מוצג כאן הוא שיטה יעילה ובטוחה כדי להדביק הזחלים דג זברה עם התווית fluorescently באופן אנאירובי C. הקושי על ידי הזרקת microinjection ו פולשני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Clostridioides קושי זיהום (cdi) נחשב לאחד מזיהומים במערכת העיכול הנפוצים ביותר הקשורים לבריאות בארצות הברית. התגובה החיסונית מולדת נגד הקושי המתואר כבר תוארה, אבל התפקידים המדויקים של נויטרופילים ו מקרופאגים ב-cdi הם פחות מובנים. במחקר הנוכחי, הזחלים danio rerio (zebrafish) משמשים כדי להקים C. בקושי מודל זיהום לדימות התנהגות ושיתוף פעולה של תאים אלה מולדים החיסונית ב vivo. כדי לפקח על C. הקושי, פרוטוקול תיוג באמצעות צבע פלורסנט הוקמה. זיהום המותאם לשפות אחרות מושגת על ידי מיקרוהזרקת מתויג C. הקשיים, אשר באופן פעיל גדל במערכת העיכול דג זברה ומחקה את הנזק האפיתל המעי cdi. עם זאת, פרוטוקול זה זיהום ישיר הוא פולשני וגורם פצעים מיקרוסקופיים, אשר יכולים להשפיע על תוצאות ניסיוני. מכאן, פרוטוקול microgavage שאינו פולשני יותר מתואר כאן. השיטה כרוכה במסירה של C. הקושי תאים ישירות לתוך המעיים של הזחלים דג זברה ידי צנרור דרך הפה הפתוח. זו שיטת הדלקת מחקה היטב את תוואי זיהום טבעי של C. הקושי.
מבוא
ג. הקושי הוא גרם-חיובי, נבג-יוצר, אנאירובי, ו-הרעלן מייצר באקלוס כי הוא הגורם המוביל של זיהומים חמורים במערכת העיכול1. תסמינים טיפוסיים של cdi כוללים שלשול, כאבי בטן, קוליטיס הפסבדו מכרעת, וזה יכול לפעמים להוביל למוות1,2. ראיות הראו כי מארח התגובות החיסונית לשחק תפקיד קריטי הן התקדמות ותוצאה של מחלה זו3. בנוסף לתגובה החיסונית, מיקרוביוטה הבטן הילידית היא חיונית לתחילתה ופתוגנזה של CDI4. בעשור האחרון, הן מספר המקרים ואת שיעור התמותה של cdi גדלו באופן משמעותי בשל הופעתה של זן היפרשני של C. הקושי (BI/NAP1/027)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העבודה בעלי חיים המתואר כאן בוצעה בהתאם לתקנות משפטיות (EU-הוראה 2010/63, רישיון AZ 325.1.53/56.1-אמבטיות ורישיון AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. הכנת ההיתוך נמוך, צלחת ג'ל, ו מיקרוהזרקה/Microgavage מחטים
- התמוססות 0.08 גרם של התכה נמוכה (טבלת חומרים, Agarose A2576) ב-10 mL של 30% בינוני של Danieau (0.12 Mm MgSO4, 0.18 mM Ca [לא3]2), 0.21 מ"מ Kcl, 1.5 mm hepes (pH = 7.2), ו-17.4 מילימטר הנאקל, מאוחסן בטמפרטורת החדר (RT) כדי לקבל את הפתרון של 0.8%.
הערה: ניתן להשתמש בריכוזים גבוהים או נמוכים יותר של agarose. עם זאת, הזמן הנדרש לגבש משתנה למותגים שונים של הצמח, אפילו באותו ריכוז.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ג. הקושי הוא אנאירובית לחלוטין, אבל כרומופור של חלבונים פלורסנט בדרך כלל דורש חמצן להבשיל. כדי להתגבר על בעיה זו, צבע פלורסנט שימש כדי להכתים לחיות C. הקשיים תאים שהיו באופן פעיל גדל (R20291, הריבוסוג 027 זן; איור 1א). באמצעות מערכת Gal4/UAS, שורות הטרנסגניים יציבה שנוצרו עבור הדמיה חיה, שבו mpeg 1.1 או lyz היזמים הסיע את הביטוי של חלבון פלורסנט egfp ב מקרופאגים ו נויטרופילים (בהתאמה) באופן תלוי Gal4.
המוכתם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטות המוצגות לשנות ולהרחיב גישה קיימת כדי להדביק את הזחלים דג זברה על ידי ביצוע שתי הזרקה ו microgavage10,14. זה גם מדגים גישה לחקור פתוגנים אנאירובית עם הזחלים דג זברה22. בנוסף, הפרוטוקול מאפשר ניתוח של תגובות תא החיסון הטבוע בvivo על CDI ועל הקולוניזציה של C. הקושי ב-zebrafish. השיטה היא למעשה קלה לביצוע במעבדה שגרתית או בסביבה קלינית.
כדי לעקוב אחר הפייגוציטוזה של סי. הקושי על ידי לוקיולוצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו אסירי תודה לטימו פריטש. לטיפול מעולה בחיות אנו מודים לחברי מעבדות הקוסטר והסטירטי לתמיכה ולדיונים מועילים. אנו מודים לד ר דנדאן האן על כך. שקריטי לקרוא את כתב היד אנו מודים בהכרת תודה על ידי המדינה הפדרלית של סקסוניה התחתונה, נינידזצ ווראב (VWZN2889).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | ג'ל נמוך במיוחד אגרוז אגרוז |
| נמס נמוך (LM) | Pronadisa | 8050 | הוא משמש בצלחות אגרוז |
| BacLight Red חיידקי | כתם Thermo Fisher Scientific | B35001 | צבע פלואורסצנטי |
| מרק מוח-לב-עירוי | קרל רות' GmbH | X916.1 | |
| פליז (סוג פראי) | חסר בסינתזת מלנין, המשמש ליצירת קווים טרנסגניים יציבים | ||
| סידן חנקתי (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| זכוכית נימית | מכשיר הרווארד | 30-0019 | מחטי הזרקה |
| Clostridioides difficile | R20291,, זן ריבוטייפ 027, ייצור TcdA+/TcdB+/CDT+ DMSO | ||
| Carl Roth GmbH | A994 | ||
| FIJI | פלטפורמת | עיבוד תמונה | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| חולץ מחט אופקי | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | עיבוד תמונה | |
| מגנזיום גופרתי (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| מיקרו מזרק | eppendorf | 5253000017 | |
| תבניות מיקרו הזרקה | כלי מדע אדפטיביים | TU1 | |
| Leica SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| אשלגן כלורי (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | טרנסגני יציב שבו מקדמי lyZ מניעים את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי EGFP בנויטרופילים | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | קו טרנסגני יציב שבו ה-mpeg1.1 מניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי EGFP במקרופאגים | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| BD | Bacto | 212750 |
מקורות
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
