OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

תקציר

טכניקות כימיות וביו-קוניוגציה פותחו במהירות בשנים האחרונות ומאפשרות לבניית פולימרים של חלבונים. בכל אופן, תהליך של חלבון מבוקר. הוא תמיד אתגר בשלב זה פיתחנו מתודולוגיה אנזימטית לבניית שליטת החלבון צעד אחר צעד ברצף הנשלט באופן רציונלי. בשיטה זו, C-טרמינוס של מונומר חלבון הוא NGL עבור הקוניוגציה חלבון באמצעות OaAEP1 (Oldenlandia נדיה affinis asparaginyl endop) 1) בעוד N-טרמינוס היה tev בקליקל (וירוס איכול טבק) באתר מחשוף ועוד L (ENLYFQ/GL) להגנה זמנית N-terminal. כתוצאה מכך, OaAEP1 הייתה מסוגלת להוסיף רק מונומר חלבון אחד בכל פעם, ואז פרוטאז TEV ביקעה את ה-N-טרמינוס בין Q ו-G כדי לחשוף את NH₂-בסדר-Leu. ואז היחידה מוכנה. לOaAEP1 הבאה פוליפרוטאין מהונדס נבדק על ידי מתחם חלבון בודד התפתחות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטום מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS). לכן, מחקר זה מספק אסטרטגיה שימושית עבור הנדסת פוליפרוטאין ו השתק.

מבוא

לעומת פולימרים סינתטיים, טבעי מרובת תחומים חלבונים יש מבנה אחיד עם מספר מבוקרת היטב סוג של תת תחומים¹. תכונה זו מובילה בדרך כלל לשיפור תפקוד ביולוגי ויציבות^2,3. גישות רבות, כגון מבוססי cysteine קשר קשר דיסולפידי בונד וטכנולוגיית ה-DNA רקומביננטי, פותחו לבניית חלבון כזה פולימרין עם תחומים מרובים^4,5,6,7. עם זאת, השיטה הקודמת תמיד גורמת לרצף אקראי ובלתי מבוקר, והאחרון מוביל לבעיות אחרות, כולל הקושי להבעת היתר של חלבונים רעילים בגודל גדול וטיהור של חלבון מורכב עם קופקטור ואנזימים עדינים אחרים.

כדי לענות על האתגר הזה, אנו מפתחים שיטה אנזימטית אשר מעלה באוב חלבון מונומר ביחד עבור פולימר/פוליפרוטאין בצורה מעניינת בעזרת ליגאז חלבון OaAEP1 בשילוב עם פרוטאז tev^8,9. OaAEP1 הוא endopeptidase קפדנית ויעילה. שני חלבונים יכולים להיות מקושרים בעקשנות כמו הרצף Asn-לי-Leu (NGL) דרך שני termini על ידי OaAEP1 בתוך פחות מ 30 דקות אם הטרמינוס N-Leu משקעים (GL) והשני שבו C-טרמינוס הוא שאריות NGL¹⁰. עם זאת, השימוש OaAEP1 רק כדי לקשר מונומר חלבון מוביל לפולימר חלבון עם רצף בלתי מבוקרת כמו שיטת הזיווג המבוסס cysteine. לכן, אנו לעצב את N-הטרמינוס של יחידת החלבון עם האתר של TEV פרוטאז נשלף בתוספת שאריות לאוצין כמו ENLYFQ/G-L-לפוי. לפני המחשוף של TEV, ה-N-terminal לא ישתתף בOaAEP1. ואז שאריות GL ב-N-טרמינוס, אשר תואמים OaAEP1 ליטל נוסף, נחשף לאחר מחשוף TEV. לפיכך, השגנו שיטה ביוסינתזה אנזימטית רציפה של פוליפרוטאין עם רצף מבוקר יחסית.

כאן, שיטת הסינתזה הצעדיטית שלנו יכולה לשמש בהכנה לדגימת פוליפרוטאין, כולל מבוקרת רצף ובלתי מבוקרת, ומשתק חלבונים גם למחקרים חד-מולקולות, במיוחד למערכת המורכבת כגון מטאלופרוטאין.

יתר על כן, ניסויים AFM מבוססי מאפשר לנו לאשר את הבנייה פולימר חלבון בנייה ויציבות ברמה חד מולקולה. מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית כוח, כולל afm, הטוויטר אופטי ו פינצטה מגנטי, הוא כלי כללי בננו-טכנולוגיה כדי לתמרן ביואוכאל מכנית ולמדוד את היציבות שלהם^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. מולקולה בודדת afm כבר בשימוש נרחב במחקר של חלבון (האו ם) קיפול^{21,22,23,24,25}, מדידת כוח של קולטן-ligand^{אינטראקציה 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35}, בונד כימי אורגני^{20,36,37,38,39,40,41,42,43} ו-ligand בונד ב-מטאלופרוטאין^{44,45,46,47,48, 49,50} . כאן, מולקולה יחידה AFM משמש כדי לאמת את רצף פוליפרוטאין מסונתז מבוסס על האות חלבון התגלגלות המקביל.

פרוטוקול

1. הפקת חלבון

1. שיבוט ג'ין
   1. לרכוש גנים קידוד עבור חלבון העניין (פוי): אוביקוויסין, Rubredoxin (RD)⁵¹, מודול מחייב תאית (cbm), הפריצה לתחום X (xdoc) ו לכידות מ Ruמינוקוקוס flavefacience, וירוס איכול טבק (tev) פרוטאז, אלסטין כמו פוליפפטידים (elps).
   2. לבצע תגובת שרשרת פולימראז ולהשתמש שלוש הגבלה מערכת האנזים האנזימים Bamhאני-bglII-kpni לשילוב מחדש של הגן משברי חלבונים שונים.
   3. לאשר את כל הגנים על ידי. רצף דנ א ישיר
2. חלבונים ביטוי וייצור
   1. שינוי הצורה של E. coli BL21 (DE3) עם הביטוי PQE80L-פוי או pET28a פוי.
   2. בחר מושבה אחת לתוך 15 mL של בינונית LB עם אנטיביוטיקה בהתאמה (למשל, 100 μg/mL אמפיצילין נתרן מלח או 50 μg/mL, kanamycin). להמשיך לטלטל את התרבויות ב 200 סל ד ב 37 ° צ' עבור 16-20 h.
   3. לדלל את התרבויות לילה לתוך 800 mL של LB בינונית (1:50 דילול). עבור rubredoxin, צנטריפוגה את התרבות ב 1,800 x g, ואז להשעות מחדש 15 מ ל של M9 בינונית (בתוספת 0.4% גלוקוז, 0.1 MM cacl₂, 2 מ"מ mgso₄), ולאחר מכן לדלל אותו לתוך 800 mL של M9 medium.
   4. מודאת התרבות ב 37 ° c תוך כדי טלטול ב 200 rpm, עד התרבות מגיע צפיפות אופטית ב 600 nm (OD₆₀₀) של 0.6. שמור מדגם 100 μL של התרבות כפקד השראה מראש לבדיקת ביטוי חלבון.
   5. לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת IPTG לריכוז הסופי של 1 מ"מ ולנער את התרבות ב 37 ° c עבור 4 h ב 200 rpm. שריין דוגמה 100 μL של התרבות כבקרת פוסט-אינדוקציה לבדיקת ביטוי החלבון.
   6. צנטריפוגה את התרבות ב 13,000 x g עבור 25 דקות ב 4 ° צ' ולאחסן ב-80 ° צ' לפני הטיהור.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
3. טיהור של חלבון מעניין
   1. השהה מחדש את התאים ב -25 מ ל של מאגר הליזה (50 mM Tris, 150 מ"מ הנאקל, pH 7.4 המכילים DNase, RNase, PMSF) ולהשתמש sonicator (15% משרעת) כדי lyse זה עבור 30 דקות על הקרח.
   2. להבהיר את התא ליפוסט ב 19,000 x g עבור 40 דקות ב 4 ° c.
   3. Pack 1 מ ל (נפח מיטה) של שיתוף-ת א או של Ni-נ. ת. א. האהדה עמודה ולשטוף את העמודה עם 10 כרכים העמודה (קורות חיים) של מים אלקטרופורזה ולאחר מכן 10 קורות של מאגר לשטוף (50 mm טריס, 150 מ"מ הנאל, 2 מ"מ הנאזול, pH 7.4) על
   4. להעביר את החלבון על ידי העמוד על ידי זרימת כבידה במשך שלוש פעמים.
   5. יוצקים מאגר כביסה על העמודה עם 50 קורות חיים כדי להרחיק חלבונים זיהום.
   6. החלבון המאוגד עם 3 קורות חיים של מאגר משחרנן לקרח (20 מ"מ Tris, 400 מ"מ היום, 250 מ"מ הנאזול, pH 7.4). כשמדובר בחלבונים rubredoxin, בנוסף אניון החליפין טיהור באמצעות החליפין אניון הטור ב-pH 8.5 ב 4 ° c הוא הכרחי.
   7. לנתח את המדגם על ידי SDS-PAGE.

2. הפונקציונליזציה של משטח הכיסויים והזיז

1. משטח שמיכות מתפקד בפונקציונליות
   1. התמוססות 20 גרם של אשלגן כרומאט ב 40 מ ל של מים אולטרה טהורים. לאט להוסיף 360 mL של חומצה גופרתית מרוכזת לפתרון כרומט אשלגן עם מוט זכוכית מערבבים בעדינות להכין את חומצה כרומט.
      התראה: הכימיקל המשמש כאן וחומצה כרומאית הסופי הוא מאוד מאכל חומצי. . לעבוד עם ציוד הגנה מתאים הפתרון משחרר חום כאשר מוסיפים חומצה גופרתית מרוכזת, כלומר הוספה איטית והפוגה נכונה לצינון.
   2. לנקות ולהפעיל שמיכות זכוכית ב 80 ° c עבור 30 דקות על ידי טיפול חומצה אנהידריד. לגמרי לטבול את שמיכות ב 1% (v/v) APTES הפתרון במשך 1 h בטמפרטורת החדר תוך הגנה עליהם מפני אור.
   3. לשטוף את שמיכות עם טולואן ואלכוהול אתיל מוחלטים לייבש את שמיכות עם זרם של חנקן.
   4. מודקון את שמיכות ב 80 ° צ' עבור 15 דקות ואז להתקרר לטמפרטורת החדר.
   5. הוסף 200 μL של sulfo-SMCC (1 מ"ג/mL) ב diמתיל סולפוקסיד (DMSO) פתרון בין שני כיסוי קיבוע מחליק ו מודטה עבור 1 h מוגן מפני אור.
   6. לשטוף את כיסוי עם DMSO הראשון ולאחר מכן עם אלכוהול אתיל מוחלט להסיר sulfo-SMCC שיורית.
   7. תייבש את הסרבל. תחת זרם של חנקן
   8. Pipet 60 μL של 200 μM GL-לטפל_50nm-C פתרון חלבון על כיסוי הפונקציונליזציה ו הדגירה עבור כ 3 h.
   9. שטוף את הסרבל עם מים טהורים. כדי להסיר את החומר הבלתי מגיב_{50 ננומטר}
      הערה: כיסוי הפונקציונל מסוגל לשבועיים באחסון ב -4 ° c.
2. הכנה מפני השטח הפונקציונליזציה
   1. נקו את מנוף התלויה ב 80 ° c עבור 10 דקות על ידי טיפול חומצה כרומאית.
   2. הפונקציונליות של הזיז על ידי אמינו-silanization עם 1% (v/v) aptes טולואן הפתרון ולאחר מכן אופים את הזיז ב 80 ° c עבור 15 דקות לפני שעלה באוב ל sulfo-smcc.
   3. לקשר את C-לטפל_50nm-ngl אל פני השטח עם הקבוצה maleimide של SULFO-smcc עבור 1.5 h.
   4. שטוף את החומר הבלתי מגיב_{50 ננומטר}-ngl על שמיכות המים.
   5. לטבול שלוחה פונקציונליזציה ב 200 μL של 50 μM GL-CBM-XDoc פתרון חלבון המכיל 200 nM OaAEP1 ב 25 ° צ' עבור 20-30 דקות. לאחר מכן להשתמש במאגר AFM (100 mM טריס, 100 מ"מ הנאל, pH 7.4) כדי לשטוף את החלבון בלתי הגיב.
      הערה: כימיית המשטח של המנופים והכיסויים דומים.

3. הכנה מפוליפוניים עם רצפים מבוקרים

1. קשר את יחידת החיבור Coh-tev-L-פוי-NGL ל-_{50 ננומטר} לחיטוי על משטח הכיסויים על ידי OaAEP1 עבור 30 דקות.
2. השתמש 15-20 mL של מאגר AFM (100 mM טריס, 100 mM הנאקל, pH 7.4) כדי לשטוף את כל החלבונים הבלתי הגיבו.
3. הוסף 100 μL של פרוטאז TEV (0.5 mM EDTA, 75 mM הנאקל, 25 מ"מ טריס-HCl 10% [v/v] גליצרול, pH 8.0) כדי לקליב את יחידת החלבון באתר TEV לזהות עבור 1 h ב 25 ° c.
4. השתמש 15-20 mL של מאגר AFM לשטוף את שיורית חלבונים.
5. קשר את יחידת החיבור Coh-tev-L-פוי-NGL ל-GL-רוב-NGL-זכוכית על ידי OaAEP1 עבור 30 דקות.
6. חזור על שלבים 3.3 כדי 3.5 N-1 פעמים כדי לבנות חלבון מבנה GL-(רוב)_n-ngl על משטח הזכוכית. להשמיט את התגובה האחרונה TEV מחשוף לשריין cohesin על חלבון-פולימר כמו Coh-tev-L-(רוב)_n-Ngl-זכוכית.

4. AFM ניסוי מדידה וניתוח נתונים

1. מדידות AFM
   1. הוסף 1 מ ל של מאגר AFM לחדר עם 10 מ"מ CaCl₂ ו 5 חומצה אסקורבית מילימטר.
   2. בחר בקצה D של הבדיקה הפונקציונליזציה של AFM לניסוי. השתמש במשפט שווה כדי לכייל את הזיז במאגר afm עם ערך האביב קבוע מדויק (k) לפני כל ניסוי.
   3. הצמד את קצה הזיז למשטח הדגימה כדי ליצור את הזוג Cohesin/הפריצה.
   4. למשוך את הזיז במהירות מתמדת של 400 ננומטר · s-¹ מהמשטח. בינתיים, הקלט את עקומת הכוח בקצב מדגם של 4000 Hz.
2. ניתוח מידע
   1. השתמש בעיבוד נתונים JPK לבחור עקבות הארכת כוח.
   2. השתמש בתוכנה כדי לנתח את העקבות. התאימו את העקומות עם הדגם של השרשרת הדומה לתולעת (WLC) של אלסטיות פולימריות והשיגו כוח התפתחות ותוספת אורך מתאר לפסגת חלבון בודד התגלגלות.
   3. התאימו את היסטגרמות של כוחות התפתחות עם המודל הגאוסיאני כדי להשיג את הערכים הסבירות ביותר של כוח התפתחות (< F_u>) ואת התוספת אורך המתאר (< ΔL_c>).

תוצאות

שאריות NGL הציג בין חלבונים סמוכים על ידי OaAEP1 הקשר לא ישפיע על יציבות החלבון מונומר בפולימר כמו כוח התפתחות (< F_u>), ואת אורך מתאר להגדיל (< ΔL_c>) הוא דומה למחקר הקודם (איור 1). תוצאת הטיהור של החלבון rubredoxin מוצג באיור 2. כדי להוכיח את החלבון לאחר מחשוף TEV תואם עם OaAEP1 הקשר הבא כדי לבנות פולימר חלבון עם רצף שליטה הבנייה היא יעילות גבוהה, איור 3 מספק תמונה SDS-PAGE כהפניה. השלבים של הכנת הז...

דיון

תיארנו פרוטוקול לביוסינתזה אנזימטית והשתק של פוליפרוטאין ואימת את עיצוב הפוליפרוטאין באמצעות SMFS מבוסס AFM. מתודולוגיה זו מספקת גישה הרומן לבניית חלבון-פולימרים ברצף מעוצב, אשר משלים את השיטות הקודמות עבור הנדסת פוליפרוטאין ומשתק^{4,6,52,53,54,55,56,57,...}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ברזל (III), כלוריד הקסהידרט	אנרגיה כימית,		99%
אבץ כלוריד	אלפא אסאר		100.00%
סידן כלוריד הידרט,	אלפא אסאר		99.9965% אגרגט גבישי
חומצה L-אסקורבית	סיגמא מדעי		, Bio Xtra, ≥ 99.0%, גבישי
(3-אמינופרופיל) טריאתוקסיסילן	סיגמא-אולדריץ'		≥ 99%
סולפוסוקסינימידיל 4-(N-מלימידומתיל) ציקלוהקסאן-1-קרבוקסילאט	תרמו סיינטיפיק		90%
גליצרול	מקלין		99%
5,5'-דיתיוביס (2-חומצה ניטרובנזואית)	Alfa Aesar
Genes	Genscript
<חזק>ציוד
Nanowizard 4 AFM	JPK גרמניה
MLCT שלוחה	Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare
AKTA FPLC system	GE Healthcare
זכוכית coverslip	מפרש מותג
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
Avanti JXN-30 צנטריפוגה	בקמן קולטר
ג'ל Image	System Tanon