כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקות כימיות וביו-קוניוגציה פותחו במהירות בשנים האחרונות ומאפשרות לבניית פולימרים של חלבונים. בכל אופן, תהליך של חלבון מבוקר. הוא תמיד אתגר בשלב זה פיתחנו מתודולוגיה אנזימטית לבניית שליטת החלבון צעד אחר צעד ברצף הנשלט באופן רציונלי. בשיטה זו, C-טרמינוס של מונומר חלבון הוא NGL עבור הקוניוגציה חלבון באמצעות OaAEP1 (Oldenlandia נדיה affinis asparaginyl endop) 1) בעוד N-טרמינוס היה tev בקליקל (וירוס איכול טבק) באתר מחשוף ועוד L (ENLYFQ/GL) להגנה זמנית N-terminal. כתוצאה מכך, OaAEP1 הייתה מסוגלת להוסיף רק מונומר חלבון אחד בכל פעם, ואז פרוטאז TEV ביקעה את ה-N-טרמינוס בין Q ו-G כדי לחשוף את NH2-בסדר-Leu. ואז היחידה מוכנה. לOaAEP1 הבאה פוליפרוטאין מהונדס נבדק על ידי מתחם חלבון בודד התפתחות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטום מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS). לכן, מחקר זה מספק אסטרטגיה שימושית עבור הנדסת פוליפרוטאין ו השתק.
מבוא
לעומת פולימרים סינתטיים, טבעי מרובת תחומים חלבונים יש מבנה אחיד עם מספר מבוקרת היטב סוג של תת תחומים1. תכונה זו מובילה בדרך כלל לשיפור תפקוד ביולוגי ויציבות2,3. גישות רבות, כגון מבוססי cysteine קשר קשר דיסולפידי בונד וטכנולוגיית ה-DNA רקומביננטי, פותחו לבניית חלבון כזה פולימרין עם תחומים מרובים4,5,6,7. עם זאת, השיטה הקודמת תמיד גורמת לרצף אקראי ובלתי מבוקר, והאחרון מוביל לבעיות אחרות, כולל הקושי להבעת היתר של חלבונים רעילים בגודל גדול וטיהור של חלבון מורכב עם ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הפקת חלבון
-
שיבוט ג'ין
- לרכוש גנים קידוד עבור חלבון העניין (פוי): אוביקוויסין, Rubredoxin (RD)51, מודול מחייב תאית (cbm), הפריצה לתחום X (xdoc) ו לכידות מ Ruמינוקוקוס flavefacience, וירוס איכול טבק (tev) פרוטאז, אלסטין כמו פוליפפטידים (elps).
- לבצע תגובת שרשרת פולימראז ולהשתמש שלוש הגבלה מערכת האנזים האנזימים Bamhאני-bglII-kpni לשילוב מחדש של הגן משברי חלבונים שונים.
- לאשר את כל הגנים על ידי. רצף דנ א ישיר
-
חלבונים ביטוי וייצור
- שינוי הצורה של E. coli BL21 (DE3) עם הביטוי PQE80L-פוי או pET28a פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שאריות NGL הציג בין חלבונים סמוכים על ידי OaAEP1 הקשר לא ישפיע על יציבות החלבון מונומר בפולימר כמו כוח התפתחות (< Fu>), ואת אורך מתאר להגדיל (< ΔLc>) הוא דומה למחקר הקודם (איור 1). תוצאת הטיהור של החלבון rubredoxin מוצג באיור 2. כדי להוכיח את החלבון לאחר מחשוף TEV תואם עם OaAEP1 הקשר הבא כדי לבנות פולימר חלבון עם רצף שליטה הבנייה היא יעילות גבוהה, איור 3 מספק תמונה SDS-PAGE כהפניה. השלבים של הכנת הז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תיארנו פרוטוקול לביוסינתזה אנזימטית והשתק של פוליפרוטאין ואימת את עיצוב הפוליפרוטאין באמצעות SMFS מבוסס AFM. מתודולוגיה זו מספקת גישה הרומן לבניית חלבון-פולימרים ברצף מעוצב, אשר משלים את השיטות הקודמות עבור הנדסת פוליפרוטאין ומשתק4,6,52,53,54,55,56,57,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט No. 21771103, 21977047), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'יאנגסו (גרנט לא. BK20160639) ו Shuangchuang התוכנית של מחוז ג'יאנגסו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ברזל (III), כלוריד הקסהידרט | אנרגיה כימית, | 99% | |
| אבץ כלוריד | אלפא אסאר | 100.00% | |
| סידן כלוריד הידרט, | אלפא אסאר | 99.9965% אגרגט גבישי | |
| חומצה L-אסקורבית | סיגמא מדעי | , Bio Xtra, ≥ 99.0%, גבישי | |
| (3-אמינופרופיל) טריאתוקסיסילן | סיגמא-אולדריץ' | ≥ 99% | |
| סולפוסוקסינימידיל 4-(N-מלימידומתיל) ציקלוהקסאן-1-קרבוקסילאט | תרמו סיינטיפיק | 90% | |
| גליצרול | מקלין | 99% | |
| 5,5'-דיתיוביס (2-חומצה ניטרובנזואית) | Alfa Aesar | ||
| Genes | Genscript | ||
| <חזק>ציוד | |||
| Nanowizard 4 AFM | JPK גרמניה | ||
| MLCT שלוחה | Bruker Corp | ||
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | ||
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | ||
| זכוכית coverslip | מפרש מותג | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Avanti JXN-30 צנטריפוגה | בקמן קולטר | ||
| ג'ל Image | System Tanon |
מקורות
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
