אנו מתארים את היישום של מנתח השטף של מסחטות כדי לנטר שינויים בזמן אמת ב גליקוליזיס וזרחון חמצוני במהלך מדרכיכים זרע העכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הזרע מקבל קיבולת הפריה במערכת הרבייה הנשית בתהליך המכונה מדרכיכים. תהליכים משויכים למדרכיכים דורשים אנרגיה. קיים דיון מתמשך בנוגע למקורות היוצרים את ה-ATP המזין את הזרע לתנועתיות מתקדמת, מדרכיכים, היפרהפעלה ותגובה מאקרומה. כאן, אנו מתארים את היישום של מנתח השטף מחילוץ ככלי לניתוח שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה במהלך מדרכיכים זרע העכבר. באמצעות H+-ו O2-רגישות fluorophores, שיטה זו מאפשרת בניטור גליקוליזיס ו זרחון חמצוני בזמן אמת ב-non-capacitated לעומת הזרע קיבול. שימוש בשיטה זו בנוכחות מצעים אנרגטיים שונים ו/או מפעילים פרמקולוגיים ו/או מעכבי יכולים לספק תובנות חשובות לתרומת מסלולים מטבוליים שונים והצטלבות בין איתות מפלי ומטבוליזם במהלך מדרכיכים זרע.
מבוא
היישום של ספקטרומטר המסה יש מהפכה המחקר של חילוף החומרים. ממוקד פרופיל חילוף החומרים והעקיבה metabolomic לאפשר ניטור מדויק של שינויים בחילוף החומרים באנרגיה. עם זאת, ביצוע טבולומיקס בהצלחה דורש הכשרה נרחבת, צוות מנוסה, ו יקר, ספקטרומטר מסה מאוד רגיש לא זמין לכל מעבדה. בשנים האחרונות, באמצעות מנתח השטף של מסחטות, כגון סוסון ים XFe96 גדל פופולרי כשיטה פונדקאית למדידת שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה בסוגי תאים שונים1,2,3,4,5.
זרע הם תאים מיוחדים מאוד משבצת; אשר משימתו היא לספק את ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הזרע נאסף מ-8-16 בן שבוע-CD-1 עכברים גברים. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של וייל קורנל וועדת השימוש (IACUC).
1. יום לפני השיטת התיאום
-
הכנת מחסנית חיישן ומנתח השטף של מסחטות כאשר
- כדי לימה את מחסנית החיישן, להסיר את מחסנית חיישן מן השטף XFe96 מגלויה מערכת שיטת ומניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.
- מילוי מאגר הפתרונות עם 25 מ ל של כפול מזוקקים H2o באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 200 μl של h2o כדי כל טוב של צלחת השירות. מניחים את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת כלי השירות ו-דגירה לילה ב 37 ° c בחממה שאינה CO2 .
הערה: צריך לשתות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטה זו משתמשת במנתח השטף מתוך לעקוב אחר שינויים בזמן אמת בקצב של גליקוליזיס ו oxphos במהלך מדרכיכים זרע העכבר. איור 4 מראה ניסוי מופתי בו הזרע הcapacitated בנוכחות גלוקוז כמצע האנרגיה היחיד ו-2-DG ו antimycin rotenone כמו מאפלוטורים תרופתי. המצע האנרגיה במאגר מנתח השטף TYH ואת המודולטורים תרופתי ניתן לבחור בחופשיות בהתאם למטרה של הניסוי. הזרע לא capacitated העכבר ב BSA/TYH היו מחוברים לתחתית של מיקרו מצופה החלל הארעי דרך הראש שלהם. בדוגמה זו, ערכי ECAR בסיס .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אובדן של זרע מדרכיכים בהיעדר מצעים מטבולית מסוימים או אנזימים מטבולית קריטיים חשף את חילוף החומרים של האנרגיה כגורם מפתח התומך הפריה מוצלחת. מתג מטבולית במהלך הפעלת התא הוא מושג היטב בסוגי תאים אחרים, עם זאת, אנחנו רק מתחילים להבין איך זרע להתאים את חילוף החומרים שלהם לביקוש האנרגיה הגוברת במהלך מדרכיכים. באמצעות מנתח השטף לחילוץ, פיתחנו כלי ישימה בקלות כדי לפקח על שינויים בגליקוליזיס וזירחון חמצוני בזמן אמת במהלך מדרכיכים זרע. הזיהוי של שינויים ב H+ ו-O2 עם fluorophores לבדוק חיישן הוא פולשני מינימ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מבקשים להכיר בתמיכתם של ד ר לוטו ראמוס-אגריטו במרכז המשאבים של התפוקה והספקטרוסקופיה ברוקפלר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| 2-דאוקסי-D-גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | D8375 | 2-DG |
| 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין | סיגמא-אולדריץ' | I7018 | IBMX; הכינו תמיסת מלאי של 500 מ"מ ב-DMSO (111.1 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | אנטה; הכינו תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO (2.7 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא-אולדריץ' | A1470 | BSA |
| סידן כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | C1016 | CaCl2 |
| קונקנקלין A, לקטין מ-Arachis hypogaea (בוטנים) | סיגמא-אולדריץ' | L7381 | ConA |
| גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| איזותזיה | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 1169567761 | איזופלורן |
| מגנזיום גופרתי | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-מלח נתרן מונופוספט מחזורי | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| אשלגן כלורי | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| אשלגן דימימן פוספט | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; הכינו תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO (2 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בכמויות קטנות |
| נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3-נתרן |
| כלורי | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment וחומרים | |||
| 12 פיפטות ערוצים 10-100 μ L | eppendorf | ES-12-100 | |
| פיפטה 12 ערוצים 50-300 μ L | vwr | 613-5257 | |
| 37 ° C, ללא CO2 אינקובטור | vwr | 1545 | |
| 5 מ"ל צינורות צטריפוגה | eppendorf | 30119380 | |
| 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | vwr | 76211-286 | |
| עם מתאם צלחת | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| ערכת חיתוך | מכשירי דיוק עולמיים | MOUSEKIT | |
| מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך עם 40X אובייקטיבי | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 מ"ל, מחולק | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 מ"ל, מחולק | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | נמכר גם כ-XFe96 FluxPak mini (102601-100) עם 6 במקום 18 קרטיג'ים. |
מקורות
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
