מאמר שיטה

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

DOI:

10.3791/60766

⸱

11 בפברואר 2020

1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) לתאר רצף משתנה מאוד של מומים התפתחותיים המושרה אתנול, כולל מורפולוגיות הפנים וליקויים נוירולוגיים. עם פתולוגיה מורכבת, FASD משפיע על כ 1 ב 100 ילדים שנולדו בארצות הברית בכל שנה. בשל האופי המשתנה מאוד של FASD, מודלים בעלי חיים הוכיחו ביקורתית הבנה המכונה הנוכחי שלנו של פגמים המושרה בפיתוח אתנול. מספר גדל והולך של מעבדות התמקד בשימוש בדגים כדי לבחון פגמים התפתחותיים המושרה אתנול. Zebrafish לייצר מספר גדול של הופרות חיצוני, מעוקב גנטית, עוברים שקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט בדיוק בעיתוי והמינון של חשיפה אתנול בהקשרים גנטיים מרובים לכמת את ההשפעה של חשיפה האתנול עובריים באמצעות טכניקות הדמיה חיה. זה, בשילוב עם הרמה הגבוהה של שימור של גנטיקה ופיתוח עם בני אדם, הוכיחה הדגים להיות מודל רב עוצמה שבו ללמוד את הבסיס המכונה של הטרוגניות האתנול. עם זאת, חשיפה האתנול משטרי יש מגוון בין מחקרים שונים דג זברה, אשר יש לבולבל את הפרשנות של נתוני דג זברה על פני מחקרים אלה. הנה פרוטוקול כדי כמת ריכוזי האתנול בעוברי דג דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מתאר מגוון רחב של ליקויי נוירולוגיות ו הגולגולת דיסקוורפולוגיות הקשורים לחשיפה האתנול העובריים1. גורמים מרובים, כולל עיתוי ומינון של חשיפה אתנול ורקע גנטי, לתרום וריאציה של fasd2,3. בבני אדם, מערכת היחסים המורכבת של משתנים אלה עושה לימוד והבנה של האטיולוגיה של FASD מאתגרת. דגמי בעלי חיים הוכיחו באופן קריטי בפיתוח ההבנה שלנו לגבי הבסיס המכניסטי של האתנול הטרוגניות. מגוון רחב של מערכות מודל בעלי חיים נעשה שימוש כדי ללמוד היבטים מרובים של FASD ותוצאות היו עקביים במידה ניכרת עם מה נמצא בחשיפה בבני אדם4. מערכות דגם מכרסמים משמשים כדי לבחון היבטים רבים של fasd, עם עכברים להיות הנפוצים ביותר5,6,7. רוב העבודה התמקדה פגמים התפתחותיים לחשיפה מוקדמת של אתנול8, למרות מאוחר יותר חשיפה לאתנול הוכח לגרום לחריגות התפתחותיות כמו גם9. יתר על כן, היכולות הגנטיות של עכברים סייעו מאוד היכולת שלנו לחקור את בסיס גנטי של fasd10,11. מחקרים אלה בעכברים מצביעים מאוד על כך יש אינטראקציות ג'ין אתנול עם מסלול קיפוד סוניק, חומצה retinoic איתות, סופראוקסיד dismutase תחמוצת חנקן סטנדרטים I, Aldh2 ו Fancd28,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 5, 19,19,19, 19,20,21. מחקרים אלה מראים כי מודלים בעלי חיים הם קריטיים כדי לקדם את ההבנה שלנו של FASD ואת המנגנונים הבסיסיים שלה.

דג דג זברה התפתחה כמערכת דגם רב עוצמה כדי לבחון היבטים רבים של אתנול teratogenesis22,23. בשל ההפריה החיצונית שלהם, פוריות גבוהה, מעקב גנטי, ויכולות הדמיה חיה, מתאימים באופן אידיאלי לגורמי לימוד כגון עיתוי, מינון, וגנטיקה של האתנול teratogenesis. האתנול יכול להינתן לעוברים מבויים בדיוק והעוברים יכולים להיות בתמונה כדי לבחון את ההשפעה הישירה של אתנול במהלך תהליכים התפתחותיים. עבודה זו יכולה להיות קשורה ישירות לבני אדם, כי התוכניות הגנטיות של הפיתוח הם שימור מאוד בין דג ובני אדם ולכן יכול לעזור להנחות FASD מחקרים אנושיים24. בעוד דגים שימשו כדי לבחון את האתנול teratogenesis, חוסר הסכמה בדיווח ריכוזי אתנול עובריים עושה השוואה לבני אדם קשה25. במערכות היונקים, רמות אלכוהול בדם מתאם ישירות לרמות האתנול של רקמות26. רבים ממחקרי הדגים מתייחסים לעוברים לפני היווצרות מוחלט של מערכת הדם שלהם. ללא מדגם אימהי לבחון, תהליך להערכת ריכוזי אתנול נדרש כדי לכמת את רמות האתנול בתוך העובר. כאן אנו מתארים תהליך לכמת ריכוזי אתנול בתוך העובר בפיתוח דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז שטח הראש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל העוברים דגים בשימוש בהליך זה הועלו והתרבו בעקבות הוקמה פרוטוקולים IACUC27. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס באוסטין ובאוניברסיטת לואיוויל.

הערה: קו הדגים Tg (fli1: EGFP)y1 שימש במחקר זה28. כל המים המשמשים בהליך זה הוא סטרילי מים אוסמוזה הפוכה. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות ה8.2.1 מנסרה.

1. הפיכת מדיה לעובר

  1. כדי להפוך את מלאי 20x של מדיה העובר, לפזר 17.5 g של הנרוג, 0.75 g של KCl, 2.9 g של CaCl2, 0.41 g של K2hpo4, 0.142 g של NA2Hpo4, ו 4.9 g של mgso4· 7h2O ב 1 ליטר של מים. התעלם מהזרז הלבן בטפסים; פעולה זו לא תשפיע על המדיה. המסנן מעקר את פתרון המניה ומאחסן אותו ב-4 ° c.
  2. כדי ליצור את פתרון המדיה העובר עובד, לפזר 1.2 g של נחקו3 ב 1 L של 20x העובר מניות מדיה ולהוסיף 19 L של מים. שמרו על פתרון המדיה של העובר הפועל ב -28 ° c.

2. מדידת נפח עובריים באמצעות הזחה במים

הערה: בפרוטוקול זה, משמשות 24 שעות הפריה (hpf) עוברים (איור 1). העוברים המשמשים במדידות אמצעי האחסון אינם משמשים בניתוח האתנול.

  1. מקום 10 עוברים ונוזלים מתחלקים ב 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח של 250 μL (איור 2א). הוסיפו מים לקו המילוי של 250 μL (ראו דגימת מים צבועים באיור 2ב').
  2. חזור על שלב 2.1 כדי להגדיר את נפחים עבור עוברים שהוסרו מורמונים.
    1. כדי להסיר את chorion, למקם את העוברים בתוך כורכותיהם בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 2 מ"ג/mL של קוקטייל פרוטאז במדיה העובר בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות. כל כמה דקות, מערבולת בעדינות את העוברים כדי לשבור את הצ.
    2. לאחר כל העוברים הם חופשיים chorion שלהם, להסיר את העוברים מתוך מדיה העובר הפרוטאז/קוקטייל מקום חדש 100 מ"מ צלחת פטרי עם מדיית העובר טרי לשטוף את העוברים. חזור על השטיפה הזאת עוד פעם אחת (בסכום של 2 שטיפות). העבירו את העוברים לצלחת פטרי חדשה 100 מ"מ.
  3. בעזרת הטיפ הקטן ביותר האפשרי ומבלי לפגוע בעוברים, הסירו בזהירות את כל הנוזלים מסביב לעוברים באמצעות p200 מיקרופיפיאור (איור 2ג) ושוקלים את המים בקנה מידה עם < 0.1 מ ג בדיוק. כדי לקבוע את נפח המדגם של 10 עוברים, להפחית את המשקל/הנפח של המים (1 mL של מים = 1 גרם של מים.) הוסרו מ 250 μL. כדי לקבוע את הנפח של העובר בודד, לחלק את ההפרש בין 250 μL ואת משקל המים הוסרו על ידי 10.

figure-protocol-1

figure-protocol-2

3. טיפול בעוברים באתנול

  1. אסוף עוברים ממיכלי ההזדווגות ומקום בצלחת פטרי 100 מ"מ סטנדרטית. לספור את לא יותר מ 100 עוברים לכל צלחת פטרי אחת הדגירה ב 28.5 ° c.
    הערה: אם chorion יוסר (שלב 2.2), זה צריך להיות מוסר לפני הוספת אתנול.
  2. ב 6 hpf, להוסיף עד 100 עוברים תקן חדש 100 מ"מ צלחת פטרי או עם העובר מדיה או העובר מדיה + 1% אתנול (v/v). כיסוי, אבל לא לאטום את צלחת פטרי. מניחים את העוברים בחממה הטמפ ' הנמוכה שנקבעה ב-28.5 ° צ' למשך 18 שעות, או עד שהעוברים יגיעו לנקודת הזמן ההתפתחותית של 24 hpf.

4. הכנת זרימת עבודה לפני עיבוד העוברים עבור גז החלל הראשי כרומטוגרפיה

  1. לעשות פתרון של 5 M הנאל במים (450 μL יהיה צורך בכל שפופרת לדוגמה) כדי להפוך את כל החלבונים ולמנוע חילוף החומרים אתנול. הפוך את קוקטייל הפרוטאז (טבלת חומרים) בריכוז של 2 מ"ג/mL במדיה העובר.
  2. תווית a 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ו 2 mL גז כרומטוגרף בקבוקון עבור כל מדגם. תווית נוספת 2 מ ל כרומטוגרף גז מבחנות עבור תקני האתנול שתוארו להלן, כמו גם אוויר, מים, ו 5 כדורי משקה מדיום/פרוטאז.
  3. כוונן שלושה p200 מיקרופיפטורים שניים מוגדרים ל-50 μL, והקבוצה השלישית ל-200 μL; p1000 מיקרופיפיאו מוגדר ל-450 μL ומיקרופיפיפיפיאור p2 מוגדר ל-2 μL. עבור פיפטות זכוכית המשמש להעברת עוברים מצלחות פטרי לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, במהירות לעבור את העצה באמצעות הלהבה כדי להחליק את הקצוות כדי לא לפגוע העוברים כאשר למשוך אותם לתוך הפיפטה.

5. עיבוד עוברי גז כרומטוגרפיה בחלל הראש

הערה: שני העוברים בורחוריהם ואלה שהוסרו בעבר מהורמונים שלהם מטופלים באופן זהה לעקביות בחישוב גורמי דילול.

  1. באמצעות שני p200 מיקרופיפטורים להגדיר ל50 μL, לצייר 50 μL של פתרון הקוקטייל פרוטאז לתוך אחד ולצייר 50 μL של מים אל השני.
  2. באמצעות פיפטה זכוכית ומיקרופיפיאור, מניחים במהירות 10 עוברים (משלב 3.2) בצינור המיקרו-מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL וסוגרים את המכסה (כמתואר באיור 2א). חזור על כל הדגימות כדי להיבדק, פקדים, והעוברים שטופלו אתנול.
  3. באמצעות p200 מיקרופיפיאור להגדיר μL, 200 לפתוח במהירות את כובע ולהסיר את כל מדיית העובר שיורית (כפי שמתואר באיור 2ג). מקום במהירות את הפיפטה המכיל 50 μL של מים בצינור במהירות אך בעדינות (לא לפגוע העוברים) להוסיף, ולאחר מכן להסיר את המים. הוסף במהירות 50 μL של פתרון קוקטייל פרוטאז מתוך הפיפטורים הממתינים וסגור את כובע הצינור (איור 2ד).
    הערה: בצע תהליך זה מדגם אחד בכל פעם.
  4. תן את המדגם לשבת ב-RT עבור 10 דקות כדי לאפשר קוקטייל פרוטאז לבזות את chorion. לאחר מכן, להוסיף במהירות 450 μL של 5 M הנאל ולסגור את כובע הצינור (איור 2E). מערבולת הדגימות עבור 10 דקות. כדי להאיץ את התהליך, להגדיר את המיקסר כדי מערבולת דגימות מרובות באותו זמן.
    הערה: הוסף כמות קטנה (~ 100 μL) של תערובת חרוזים סיליקה (2 גדלים, 0.5 מ"מ ו 1 מ"מ חרוז) לכל צינור עם עוברים מבוגרים יותר 24 hpf. בעוברים מבוגרים, מיתר הנוטואקורד יישאר שלם בלי קשר לכמה זמן הם הומוגניים.
  5. לאחר הומוגניזציה עבור 10 דקות, להסיר במהירות 2 μL של העובר הומוגניים מוליך supernatant ולהוסיף בקבוקון כרומטוגרף גז. אטום במהירות את המבחנה. עם כובע הפוליטאואתילן

6. הכנת תקני תקשורת ואתנול

  1. כדי להכין את תקני המדיה, לדלל את המדיה על ידי פקטור של 10 עם פתרון של 5 M/פרוטאז קוקטייל. הוסף 2 μL של כל מדגם לבקבוקון כרומטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארברואואתילן.
  2. כדי להכין את תקני אתנול, ליצור דילול סדרתי של 100% אתנול בתוך 5 M התקן/פרוטאז הפתרון לריכוזים הבאים: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, ו 40 mM. הוסף 2 μL של כל תקן לבקבוקון כרומאטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארבאואתילן.

7. הכנת כרומאטוגרף גז החלל הראשי

הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את ההתקנה והפרוטוקול בהתאם לשימוש בכרומטוגרף הגז. גז כרומטוגרפיה של החלל הראשי משמש לכמת רמות אתנול, לא להפרדה.

  1. הגדר את התנור עבור הדגם האוטומטי עד 58 ° c והפעל. אפשר את החימום כדי להגיע 58 ° c, ולהדליק את האוויר ואת קווי גז מימן האכלה כרומטוגרף גז (להבה יינון המשמש לכמת את האתנול).
    הערה: psi צריך להיות מוגדר כראוי להפעיל את chromatograph על פי מפרטים של היצרן. וודא שקו ההליום מופעל. ומכוון למסילה הנכונה
  2. בשביל המחיצה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו > 100. עבור סיבי ההזרקה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו > 500.
    הערה: אם מדובר על כמות הזריקות, יהיה עליהם לשנות אותם לפני הפעלת דגימות הבדיקה.
  3. הפעל את תוכנת הניתוח וודא שתחנת העבודה מוגדרת כראוי. אחסן את כל הנתונים לפי תקני מעבדה/מחלקה. צור רשימה מדגם חדשה כדי שהדגימות יופעלו.
  4. הפעל את שיטת ההפעלה והמתן עד שגלאי הלהבה לייצוב יתייצב לפני הפעלת הדגימות. פעם אחת יציבה, הפעל את שיטת ההפעלה של התוכנה כדי לנקות את סיבים.

8. מדידות לדוגמה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

  1. לאחר השלמת שיטת האתחול, צור שורה חדשה אחת לכל מדגם ברשימה לדוגמה. מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח, טען 436 שליטת האתנול spme 2013 3min לקלוט 2_5min rg לרוץ. מתאמפטמין עבור כל דוגמה ברשימת המדגם.
    1. מלאו את הרשימה לדוגמה, החל מהאוויר, מים, 5 כדורי משקה מדגם "נl/פרוטאז". לאחר מכן הזן את הסטנדרטים לפי סדר, מ 0.3125 עד 40 mM. עקבו אחר הסטנדרטים בסיבוב השני של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.
    2. הזן את כל דגימות סופר הומוגניים העובר כדי להיבדק, מן הנמוך ביותר לריכוז האתנול החזוי ביותר. מסתיים בכניסה לסיבוב השלישי והאחרון של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.
  2. הוסף את מבחנות כרומטוגרף הגז לדגם האוטומטי בסדר בו הוזנו הדגימות. אפשר דוגמאות לחימום במשך 10 – 15 דקות. הפעל את הדוגמה המופעלת בתוכנה.
  3. לאחר הפעלת כל הדגימות והרווחים הסופיים, הפעל את שיטת הכיבוי בתוכנה על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימה לדוגמה והפעלה במצב המתנה. לילא. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך הפעלת המדגם. כבו את הציוד בסדר הבא: מדוד חימום אוטומטי, מיכל מימן, רק לאחר טמפרטורת chromatograph מגיע 30 ° c, מיכל האוויר. תשאיר את מיכל ההליום. כדי לשמר את עמוד השעווה

9. לדוגמא שילוב של מפיק האתנול וניתוח ריכוז לדוגמה

הערה: כל הערכים מ-9.3 ב-, חושבו בקובץ excel שכל המשוואות התמלאו מראש.

  1. לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומאטוגרם הפתוח . פתח את התיקיה המכילה את התוצאות. דגימות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו.
  2. בתוצאות, ודא שהפסגות הנכונות שולבו (פסגות האתנול בין 2 ל-2.5). לאחר שכל הדגימות אושרו, להדפיס או לייצא את התוצאות.
  3. התווה את גובה השיא של תקני האתנול בגרף. חישוב השיפוע, Y ליירט ו-R2 ערכים עבור תקני אתנול (r2 צריך להיות > 0.99).
    הערה: ערכים אלה ישמשו לקביעת ריכוז האתנול מגובה המדגם.
  4. לכל דוגמה, הפחת את גובה השיא של המדגם מנקודת החיתוך של ה-Y של תקני האתנול. חלק ערך זה על-ידי השיפוע של תקני האתנול כדי להשיג את ערך האתנול עבור כל מדגם בבקבוקונים GC.

figure-protocol-3

  1. כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, לחשב תחילה את פקטור הדילול עבור כל דוגמה. לקחת את אמצעי האחסון מחושב בשלב 2.3 של פרוטוקול זה ולחלק אותו על ידי מדידת אמצעי האחסון בתוספת 500 μL. זה מייצג את התמיסה 5 מ ' ליטר/פרוטאז שנוספו לכל מדגם במהלך עיבוד העובר (שלבים 5.3 ו 5.4).

figure-protocol-4

  1. בעזרת פקטור הדילול לדוגמה, הכפל לפי ערך האתנול לדוגמה עבור כל דוגמה. התוצאות יהיו בריכוז mM. חישוב דגימות של הפניית מדיה על-ידי הכפלת ערך האתנול של המדיה בפקטור הדילול של 10.

figure-protocol-5

figure-protocol-6

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות האתנול בדם לא יכול להיקבע ב zebrafish מוקדם, כי הם חסרי מערכת הדם שנוצר במלואו. כדי לקבוע את רמת הריכוז האתנול בעוברי הדגים דג זברה, רמות האתנול נמדדות ישירות מרקמת הומוגניים מעובריים. כדי למדוד כראוי את ריכוזי האתנול עובריים, נפח עובריים יש לקחת בחשבון. העובר (החלמון מוצמד) יושב בתוך הצ (קליפת ביצה) מוקף בנוזלים מעובריים (איור 1). כל אמצעי האחסון של העובר צריך להתבצע על עוברים בזמן החשיפה, כי נפח עובריים ישתנה על פני זמן התפתחותי כאשר העובר גדל בגודל. בנוסף, איך העובר מעובד יש לקחת בחש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמערכת מודל התפתחותית, הדגים מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של גורמים סביבתיים בפיתוח. הם מייצרים מספר גדול של עוברים מופרות חיצוני, אשר מאפשר תזמון מדויק ומינון בלימודי אתנול. זה, בשילוב עם יכולות הדמיה חיה ושימור גנטי והתפתחותי עם בני אדם, להפוך את הדגים מערכת מודל רבת עוצמה ללימודי התרולוגיה. מתוארים הוא פרוטוקול למדידת ריכוזי אתנול עובריים בפיתוח העוברים ומדגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.

קביעת ריכוז האתנול העובריים הוא קריטי כדי להבין את ההשפעה של אתנול לעובר המתפתח. במודלים של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר המוצג במאמר זה היה נתמך על ידי מענקים קודמים מן המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר הגולגולת (NIH/נדבך) R01DE020884 ל J.K.E. והמכון הלאומי לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ואלכוהוליזם (NIH/NIAAA) F32AA021320 כדי C.B.L. ועל ידי המענק הנוכחי מן המוסדות הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות (NIH/NIAAA) R00AA023560 כדי C.B.L. אנו מודים לרואבן גונזלס למתן ולסייע בניתוח כרומוטוגרף גז. אנחנו מודים לטיטנה בונטיקוס. וד ר ג'ינה נובלס כותבים עזרה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אווירמסופק בחוזה לאוניברסיטה
מאזן אנליטיVWR10204-962
AutoSampler, CP-8400Varianגז כרומטוגרף Autosampler
סידן כלורידVWR97062-590
אתנולDecon Labs2701
בקבוקון כרומטוגרף גז עם מחיצת פוליטטרפלואורואתילן/סיליקון וכובע פלסטיק 2 מ"לAgilent8010-0198יכול לעשות שימוש חוזר בבקבוקונים לאחר הניקוי, אך לא במכסים/מחיצות
כרומטוגרף גז, CP-3800Varian
Heliumמסופק בחוזה לאוניברסיטה
HP Innowax עמוד נימיAgilent19095N-123I30 מ' x 0.53 מ"מ x 1.0 μ m סרט עבה
Hyrdogenמסופק בחוזה לאוניברסיטה
מגנזיום סולפט (Heptahydrate)Fisher ScientificM63-500
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לFisher Scientific2682002
קצות מיקרופיפטה 10 μ LFisher Scientific13611106
טיפים למיקרופיפטות 1000 μ LFisher Scientific13611127
קצות מיקרופיפטה 200 μ Lפישר סיינטיפיק13611112
צלחות פטרי 100 מ"מפישר סיינטיפיקFB012924
פיפטמן L p1000L מיקרופיפטהגילסוןFA10006M
פיפטמן L p200L מיקרופיפטהגילסוןFA10005M
פיפטמן L p2L מיקרופיפטהגילסוןFA10001M
מחיצת פוליטטרפלואורואתילן/סיליקון ו כובע פלסטיקAgilent5190-7021מכסי החלפה/מחיצות לבקבוקוני כרומטוגרף גז
אשלגן כלוריפישר סיינטיפיקP217-500
אשלגן פוספט (דו-בסיסי)VWRBDH9266-500G
פרונאזVWR97062-916
חרוזי סיליקה .5 מ"ממוצרי Biospec11079105z
חרוזי סיליקה 1.0 מ"מBiospec Products11079110z
נתרן ביקרבונטVWRBDH9280-500G
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS271-500
נתרן פוספט (דו-בסיסי)Fisher ScientificS374-500
מכלול סיבים מיקרו-מיצוי בשלב מוצק Carboxen/PolydimethylsiloxaneMillipore Sigma57343-Uסיבים חלופיים
כוכב כרומטוגרפיה תחנת עבודהתוכנת כרומטוגרפיהוריאן
תרמוגרין דימום נמוך (LB-2) SeptaMillipore Sigma23154מחיצת כניסה חלופית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067(2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999(2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142(2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ethanol QuantificationHead Space Gas ChromatographyZebrafish EmbryosFetal Alcohol Spectrum DisordersProtease Cocktail TreatmentEmbryo Volume MeasurementGas Chromatography AnalysisEthanol Concentration CalculationMedia Reference SamplesEmbryonic Water Content

מאמרים קשורים