יצרנו דרך יעילה לדלל את חיידקי המעיים תוך שלושה ימים, ולאחר מכן השתלנו מיקרוביוטה צואתית באמצעות נוזל צואה שהוכן מתכולת מעיים טרייה או קפואה בעכברים. אנו גם מציגים שיטה אופטימלית לאיתור תדירות החיידקים המצופים IgA במעיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתלת מיקרוביוטה צואתית וזיהוי שכיחות חיידקים מצופים IgA במעיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
למיקרוביוטה של המעיים יש תפקידים פליאוטרופיים בבריאות האדם ובמחלות. השתלת מיקרוביוטה צואתית (FMT) היא שיטה יעילה לחקירת התפקוד הביולוגי של חיידקי המעיים בכללותם או ברמת המין. פורסמו מספר שיטות FMT שונות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול FMT שמדלדל בהצלחה את מיקרוביוטת המעיים תוך ימים ספורים, ואחריו השתלת מיקרוביוטה צואתית מתכולת מעיים טרייה או קפואה של תורם לעכברים רגילים. PCR בזמן אמת מיושם כדי לבדוק את היעילות של דלדול חיידקים. לאחר מכן מיושם ריצוף של ה-RNA הריבוזומלי 16S (rRNA) כדי לבדוק את השפע והזהות היחסיים של מיקרוביוטת המעיים בעכברים מקבלים. אנו מציגים גם שיטת זיהוי מבוססת זרימה ציטומטרית של חיידקים מצופים אימונוגלובולין A (IgA) במעיים.
מבוא
מיקרוביוטה מגוונת של המעיים ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס של המארח. מיקרוביום זה מסייע בתהליכים פיזיולוגיים שונים החל מעיכול וספיגה של חומרים מזינים מהמזון, הגנה מפני זיהום של פתוגנים, ויסות התפתחות מערכת החיסון והומאוסטזיס חיסוני1. הפרעה בהרכב חיידקי המעי נקשרה למחלות רבות, כולל סרטן2, מחלות אוטואימוניות3, מחלות מעי דלקתיות4, מחלות נוירולוגיות5 ומחלות מטבוליות 6,7. עכברים נטולי חיידקים (GF) הם כלים רבי עוצמה במודלים של השתלת מיקרוביוטה צואתית לחקר ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לתקנות האתיות הנוכחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים בסין.
הערה: בעלי חיים שוכנו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים (SPF), מבוקרת במחזורי אור וחושך של 12 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. מזון הוקרן לפני שהוזן לעכברים. מי השתייה והכלובים עברו חיטוי לפני השימוש. עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות שימשו במחקר לאחר שבוע אחד של התאקלמות. הם חולקו למספר קבוצות על סמך תכנון הניסוי. כל קבוצה כללה לפחות שלושה עכברים.
1. דלדול מיקרוביוטה במעיים
- הכנת קוקטייל אנטיביוטי
- הכינו תמיסה אנטיביוטית בתמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) עם 0.5 מ"ג/מ"ל ונקומיצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לוח הזמנים של FMT המשמש במחקר זה מתואר באיור 1. לאחר הטיפול בקוקטייל האנטיביוטיקה, נותחה יעילות דלדול המיקרוביוטה במעי על ידי ריצוף אזור 16S rRNA. זיהינו 196 מינים באילאום של עכברים נאיביים, בעוד שטיפול אנטיביוטי של 3 ימים הפחית במהירות את מיני החיידקים ל-35 (איור 2A). היו שמונה מינים שזוהו אך ורק בעכברים שעברו טיפול בקוקטייל אנטיביוטי (איור 2A). ניתוח מגוון בטא ברמת הסוג הצביע עוד על כך שהחיידקים השולטים באילאום של עכברים נאיביים, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לאנטיביוטיקה המשמשת בהליך הדלדול יש תכונות אנטיבקטריאליות שונות. ונקומיצין ספציפי לחיידקים גרם חיוביים30. דוקסיציקלין דרך הפה יכול לגרום לשינויים משמעותיים בהרכב המיקרוביוטה של המעי בעכברי C57BL/6NCrl נקבות31. Neomycin היא אנטיביוטיקה רחבת טווח המכוונת לרוב חיידקי המעיים32. עם זאת, זה לא מונע דלקת מעיים. קוקטיילים אנטיביוטיים רחבי ספקטרום יעילים יותר מאנטיביוטיקה בודדת 13,33,34.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו בוצעה בחסות הפרויקט הבין-תחומי המצטיין של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (מענק מס': ZYJC18024) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק: 81770101 ו-81973540).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחט מזרק 5 מ"ל | שנג גואנג ביוטק | 5 מ"ל | |
| 70 ומיקרו; מסננת תאים m | BD biosciences | 352350 | |
| אמפיצילין מלח נתרן | AMERESCO | 0339 | |
| APC Streptavidin | BD biosciences | 554067 | |
| ביוטין אנטי עכבר נוגדן IgA | Biolegend | 407003 | |
| בקר סרום אלביומין (BSA) | Sigma | B2064-50G | |
| C57BL/6J עכברים | צ'נגדו דאשו | ||
| CO2 | Xiyuan ביוטק | ||
| E.Coil גנום DNA | TsingKe | ||
| Eppendorf צינורות | Axygen | MCT150-C | |
| שרפרף DNA מהיר מיני מדריך | QIAGEN | 51604 | |
| מטרונידזול | Shyuanye | S17079-5g | |
| Neomycin סולפט | SIGMA | N-1876 | |
| מחט אוראלית Yuke | biotech | 10# | |
| pClone007 ערכת וקטור TA פשוטה רב-תכליתית | TsingKe | 007VS | |
| פוספט מאגר מלח (PBS) | Hyclone | SH30256 | |
| Precellys lysing kit | Precellys | KT03961-1-001.2 | |
| RT PCR SYBR MIX | Vazyme | Q411-01 | |
| SYTO BC ירוק כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית | תרמו פישר מדעי | S34855 | |
| V338 F פריימר | TsingKe | ACTCCTACGGGAGGCAGCAG | |
| V806 R פריימר | TsingKe | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | |
| Vancomycin hydrochloride | Sigma | V2002< | |
| חזק>ציוד | |||
| BD FACSזרימה ציטומטר | BD biosciences | ||
| vortx | Scilogex | ||
| BIORAD CFX Connect | BIORAD | ||
| מכונת צנטריפוגה | Eppendorf | ||
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| Nanodrop מכונת מדידות חומצות גרעין | Thermo Fisher מדעי | ||
| מכשירים כירורגיים | Yuke biotech | ||
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC 2015 | Version 2015 | ||
| BIORAD CFX qPCR SOFTWARE | |||
| FlowJo software | |||
| Graphpad prism 7 | |||
| Database | |||
| Silva (SSU132) מסד נתונים |
מקורות
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Weng, M. T., et al. Microbiota and gastrointestinal cancer. Journal of the Formosan Medical Association. 118 (1), 32-41 (2019).
- Le....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
