תוארה לראשונה והתבטא ב קסנפוס אוציטים על ידי nagel ועמיתיו4. זמן קצר לאחר מכן, Boyden ועמיתיו5 הביע ChR2 בנוירונים מיונקים והראו כי הם יכולים להשתמש פולסים אור כדי שליטה מהימנה העולה על ציר הזמן אלפית שניה, גרימת פוטנציאל הפעולה ~ 10 ms לאחר ההפעלה של ChR2 עם אור כחול. ערוצי אלקטרואופטיקה עם קינטיקה מהירה אף יותר נמצאו לאחרונה (למשל, כרונו6).

הגישה הבסיסית לניסוי CRACM היא העברה של אוכלוסיה של נוירונים פרסינפטיים מראש עם רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAV) הנושאת את המידע הגנטי עבור המתקשר. העברה של נוירונים עם rAAV מובילה לביטוי של המתקשר המקודד. בדרך כלל, המתקשר הוא מתויג עם חלבון פלורסנט כמו GFP (חלבון פלורסנט ירוק) או tdTomato (חלבון פלורסנט אדום), כך העברה של נוירונים באזור היעד יכול בקלות להיות מאושר עם הדמיה פלואורסצנטית. מכיוון raavs הם שאינם פתוגניים, יש פוטנציאל דלקתי נמוך לאורך זמן ביטוי גנים7,8, הם הפכו טכניקה סטנדרטית כדי לספק מתקשרים לנוירונים. אם, לאחר העברת האוכלוסייה הפרסינפטיות של הנוירונים, הפעלה של מתקשר דרך גלי האור מעורר את הפוטנציאל הפוסט-סינפטיות או הזרמים בנוירונים היעד, זוהי ראיה של חיבור האקסון מן הגרעין מזוהמים אל התא המוקלט. בגלל אקסונים קטוע ניסויים במוח יכול להיות מונע כדי לשחרר נוירוטרנסמיטור באמצעות הפעלת מתקשר, גרעיני כי לשקר מחוץ לפרוסה חריפה אבל לשלוח אקסונים לתוך אזור המוח פוסטסינפטית ניתן לזהות עם CRACM. העוצמה של טכניקה זו היא כי קישוריות ופיזיולוגיה של זיהה תשומות סינפטית לטווח ארוך ניתן לחקור ישירות.

בנוסף למתקשרים שאינם מתלהבים מאור כחול, החוקרים זיהו לאחרונה מספר מתקשרים אדום-הזזה9,10, כולל Chrimson ו כchrimsonr אנלוגי מהיר שלה, שניהם נרגשים עם אור אדום של ~ 660 ננומטר6. המצב האדום-השתנה מעניין בגלל שהאור האדום חודר לרקמה יותר טוב מאור כחול, ולאור האדום אולי יש רעילות נמוכה יותר מאשר אור כחול10,11,12. מתקשר אדום הוזז גם לפתוח את האפשרות של CRACM צבע כפול ניסויים, שבו התכנסות של אקסונים מגרעינים שונים על אותו עצב ניתן לבחון בניסוי אחד6,13,14. עם זאת, הנוכחי באדום העביר opsins לעתים קרובות לא רצויות הפעלה צולבת עם אור כחול15,16,17, ביצוע שני ניסויים בצבע קשה. בנוסף, דיווחים מסוימים ציינו כי chrimsonr עובר סחר סיבי מוגבל, אשר יכול להפוך אותו מאתגר להשתמש chrimsonr עבור CRACM ניסויים16,17.

כמעט כל התחזיות העולה מן גרעיני גזע שמיעתי נמוך להתכנס בתוך הקולקולוס הנחותים (IC), רכזת המוח באמצע של מסלול השמיעה המרכזי. זה כולל התחזיות של גרעין שבלול (CN)18,19, רוב הקומפלקס olivary מעולה (SOC)20, ואת הגרעין (dnll) ו (vnll) הגרעינים של עדשת המים הצדדיים21. בנוסף, הקרנה יורדת בירידה גדולה מקליפת השמיעה מסתיימת ב-18,19,20,21,22, ו-ic הנוירונים עצמם באופן כללי בתוך האונות המקומי והפנימי של23ic. התמזגות של אקסונים ממקורות רבים הפכה את זה קשה לחקור מעגלים IC באמצעות גירוי חשמלי24. כתוצאה מכך, אף על פי שנוירונים בחישובי הביצוע הIC חשובים ללוקליזציה וזיהוי של דיבור ותקשורת אחרים נשמע25,26, הארגון של מעגלים עצביים ב IC הוא ברובו לא ידוע. לאחרונה זיהינו נוירונים VIP כמו שיעור העצב הראשון המאפשר לזיהוי הראשונה ב-IC27. הנוירונים VIP הם glutamatergic stellate נוירונים כי הפרויקט למספר מטרות ארוכות טווח, כולל תלמוס השמיעה ואת הקולקולוס מעולה. כעת אנו מסוגלים לקבוע את המקורות והתפקוד של תשומות מקומיים וארוכי טווח לנוירונים VIP ולקבוע כיצד חיבורי מעגלים אלה תורמים לעיבוד קול.

הפרוטוקול המוצג כאן הוא מותאם לחקירת תשומות סינפטית אל הנוירונים VIP ב IC של עכברים, במיוחד מ IC הצלעות ו DCN (איור 1). ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול למקורות שונים של קלט, סוג תא שונה או אזור מוח שונה לחלוטין. אנו גם מראים כי ChrimsonR הוא מתקשר יעיל אדום העביר המתקשרים עבור מיפוי מעגלים ארוכי טווח בגזע המוח השמיעה. עם זאת, אנו מדגימים כי ChrimsonR מופעל בחוזקה על ידי אור כחול, אפילו בעוצמות נמוכות, ולכן, כדי לשלב ChrimsonR עם כרונו בשני צבעים CRACM ניסויים, פקדים זהירים חייב לשמש כדי למנוע הפעלה צולבת של ChrimsonR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

קבל אישור מתוך הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש (IACUC) ולדבוק הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בפרוטוקול זה אושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן IACUC והיו בהתאם הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. ההכנות כירורגיה

  1. לבצע ניתוחים בתנאים אספטי. אוטוקלב/לחטא את כל כלי ניתוח וחומרים לפני הניתוח. ללבוש שמלת כירורגיה ומסכה לניתוח.
  2. באזור הניתוח (רסס ונגב עם 70% אתנול), והניחו וילונות מגבת סטרילית כדי לכסות את אזור הניתוח.
  3. . הכן את כלוב ההחלמה להסיר מצעים בכלוב כדי להגביל את הסיכון של חנק. . שים משטח חימום מתחת לכלוב . תספק מקור למזון ולמים
  4. משוך את נימי הזכוכית בשביל. מזרק הננו על פולר בצנרת חום עז של חוט החימום במהלך תהליך המשיכת יעקר את נימי הזכוכית. גזור או לשבור את הקצה כדי לקבל פתיחה כ 5 יקרומטר קוטר.
  5. משופע את העצה נימי לזווית כ 30 ° כדי לשפר את חדירת הרקמה ולהפחית את הסתימה. ממלאים את הקפילר בשמן מינרלי ומכניסים לתוך מזרק נאנאוליטר.
  6. להשיג סדרת מחלקים של המתקשר הרצוי הקידוד raav ו לדלל את סיכוייו הרצוי באמצעות הPBS סטרילי.
    הערה: מצאנו כי הסרוטיפ 1 rAAVs לעבוד היטב עבור הזיהום של גרעיני גזע שמיעתי המוח. . באופן ספציפי, rAAV1. צין. כרונו-GFP. bGH (המתקשר אור כחול המופעל) ו rAAV1. Syn. כריסטאר-טדואק. WPRE. bGH (אדום-העברה משתנה), הזמינים ממאגרי וקטורים הנגישים באמצעות לונברית וליבות וקטוריות, בעקביות להניב רמות ביטויים גבוהים וסחר האקסון לטווח ארוך טוב של המתקשרים הדרושים לניסויים CRACM.
  7. עקוב אחר הוראות מזרק הקדמי מילוי נימי עם 1-3 μL של rAAV ב-PBS סטרילי.

2. כירורגיה

  1. לשים את החיה לתוך חדר אינדוקציה ולגרום הרדמה עם 3% isof, מועבר חמצן באמצעות מכשיר מתאדה מכויל. להתבונן בעכבר עד הנשימה הופך עמוק ואיטי הרפלקס צביטה הבוהן נעדר, כ 3-5 דקות.
  2. העבירו את בעל החיים. למסגרת סטריאוטקאית אבטחו את ראשו של בעל החיים על ידי הצבת הפה על מסכת חיך עם מסיכת הרדמה לגז ומיקום פסי אוזניים בשתי התעלות.
  3. הכנס בדיקה לטמפרטורה רקטלית ועבור לבקר הטמפרטורה הומסטטי.
  4. החל משחה אופטלמולוגית כדי למנוע מהעיניים להתייבש.
  5. ניהול כאבים מונעת (למשל, הזרקה תת עורית של 5 מ"ג/ק"ג carprofen).
  6. בהתאם לעומק המצב הורדם. הצג טמפרטורה, נשימה וצבע של קרום רירי לפחות כל 15 דקות במהלך ההליך.
  7. . לגלח את הקרקפת עם קוצץ חשמלי הכנת הקרקפת עם שלושה שפים לסירוגין של povidone-יוד ו 70% אתנול.
  8. בצע חתך בקרקפת לאורך קו האמצע החל בין האוזניים והמשך rostral לעיניים, חשיפת התפרים למדא וברז. לדחוף את העור לצד ולהסיר קרום העצם מהעצם חשוף במידת הצורך.
  9. מארק למדא תפר עם סמן כירורגי סטרילי, למקם את קצה הננו מזרק כך שהוא רק נגע למדא, ולאפס את קואורדינטות מיקרומניפולציה. השתמש בעצת הננו-מזרק ובמיקרומניפולציה כדי למדוד את ההפרש בהעלאת הגובה בין למדא לבין התפרים בברגמה. התאם את גובה פס החיך כדי להביא את למדא ואת ברסגמה בתוך ± 100 יקרומטר הפרש גובה.
  10. מפה את אתר ההזרקה באמצעות טיפ ננו מזרק מערכת קואורדינטות מיקרומניפולציה ולסמן את האתר עם סמן כירורגי סטרילי. כדי להזריק את IC או DCN של עכברים P21-P30, להשתמש קואורדינטות ביחס ללמדה תפר, כפי שמוצג בטבלה 1. שימו לב כי עומק Z בקואורדינטות שלנו נמדד מפני השטח של הגולגולת ב למדא.
  11. השתמש בתרגיל micromotor עם מקדחה סטרילי 0.5 מ"מ בר לבצע פתיחת הגולגולת מעל אתר ההזרקה.
  12. כדי להבטיח שינוי נרחב של נוירונים בגרעין היעד, לעשות זריקות בעומקים שונים לתוך הרקמה (שולחן 1, קואורדינטות Z), ו, במקרה של אזורים המוח גדול יותר כמו IC, לבצע זריקות על מסלול של שני חדירות או יותר בקואורדינטות X ו-Y שונים (שולחן 1, זכות החדירה Ic 1 ו-ימין החדירה
  13. לבצע זריקות. עבור זריקות IC, הפקדה 20 nL של וירוס במרווחים של 250 יקרומטר לאורך ציר Z (עומק ההזרקה) בין 2,250 יקרומטר ו 1750 יקרומטר עומק. עבור זריקות dcn, הפקדה 20 nL של וירוס בעומק של 4,750 יקרומטר ו 4,550 יקרומטר, בהתאמה.
  14. לאחר ההזרקה בכל קואורדינטת Z, המתן 2-3 דקות לפני הזזת מזרק לקואורדינטת Z הבאה. זה יאפשר זמן וירוס מפוזר הרחק מהאתר ההזרקה, הפחתת ההסתברות כי וירוס יהיה למצוץ את מערכת ההזרקה כאשר מזרק ננו ממקם מרחוק.
  15. לאחר ההזרקה האחרונה חדירה, לחכות 3-5 דקות לפני לנסוג ננו מזרק מהמוח.
  16. כאשר הננו-מזרק מוסר מן המוח בין חדירות ובין בעלי חיים, להוציא נפח קטן של וירוס מהקצה כדי לבדוק שהקצה לא היה סתום.
  17. לאחר זריקות, השתמש PBS סטרילי להרטיב את הקצוות לחתוך של הקרקפת ולאחר מכן בעדינות להעביר את העור חזרה לכיוון האמצע. סגור את הפצע עם תפרים מקוטע פשוטה באמצעות 6-0 (0.7 מטרי) תפרים ניילון.
  18. החל 0.5-1 מ ל של 2% ג'ל לידוקאין על הפצע.
  19. להסיר את פסי האוזן ולבדוק את הטמפרטורה, לכבות את isofלאנה, להסיר את העכבר מבר החיך ולהעביר אותו לכלוב ההתאוששות.
  20. . שחזור הפיקוח הדוק ברגע שהחיה ערה לגמרי, נעה מסביב, ולא מראה סימנים של כאב או מצוקה, העבירו אותו בחזרה לכלוב שלו והחזר את הכלוב לתוך הvivarium.
  21. אם הניתוחים יבוצעו על בעלי חיים מרובים ביום אחד, השתמש בעיקור חרוזים חם כדי להפעיל כלים לניתוח ולקדוח בבור לפני הניתוח הבא.

3. המשך טיפול כירורגי

  1. בדוק בעלי חיים מדי יום לסגירת פצע, זיהום, או סימנים של כאב או מצוקה במהלך 10 הימים הבאים, הקפדה על ההנחיות לטיפול בבעלי חיים.
  2. המתן 3-4 שבועות לפני השימוש בבעלי חיים בניסויים כדי לאפשר ביטוי אופטימלי של המתקשרים.

4. הכנת המוח ואישור הזרקת מטרה

  1. עבור CRACM, השתמש בפרוסות מוחית מוכנות ביותר מבעלי חיים מזוהמים בתקן בניסויים אלקטרופיזיולוגיה של מבחנה, המתוארים כאן רק בקצרה (ראה גוייר ואח ' 2019 לתיאור מפורט יותר27).
  2. הכנת נוזל מלאכותי שדרתי (ACSF) המכיל (ב mM): 125 הנאקל, 12.5 D-גלוקוז, 25 נחקו3, 3 kcl, 1.25 נה2PO4, 1.5 Cacl2, 1 mgso4. בועה ACSF pH של 7.4 עם 5% CO2 ב 95% O2.
  3. בצע את כל השלבים הבאים, כולל בפיזיולוגיה של החוץ, בחושך או באור אדום כדי להגביל את הפעלת המתקשרים.
  4. . וערוף את ראשו במהירות מנתח את המוח במהירות ~ 34 ° צ'.
  5. לגזור פרוסות ילתית (200-250 μm) המכיל את IC ב-~ 34 ° צ' צלזיוס עם מיקרוטומה רוטט ו דגירה את הפרוסות ב 34 ° צ' עבור 30 דקות בתא מחזיק מלא acsf בוקבלד עם 5% CO2 ב 95% O2. לאחר הדגירה, לאחסן פרוסות בטמפרטורת החדר עד לשימוש הקלטות.
  6. אם מטרת ההזרקה לא היה IC, לחתוך פרוסות מקוראליות נוספות של אזור המוח הוזרק ולבדוק את החיתוך של גרעין היעד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית. אם אין שינוי בגרעין היעד או בשיטת החצייה הנוספת באזורי מוח שונים, אל תמשיך בניסוי.

5. הקלטת וניסוי CRACM

הערה: כדי לספק גירוי אופטי של כרונו ו ChrimsonR, אנו משתמשים בנוריות בשילוב לנמל האפיסוננטית של המיקרוסקופ. עם זאת, לייזרים ניתן להשתמש במקום נוריות. אם באמצעות לייזרים, לקבל אישור מראש מפקידי בטיחות מוסדיים ולעקוב אחר ההנחיות המתאימות לשימוש לייזר בטוח.

  1. משוך אלקטרודות מזכוכית בורוסיליקט להתנגדות של 3.5-4.5 MΩ. הפתרון הפנימי של האלקטרודה צריך להכיל (ב-mM): 115 K-גלוקונאט, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2 פוספולוקראטין, 4 MgATP, 0.3 nagtp, שיושלם עם 0.1% biocytin (w/v), pH מותאם ל7.3 עם קו ו-osmolality ל290 mosm/ק"ג עם סוכרוז.
  2. כדי ליצור הקלטות, השתמש בשיטות הצבת תיקון סטנדרטיות. מניחים את הפרוסה בתא הקלטה תחת מיקרוסקופ בשלב קבוע זקוף באופן רציף עם ACSF ב ~ 2 mL/min. הקלטת הקלטות ליד הטמפרטורה הפיזיולוגית (~ 34-36 ° c).
  3. תיקון נוירונים תחת בקרה חזותית באמצעות מגבר מתאים מהדק תיקון. נכון לעמידות בסדרה, קיבוליות. ופוטנציאל הצומת הנוזלי
  4. במהלך הקלטות התאים השלם, הפעל כרונו על ידי אספקת פולסים קצרים (1-5 ms) של 470 ננומטר אור או ChrimsonR על ידי הפולסים קצר של 580 ננומטר אור דרך נוריות זמין מסחרית. קבע את הסף של ההפעלה אופסין והשתמש בפרוטוקול גירוי מינימלי כדי לעורר פוטנציאל פוסט-סינפטית. באופן כללי, להשתמש במשך הגירוי הקצר ביותר כי מעורר PSP, ולהגדיר את הכוח האופטי ל 120% מכוח הסף הנדרש כדי להפיק PSPs.
  5. כדי לאשר כי השינויים המוקלט בפוטנציאל הממברנה הם אכן כניסות סינפטית לעצב המוח, האנטוניסטים סטנדרטיים לקולטנים מתוך הפרסינפטיות/מעכבות ניתן לשטוף במהלך הניסוי. כדי לחקור תרומות שונות קולטן ל PSP (למשל קולטני NMDA vs האמפא), האנטוניסטים קולטן מתאים ניתן לשטוף. עבור כל יריב הקולטן, תופעות התרופה צריך להפוך לאחר כשלון.
  6. השתמש ההשהיה, להתעצבן, ומהימנות של PSPs לאשר כי אור המופעל כניסות סינפטית מקורם ישירה, הפעלה אופטית של הסינפסות על העצב המוקלט, בניגוד להפעלת המתקשרים המביעים-סינפסות ביטוי בהתערבות עצב הסינפסות. על תא העצב המוקלט באופן כללי, השהיה נמוכה (< 2 אלפיות הראשונה), להתעצבן נמוך (< 1 ms סטיית תקן בהשהיה), ואמינות גבוהה (> 50%) מצביעים על חיבור סינפטית ישיר של המתקשר המבטא תא העצב הפרסינפטית לעצב הבית המוקלט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חצינו את העכברים VIP-IRES-היצורים (viptm1 (היצורים) Zjh/J) ו Ai14-העיתונאי עכברים (B6. Cg-Gt (רוזה) 26SorTM14 (קאג-tdTomato) hze/j) כדי ליצור צאצאים F1 שבו הנוירונים VIP לבטא את החלבון פלורסנט tdtomato. הצאצאים F1 של שני המין שימשו, בגילאי יום הלידה (P) 21 אל P70. בסך הכל 22 בעלי חיים שימשו במחקר זה.

הזרקת סטריאוטקאית של AAV1. צין. כרונו-GFP. WPRE. bGH לתוך הימנית השמאלית של VIP-IRES-יצורי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מצאנו כי CRACM היא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי ואפיון תשומות סינפטית טווח ארוך לנוירונים בעכבר IC. בעקבות הפרוטוקול המפורט כאן, השגנו העברה חזקה של נוירונים ב-DCN ו-IC, כמו גם סחר האקאליות אמין של כרונו ו ChrimsonR למסופים סינפטית ב-IC. בנוסף, הדגמנו כי טכניקה זו מאפשרת מדידה וניתוח של אירועים פוסט סינפטיות, כולל משרעת PSP, חצי רוחב, ריקבון זמן, ו לקולטן לפרמקולוגיה. הניסיון שלנו מציע כי גישה זו יכולה להיות מותאם בקלות לבצע ניסויים פונקציונלי מיפוי מעגל במהלך המוח השמיעה ומעבר.

בסך הכל, הספציפיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מלגת מחקר של הדויטשה הגרמני (GO 3060/1-1, פרויקט מספר 401540516, ל-DG) ומכונים לאומיים של מענק בריאות R56 DC016880 (MTR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AAV1. Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGHAddgene59171-AAV1
AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGHAddgene59170-AAV1
עכברי דיווח Ai14 (B6. Cg-GT (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J)מעבדת ג'קסון#007914
ענבר (590 ננומטר) LUXEON Rebel LEDLuxeon Star LEDSP-01-A8
כחול (470 ננומטר) LUXEON Rebel LEDLuxeon Star LEDSP-01-B4
Carproject (קרפרופן)הנרי שיין בריאות בעלי חיים59149
נימי דראמונד גלסחברת דראמונד סיינטיפיק3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3Drummond Scientific Company3-300-207
אלקטרודה bevelerSutter InstrumentFG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 מטרי) תפרי ניילוןEthiconבית מרקחת
מיקרוסקופ שלב קבועכלn/a
מחזיק ראש הרדמה בגזדיוויד קופף מכשירים933-B
כלי כירורגיה כלליתכלי מדע עדיןN/A
קוצץ חיות מחמד זהב A5אוסטר078005-010-003
כרית חימוםבנייה מותאמת אישיתN/A
תא אינדוקציה עם ברדס עם מערכת ואקוםPatterson Scientific78917760
מעקר חרוזים חם Steri 250InotechIS-250
תמיסת יוד 10%MedChoice בית מרקחת
וופורייזר איזופלורןפטרסון סיינטיפיק07-8703592
לידוקאין ג'לי מקומי 2%מרקחתאקורן
מקדחה מיקרו מנוע 1050הנרי שיין בריאות בעלי חיים7094351
מקדחי מנוע מיקרו 0.5 מ"מכלי מדע עדינים19007-05
מיקרומניפולטור ממונעמכשיר סאטרMP-285 / R
משחת עיניים דמעות מלאכותיותבית מרקחת מקומיAkorn
חולץ אלקטרודותמכשיר סאטרP-1000
תיקון מהדק מגבר כולל תוכנה לרכישת נתוניםכלN / a
מכונת הרדמה ניידתפטרסון מדעי07-8914724
מסגרת סטרוטקסית לבעלי חיים קטניםDavid Kopf Instruments930-B
כימיקליםסטנדרטיים ספקים מקומייםN/A
פתרונות
סטנדרטיים וילונות מגבת סטרילייםDynarex4410
טוש כירורגיFine Science Tools18000-30
בקר טמפרטורהבנייה מותאמת אישיתN/A
Vibratomeכלעכברי
VIP-IRES-CRE (Viptm1(cre)Zjh/J)מעבדת ג'קסון#010908
אמבט מיםכלn/a
מלאי מקומימקומי בית מקומי P-1000 הדמיה מלאי

מקורות

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  6. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
  7. Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
  8. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
  9. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
  10. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
  11. Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
  12. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
  13. Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52(2018).
  14. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 1029-1034 (2015).
  15. Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
  16. Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485(2018).
  17. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  18. Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
  19. Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
  20. Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
  21. Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
  22. Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
  23. Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
  24. Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  25. Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
  26. Winer, J. A., Schreiner, C., et al. The inferior colliculus: with 168 illustrations. Winer, J. A., Schreiner, C. , Springer. New York, NY. (2005).
  27. Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole Cell Patch ClampChronos ChrimsonR

מאמרים קשורים