הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60815

⸱

22 בינואר 2020

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Weill Cornell Medical College

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים את היישום של מנתח השטף של מסחטות כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב גליקוליזיס וזרחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר.

תקציר

הזרע מקבל קיבולת הפריה במערכת הרבייה הנשית בתהליך המכונה מדרכיכים. תהליכים משויכים למדרכיכים דורשים אנרגיה. קיים דיון מתמשך בנוגע למקורות היוצרים את ה-ATP המזין את הזרע לתנועתיות מתקדמת, מדרכיכים, היפרהפעלה ותגובה מאקרומה. כאן, אנו מתארים את היישום של מנתח השטף מחילוץ ככלי לניתוח שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך מדרכיכים זרע העכבר. באמצעות H+-ו O2-רגישות fluorophores, שיטה זו מאפשרת בניטור גליקוליזיס ו זרחון חמצוני בזמן אמת ב-non-capacitated לעומת הזרע קיבול. שימוש בשיטה זו בנוכחות מצעים אנרגטיים שונים ו/או מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי יכולים לספק תובנות חשובות לתרומת מסלולים מטבוליים שונים והצטלבות בין איתות מפלי ומטבוליזם במהלך מדרכיכים זרע.

מבוא

היישום של ספקטרומטר המסה יש מהפכה המחקר של חילוף החומרים. ממוקד פרופיל חילוף החומרים והעקיבה metabolomic לאפשר ניטור מדויק של שינויים בחילוף החומרים באנרגיה. עם זאת, ביצוע טבולומיקס בהצלחה דורש הכשרה נרחבת, צוות מנוסה, ו יקר, ספקטרומטר מסה מאוד רגיש לא זמין לכל מעבדה. בשנים האחרונות, באמצעות מנתח השטף של מסחטות, כגון סוסון ים XFe96 גדל פופולרי כשיטה פונדקאית למדידת שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה בסוגי תאים שונים1,2,3,4,5.

זרע הם תאים מיוחדים מאוד משבצת; אשר משימתו היא לספק את הגנום אבהי כדי oocyte. זרע עוזב את מערכת הרבייה זכר לאחר שפיכה הם עדיין בלתי בוגרים מבחינה פונקציונלית ולא ניתן להפרות את oocyte כי הם לא מסוגלים לחדור את הvestments של oocytes. זרע לרכוש יכולת דישון כאשר הם עוברים דרך מערכת הרבייה הנשית בתהליך התבגרות המכונה מדרכיכים6,7. הפליטה הטרייה של זרע או זרע בגזור מיותרת הזנב יכול להיות capacitated בחוץ על ידי דגירה באמצעות המדרכיכים מדיה מוגדר המכיל Ca2 +, ביקרבונט (hco3-) או מחנה חדיר תאים אנלוגי (למשל, diבוטילטור-מחנה), קבלה כולסטרול (למשל, סרום בשור, bsa), ומקור אנרגיה (למשל, גלוקוז). במהלך המדרכיכים, זרע לשנות את דפוס התנועתיות שלהם לתוך להכות המרצפות אסימטריים, המייצג מצב שחייה שנקרא hyperactivation פעלה8,9, והם הופכים להיות מוכשרים כדי לעבור את התגובה האקרוכמה7, שם אנזימים פרוטבחרדה שפורסמו כי לעכל את הבאויות של oocytes. תהליכים אלה דורשים אנרגיה, ובדומה לתאים סומטיים, זרע לייצר ATP ותרכובות אנרגיה גבוהות אחרות דרך גליקוליזיס, כמו גם מחזור TCA מיטוכונדריאלי וזירחון חמצוני (oxphos)10. בעוד מחקרים מרובים מדגימים כי גליקוליזיס הוא הכרחי ומספיק כדי לתמוך זרע מדרכיכים11,12,13,14, התרומה של oxphos הוא פחות ברור. בניגוד לסוגי תאים אחרים בהם גליקולזיס משולב פיזית למחזור ה-tca, הזרע ממדר מאוד ונחשבים לשמור על תהליכים אלה בתאי הריצוף הנפרדים: המיחלק מתמקד במכונות המייטוכונדריאלי, בעוד שהאנזימים המרכזיים של גליקוליזה מופיעים כמוגבלים לחלק העיקרי15,16. מידור זה מביא לויכוח מתמשך על האם פירובט המיוצר בחלק העיקרי מאת גליקולזיס יכול לתמוך באוקפוס מיטוכונדריאלי באמצע החלק, והאם ATP המיוצר על ידי oxphos ב-midpiece יוכל לפזר במהירות מספקת לאורך הפלאללום כדי לתמוך בדרישות האנרגיה בחלקים העיקריים של החלק העיקרי של הקרן17,18,19. יש גם תמיכה של תפקיד של oxphos במדרכיכים זרע. לא רק האוקפוס יותר מאשר באופן אנרגטי יותר מאשר גליקוליזיס, היוצר פי 16 יותר ATP מאשר גליקוליזיס, אך מידות נפח ותוכן מיטוכונדריאלי מתואמים במישרין עם כושר הרבייה במינים היונקים המוצגים דרגות גדולות יותר של התחרות בין הזכרים לחבריםבגיל 20. התייחסות לשאלות אלה מחייבת שיטות לבדיקת התרומות היחסיות של גליקוליזיס ואוקפוס במהלך מדרכיכים זרע.

Tourmente ואח ' להחיל מנתח השטף היטב של ממרור כדי להשוות את חילוף החומרים של האנרגיה של מינים העכבר קשור היטב עם פרמטרים שונים באופן משמעותי ביצועי זרע21. במקום לדווח על הערכים ECAR בסיס ו-OCR של זרע non-capacitated, כאן, אנו להתאים את השיטה שלהם באמצעות 96-היטב מנתח השטף לעקוב אחר שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך זרע העכבר מדרכיכים בזמן אמת. פיתחנו שיטה המאפשרת במקביל לניטור גליקוליזיס ו oxphos בזמן אמת בזרע עם הכאת הדגל של עד 12 מצבים ניסיוניים שונים על ידי מדידת שטף של חמצן (O2) ו פרוטונים (H+) (איור 1a). בשל פירוק של פירובט כדי לקטט במהלך גליקוליזיס וייצור של CO2 באמצעות tca-מחזור, non-capacitated ו capacitated זרע הבלטה+ לתוך מדיה היכולת אשר מזוהים על ידי מנתח השטף החילוץ באמצעות H+-רגיש fluorophores לקצה בדיקה של מחסנית חיישן. במקביל, O2 הצריכה על ידי זרחון חמצוני מזוהה באמצעות fluorophores2-רגיש לקיבוע לאותו קצה בדיקה (איור 1b). זיהוי אפקטיבי של H+ ו נצרך O2 דורש מאגר זרע שונה עם קיבולת אגירה נמוכה ללא ביקרבונט או פנול אדום. כך, כדי לגרום מדרכיכים בהעדר ביקרבונט, אימצנו את השימוש במחנה חדיר מחנה אנלוגי מוזרק יחד עם טווח רחב PDE מעכבי IBMX22. שלוש יציאות הזרקה עצמאיות נוספות מאפשרות הזרקה של מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי, אשר מקלה על זיהוי בזמן אמת של שינויים בנשימה התאית ובקצב גליקוליזיס עקב טיפול ניסיוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הזרע נאסף מ-8-16 בן שבוע-CD-1 עכברים גברים. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של וייל קורנל וועדת השימוש (IACUC).

1. יום לפני השיטת התיאום

  1. הכנת מחסנית חיישן ומנתח השטף של מסחטות כאשר
    1. כדי לימה את מחסנית החיישן, להסיר את מחסנית חיישן מן השטף XFe96 מגלויה מערכת שיטת ומניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.
    2. מילוי מאגר הפתרונות עם 25 מ ל של כפול מזוקקים H2o באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 200 μl של h2o כדי כל טוב של צלחת השירות. מניחים את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת כלי השירות ו-דגירה לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO2 .
      הערה: צריך לשתות מחסנית לפחות 4 h.
    3. מחלק 25 מ ל של מנתח השטף מתוך הזרם מכייל את שפופרת 50 mL ומודלת אותו לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO2 .
  2. הכנת מיקרופלטות מצופות לקונה
    1. לפזר 2.5 מ"ג של קונה ב 5 מ ל של כפול מזוקקים H2O כדי להכין 0.5 Mg/mL (w/v) מניות.
    2. באמצעות הצינורות רב ערוצי, למלא כל היטב של מנתח השטף מגלותאי 96-צלחת לוחית עם 50 μL של הפתרון ה0.5 mg/mL Con A. השאירו את המכסה פתוח ותנו לצלחת להתייבש לילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: לוחות מרובים יכולים להיות מצופים בבת אחת ומאוחסנים ב 4 ° צ' עד ארבעה שבועות עד מוכן לשימוש.
  3. הכנת מאגר זרע
    1. להכין 250 mL של מאבחן השטף מנתח TYH עם הHEPES נמוך המכיל 138 Mm הנאקל, 4.7 Mm kcl, 1.7 Mm cacl2, 1.2 mm KH2הפו4, 1.2 mm mgso4, 5.6 מ"מ גלוקוז, ו 1 מ"מ hepes. מחממים את החוצץ ל37 ° c ומתאימים את ה-pH ל-7.4.

2. יום השיטת הזמן

  1. הכנה לכיול מחסנית
    1. החלף את ה-H2O ב צלחת השירות עם 200 μl של XF מכייל לטוב ומודלת עבור לפחות 1 H ב שאינו CO2 37 ° c חממה.
      הערה: במקום כיונמלה, מסוננים מסונן PBS, pH 7.4 ניתן להשתמש.
    2. חום 50 mL של מאגר TYH ב 37 ° c.
  2. יצירת תבנית גל עבור מנתח השטף החילוץ
    1. להפוך את מנתח השטף החילוץ על ולאפשר את הטמפרטורה לייצב 37 ° c.
    2. פתח את תוכנת הגל ועצב תבנית חדשה על-ידי פתיחת תבנית ריקה (ראה קובץ משלים 1, תבנית גל).
    3. פתח את הכרטיסיה הגדרות קבוצה . הגדרת מדיית שיטת הגדרה כ-tyh; pH 7.4 וסוג תא כמו זרע העכבר, להשאיר אסטרטגיות הזרקה ולקדם טיפולים ריקים. צור קבוצות שונות עבור כל תנאי שיטת הפעולה; בדוגמה זו, יש 6 קבוצות שונות (TYH, TYH + db-מחנה/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-מחנה/IBMX, נמלה/ריקבון, נמלה/Rot + db-מחנה/IBMX); מחנה מחנאות (db-cAMP) ו-3-איזובוטיל-1-מתילקסאתה (IBMX) כדי לגרום מדרכיכים, 2-deoxyglucose (2-DG) כמו מעכב גליקוליזיס, antimycin A (antA) ו rotenone (להירקב) כמעכב של השלישי המורכב והראשון של רשת התחבורה אלקטרון.
      הערה: כדי להתחשב בהבדלים בין בארות, לפחות 7-8 בארות לכל תנאי יש למדוד במקביל.
    4. פתחו את הכרטיסייה של מפת הצלחות והגדירו את מפת הצלחות על-ידי הקצאת קבוצות לבארות ספציפיות.
      הערה: ארבע הבארות הפינתיות (A1, A12, H1, H12) יהיו מלאות במאגר TYH (ללא זרע) ומאוחר יותר ישמשו לחיסור רקע.
    5. פתחו את הכרטיסייה ' פרוטוקול ', הוסיפו 4 מחזורי מדידה שונים, בחרו ביציאה המתאימה וערכו את פרטי המדידה (איור 2, טבלה 1). הדגש מדידה לאחר הזרקה ואין להדגיש את השפה.
    6. שמור את תבנית המילוי, מלא את סיכום הפרוייקט והגדר את מיקום השמירה עבור קובץ התוצאות.
  3. הכנת תרכובות להיטען לתוך מחסנית חיישן
    1. להכין 2 מ ל של 50 mM db-מחנה ידי המסת 9.8 mg של תרכובת במאגר TYH ולהוסיף IBMX לריכוז הסופי של 5 מ"מ.
      הערה: IBMX יש נטייה לזרז לאחר מדולל במאגר TYH. מאיצים יכולים להיות מומס על ידי vortexing ו-הדגירה של TYH/db-מחנה/IBMX פתרון בלוק חום 37 ° c עבור 5 דקות.
    2. להכין 1 מ ל של 500 mM 2-DG ידי המסת 82.1 mg של תרכובת במאגר TYH.
    3. הכינו 1 מ ל של 5 μM של AntA/Rot על ידי דילול שתי התרופות במאגר TYH.
      הערה: תרכובות הם מדולל 10-קיפול על ידי הזרקה לתוך המחסנית מנתח השטף הזרם; לכן, ודא כי פתרונות ההזרקה מרוכזים יותר ב-10x.
  4. בידוד זרע של עכבר
    1. מורדם 3 עכברים זכרים בין 8 ו 16 שבועות על ידי isofלאנה ולהקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר שום תגובה צובט הבוהן זוהה. הסר את מיכל ה, היותרת והמידה
    2. מקום כל תסמונת ב 500 μl של מאגר מראש tyh ב 24-באר צלחת היטב, לשתק את תסמונת לתחתית הצלחת באמצעות זוג מלקחיים ולפתוח את הרקמה על ידי ביצוע 5-7 חתכים קטנים עם מספריים נוצה.
    3. להעביר את הצלחת מיד לתוך החממה2 37 ° c, ולתת לזרע להתפזר עבור 15 דקות.
  5. טעינת מחסנית החיישן
    1. שני מדריכים לטעינת יציאות עבור יציאה A ו-D ויציאה B ו-C מסופקים בערכת השטף מסחטות. לטעינת יציאה מסוימת, הסר את המכסה ממחסנית החיישן ויישר את האות של מדריך הטעינה המתאים של היציאה עם הפינה השמאלית העליונה של המחסנית. בזמן הזרקת, השתמשו בקצות האצבעות של הידיים שאינן מזריקים כדי להחזיק את קו הטעינה של היציאה במקום והכניסו את קצות הפיפטה אנכית לתוך הנמל וטעינת חורי העזר.
    2. יציאה A: שימוש בפיפטה רב-ערוצית, הכנס 20 μL של מאגר TYH לכל עמודה.
    3. Port B: הכנס 22 μL של מאגר TYH לטור 1-4, הכנס 22 μL של 500 mM 2-DG לטור 5-8, ו -25 μL של 5 μM AntA/Rot לעמודה 9-12.
    4. פורט C: להזריק 25 μL של מאגר TYH לתוך כל עמודה עם מספרים אי-זוגיים, להזריק 25 μL של 10 מ"מ db-cAMP/500 μM IBMX לכל עמודה עם מספרים זוגיים.
    5. מניחים את מחסנית חיישן עם לוחית כיול לתוך מנתח השטף החילוץ ולהתחיל את השיטת. כיול לוקח 10-15 דקות.
  6. הכנת לוחות זרע
    1. התמוססות 45 מ"ג של BSA ב 15 מ ל של מאגר TYH (3 מ"ג/mL w/v) ולהכין שלוש שעות של שלושה מ"ל של 3 mL BSA/TYH פתרון כל אחד ב 5 שפופרות צנטריפוגה mL.
    2. לשלב שתי בארות זרע כל אחד 1.5 mL צנטר שפופרת, לספור את הזרע באמצעות המטציטוטומטר ולדלל את הזרע לריכוז של 2 x 107 זרע/mL.
      הערה: השתמשו בטיפים חתוכים לחיתוך זרע כדי למנוע פגיעה בתאים.
    3. צנטריפוגה את הזרע עבור 3 דקות ב 700 x g, להסיר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מאגר tyh. חזור על צנטריפוגה step, הסר את הסופרנטאנט, והעבר את כל השעיית הזרע לצינור צנטריפוגה אחד של 5 מ ל עם 3 מ ל של BSA/TYH.
    4. מקום 180 μL של מאגר TYH לכל פינה היטב (A1, A12, H1, H12) של צלחת מצופה קונה. מקום 180 μL של השעיית זרע לתוך כל באר ריקה של הלוח מצופה קונה (1.2 x 106 זרע/טוב).
    5. צנטריפוגה את צלחת הזרע ב 250 x g עבור 1 דקות, לסובב את הצלחת על ידי 180 °, ו צנטריפוגה שוב ב 250 x g עבור 1 דקות (הבלם הנמוך ביותר 1).
    6. להסיר את לוחית הכיול ממנתח השטף החילוץ ולהוסיף את לוחית הזרע. המשך בסדר.
  7. מיצוי וניתוח מידע
    1. לאחר שסיימת את העיבוד, הסר את המחסנית, פתח את קובץ התוצאות, לחץ על הכרטיסיה ייצוא וייצא את ההפעלה הושלמה כקובץ של מנסרה (קובץ משלים 2: נתונים לדוגמה ראשוניים המשמשים לאיור 3).
    2. שכפל את הקובץ ECAR ו-OCR על-ידי לחיצה על הכרטיסייה החדשה ולאחר מכן את משפחה כפולה . ... tab (איור 3א).
    3. מחק את 7 השורות הראשונות של הנתונים (איור 3ב).
    4. נרמל את נקודת הנתונים לפני הזרקת המחנה/IBMX באמצעות החסרה שורה 1. לחץ על הכרטיסיה ניתוח ולאחר מכן על הכרטיסיה הסר מתמטיקה בסיסית ועמודה . סמן שורות נבחרות: שורה ראשונה, חישוב: יחס: ערך/בסיס ועמודות משנה: התעלם מעמודת משנה. לחץ על אישור (איור 3ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטה זו משתמשת במנתח השטף מתוך לעקוב אחר שינויים בזמן אמת בקצב של גליקוליזיס ו oxphos במהלך מדרכיכים זרע העכבר. איור 4 מראה ניסוי מופתי בו הזרע הcapacitated בנוכחות גלוקוז כמצע האנרגיה היחיד ו-2-DG ו antimycin rotenone כמו מאפלוטורים תרופתי. המצע האנרגיה במאגר מנתח השטף TYH ואת המודולטורים תרופתי ניתן לבחור בחופשיות בהתאם למטרה של הניסוי. הזרע לא capacitated העכבר ב BSA/TYH היו מחוברים לתחתית של מיקרו מצופה החלל הארעי דרך הראש שלהם. בדוגמה זו, ערכי ECAR בסיס ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אובדן של זרע מדרכיכים בהיעדר מצעים מטבולית מסוימים או אנזימים מטבולית קריטיים חשף את חילוף החומרים של האנרגיה כגורם מפתח התומך הפריה מוצלחת. מתג מטבולית במהלך הפעלת התא הוא מושג היטב בסוגי תאים אחרים, עם זאת, אנחנו רק מתחילים להבין איך זרע להתאים את חילוף החומרים שלהם לביקוש האנרגיה הגוברת במהלך מדרכיכים. באמצעות מנתח השטף לחילוץ, פיתחנו כלי ישימה בקלות כדי לפקח על שינויים בגליקוליזיס וזירחון חמצוני בזמן אמת במהלך מדרכיכים זרע. הזיהוי של שינויים ב H+ ו-O2 עם fluorophores לבדוק חיישן הוא פולשני מינימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים מבקשים להכיר בתמיכתם של ד ר לוטו ראמוס-אגריטו במרכז המשאבים של התפוקה והספקטרוסקופיה ברוקפלר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
2-דאוקסי-D-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'D83752-DG
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטיןסיגמא-אולדריץ'I7018IBMX; הכינו תמיסת מלאי של 500 מ"מ ב-DMSO (111.1 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות
Antimycin ASigma-AldrichA8674אנטה; הכינו תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO (2.7 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ'A1470BSA
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ'C1016CaCl2
קונקנקלין A, לקטין מ-Arachis hypogaea (בוטנים)סיגמא-אולדריץ'L7381ConA
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7528
HepesSigma-AldrichH0887
איזותזיההנרי שיין בריאות בעלי חיים1169567761איזופלורן
מגנזיום גופרתיSigma-AldrichM2643MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-מלח נתרן מונופוספט מחזוריSigma-AldrichD0627db-cAMP
אשלגן כלוריSigma-AldrichP9333KCl
אשלגן דימימן פוספטSigma-AldrichP5655KH2PO4
RotenoneCayman Chemical Company13995Rot; הכינו תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO (2 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות
נתרן ביקרבונטSigma-AldrichS5761NaHCO3-נתרן
כלוריSigma-AldrichS9888NaCl
Equipment וחומרים
12 פיפטות ערוצים 10-100 μ LeppendorfES-12-100
פיפטה 12 ערוצים 50-300 μ Lvwr613-5257
37 ° C, ללא CO2 אינקובטורvwr1545
5 מ"ל צינורות צטריפוגהeppendorf30119380
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםvwr76211-286
עם מתאם צלחתThermo ScientificIEC FL40R
ערכת חיתוךמכשירי דיוק עולמייםMOUSEKIT
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך עם 40X אובייקטיביNikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 מ"ל, מחולקThomas Scientific1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 מ"ל, מחולקThomas Scientific1159X95
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100נמכר גם כ-XFe96 FluxPak mini (102601-100) עם 6 במקום 18 קרטיג'ים.

מקורות

  1. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
  3. Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
  4. de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54(2009).
  5. Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
  6. Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
  7. Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
  8. Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
  9. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  10. Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
  12. Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
  13. Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
  14. Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
  15. Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
  16. Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
  17. Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
  18. Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
  19. Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
  20. Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
  21. Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
  22. Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
  23. Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
  24. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
  25. Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
  26. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

2 DeoxyglucoseAntimycin A RotenoneConATYH
באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.