תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרוסקופ תוך-ויטאל של המעיים באמצעות הדמיה קונפוקלית מאפשרת תצפית בזמן אמת על שפיכת תאים אפיתל ודליפת מחסום בבעלי חיים חיים. לכן, רירית המעיים של עכברים מרדימים מוכתמת באופן מקומי בכתמים לא ספציפיים (acriflavine) ומעקב פלורסנט (rhodamine-B dextran), המותקן על צלחת שטופת תמיסת מלח ותמונה ישירה באמצעות מיקרוסקופ confocal. טכניקה זו יכולה להשלים טכניקות לא פולשניות אחרות כדי לזהות דליפה של חמלה מעיים, כגון מעבר transmucosal של מעקבים דרך הדם. חוץ מזה, הגישה המוצגת כאן מאפשרת התבוננות ישירה של אירועים שפיכת תאים בזמן אמת. בשילוב עם עכברים כתב פלורסנט מתאים, גישה זו מתאימה שפיכת אור לתוך מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים בהבלטת תאי אפיתל מעיים, כמו גם תהליכים ביולוגיים אחרים. בעשורים האחרונים, מחקרים מעניינים באמצעות מיקרוסקופ תוך ויטלי תרמו לידע על חמלה אנדותל, תאי מערכת החיסון המעיים ביות, תקשורת חיסונית-אפיתל ופלישה של רכיבים זוהרים, בין היתר. יחד, הפרוטוקול המוצג כאן לא רק יעזור להגביר את ההבנה של מנגנונים השולטים בהבלטת תאים אפיתל, אלא גם יכול להיות הבסיס להתפתחות של גישות אחרות לשמש ככלים כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד אחרים, אפילו ברקמות אחרות. בין מגבלות טכניות, מאפיינים אופטיים של הרקמה הספציפית, כמו גם טכנולוגיית ההדמיה שנבחרה ותצורת מיקרוסקופ, בתורו, לקבוע את מרחק העבודה הדמיה, ורזולוציה של תמונות שנרכשו.
מבוא
המעי הוא איבר מיוחד מאוד עם פונקציה מוסדרת היטב המאפשרת תהליכים סותרים, כלומר תזונה והגנה מפני חומרים זוהרים מזיקים. רירית בין גוף האדם לסביבה, אפיתל המעי פועל כמחסום פיזי ואימונולוגי ותורם לתחזוקה של הומאוסטאזיס רירית בבטן1,,2. אובדן שלמות אפיתל וחחלת צומת הדוקה מוגברת ידוע להיות קשור עם מחלות מעי דלקתיות (IBD)3,,4,,5,,6. שינויים אפיתל נחשבים לאחר מכן כגורמים ומדלקים משניים לדלקת מעיים כרונית בIBD. לכן, הבנה משופרת של שינויים אפיתל מוקדם בבטן של חולי IBD יהיה בעל ערך עצום לפיתוח אסט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול הבא אושר על ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיות בארלאנגן (רג'ירונג פון אונטרפרנקן, וירצבורג, גרמניה). עכברים היו אוחסנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן.
הערה: עיכוב של prenylation בתיווך GGTase בתוך IECs גורם לשינוי חמור של חחללות מעיים בעכברים iPc24 Pggt1biPc . לכן, מודל עכבר זה שימש כדי להדגים כיצד הפרוטוקול יכול להיות שימושי ללמוד פגמים במחסום מעיים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר של כל קו עכבר אחר.
1. הכנה כירורגית וכתמים מררית מעיים בעכבר
הערה: ההכנה הכירורגית מבוססת על פרוטוקולים שתוארו קודםלכן 25. שמור את העכב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר גישה תוך-ויטאלית מבוססת מיקרוסקופיה כדי לדמיין דליפת אפיתל מעיים ולצפות בביצועי שפיכת תאים בבטן בזמן אמת. בקצרה, עכברים מנופים ומוגשים להכנה כירורגית על מנת לחשוף את פני השטח של ררית המעי הדק. IECs מוכתמים לאחר מכן באמצעות יישום אקטואלי של acriflavine; בעוד rhodamine B-דקסטרן זוהר משמש מעקבים כדי לזהות מעבר transmucosal מן הלומן לחלל תת אפיתל. לכן, ההכנה הכירורגית והעכבר המרדים ממוקמים על שקופית המוצבת בצלחת פטרי ומדמיינת לאורך זמן באמצעות CLSM (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות שמבחינה טכנית מאתגרת, מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצגת גישה ניסיונית ייחודית כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד בזמן אמת, כגון ביצועי שפיכת תאים. עד כה, אין גישה ניסיונית חלופית כדי לדמיין את הבלטת התא ב vivo. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לתרום לתיאור של תהליכים סלולריים מגוונים לשחק תפקיד בתחזוקת ההונואוסטזיס מעיים.
תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acrifl.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מהתוכנית "פעולות מארי קירי" במסגרת הסכם מענק REA מספר 302170 של תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013); המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) של אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג; מרכז המחקר השיתופי TRR241 ו-KFO257 של מועצת המחקר הגרמנית (DFG); וה-די.אף.ג'י.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS |
| Deltaphase איזותרמית Pad | BrainTree | B-DP-PAD-Gemini | |
| Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917-Ketamin | |
| WDT | 9089.01.00 | ||
| LAS X | Leica | - | |
| מיקרוסקופ LSM SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| רודמין B דקסטרן | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל |
| מלקחיים סטנדרטיים (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23-מספריים | |
| עדינים ישרים | Fine Science Tools | 14060-10-Tamoxifen | |
| Sigma Aldrich | T5648 | 50 מ"ג/מ"ל ב אתנול | |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
מקורות
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
