הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון
במאמר זה
סיכום
תקציר
הרחבת קוד גנטי היא כלי רב עוצמה כדי להכניס חומצות אמינו לא טבעיות (כטב"מים) לתוך חלבונים כדי לשנות את המאפיינים שלהם, ללמוד או ליצור פונקציות חלבון חדשות או יש גישה ליחידות חלבון. להפסיק דיכוי קודון, במיוחד דיכוי codon ענבר, התגלה כשיטה הפופולרית ביותר להציג גנטית UAAs בעמדות מוגדרות. מתודולוגיה זו מיושמת בזאת על הכנת חלבון נשא המכיל UAA מחסה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. ידית תגובתית זו יכולה לשמש לאחר מכן כדי להשתיל באופן ספציפי ויעיל אוליגוסכריד hapten סינתטי כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'גייט הומוגני. הפרוטוקול מוגבל לסינתזה של גליקוקוגייטים ביחס חלבון 1:1 פחמימות/נשא, אך ניתן לחוות זוגות רבים של קבוצות תפקודיות ביו-לוגוניות. הומוגניות חיסון Glycocococonjugate הוא קריטריון חשוב כדי להבטיח אפיון פיזיקו-כימי מלא, ובכך, סיפוק יותר ויותר תובעני יותר המלצות הסוכנות הרגולטורית סמים, קריטריון אשר לא נענה על ידי אסטרטגיות התייחדות קלאסיות. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לכוונן היטב את המבנה של החיסון ההתייחדות בפועל, מה שמוליך כלים לטיפול ביחסים בין מבנה לחיסונים.
מבוא
חיסוני גליקוקו-קו-גייט הם מרכיבים חיוניים של ארסנל החיסון הזמין לטיפול מונע במחלות זיהומיות. הם בטוחים, נסבלים היטב ויעילים בקבוצת גיל רחבה כולל תינוקות צעירים. הם מספקים את ההגנה האופטימלית מפני זיהומים הנגרמת על ידי חיידקים ממוססים כמו מנינגוקוקוס, פנאומוקקוס או שפעת המופילוס סוג b1. חיסוני גליקוקוקוג'וג'גייט עשויים מפוליסכרידים חיידקיים מטוהרים הקוביות של חיידקים או אוליגוסכרידים סינתטיים המחקים את הפוליסכרידיםהמבוטאים עלפני השטח 2 , המקושרים באופן קובלנטי לחלבון מוביל. הנוכחות של חלבון נשא חיוני כדי לקדם תגובות חיסוניות הומוריסטיות מגן מכוון נגד הקובע האנטיגני שהביע אנטיגנים פחמימות3.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. סינתזה של UAA: פרופארג'י-לייסין (PrK)
- סינתזה של Nα-Boc-propargyl-ליסין18
- להמיס 500 מ"ג של Boc-L-Lys-OH (2.03 mmol) בתערובת של מים 1 M NaOH (5 מ"ל) ו THF (5 מ"ל) במבחנות ולה להתאים את הבקבוקון עם מחיצה סיליקון.
- מצננים את הבקבוקון באמבט קרח ולאחר מכן מוסיפים 158 μL של פרופארג'י כלורופורם (1.62 מ"מ) תוך כדי ערבוב.
- מחממים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר וממשיכים לערבב במשך 10 שעות.
- לקרר פתרונות של 50 מ"ל של אתר diethyl, 50 מ"ל של חומצה הידרוכלורית 1 M מים ו 60 מ"ל של אצטט אתיל באמבט קרח.
- מצננים את תערובת התגובה הגולמית באמבט קרח ויוצקים את התערובת למשפך הפרדה. לחלץ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרויקט זה, הוכנה חיסון הומוגני גליקוקונג'וג'גייט באמצעות אסטרטגיית דיכוי הענבר להפסיק codon כדי להציג UAA באתר מוגדר (איור 1). דבק פני השטח Pneumoccocal A נבחר כחלבון המוביל moiety. חלבון זה הוא מאוד שמר ומובע על ידי כל הזנים של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס22. הוא חיסוני מאוד בשימוש בעבר כנשא ניסוחים חיסון פנאומוק21,23. כהוכחה לרעיון, UAA propargyl-ליסין טעון ביעילות על ידי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Mutagenesis באתר היא אסטרטגיה פשוטה לשלב חומצות אמינו ספציפיות בעמדה מוגדרת של חלבון אשר נשאר בקושי בשימוש במטרה להכין חיסונים גליקונג'וגייט7,8,14. מוטגנזה קלאסית המבוססת על 20 גישת חומצות אמינו טבעיות יעילה מאוד מאחר שלא נדרש שינוי במכונות התרגום. מוטציות ציסטאין בדרך כלל ממוקדות כדי להמשיך לחקור את תגובתיות thiol ייחודי או ישירות או בשני שלבים (למשל,לאחר השינוי שלה לתוך ביניים דהידרואלאנין, אסטרטגיה הנקראת mutagenesis.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
E.C. מודה בהכרת תודה על התמיכה הכספית של La Région Pays de la Loire (תוכנית פארי Scientifique "BioSynProt"), במיוחד מלגת דוקטורט ל-T.V. אנו גם מכירים ד"ר רוברט B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, טולוז, צרפת) עבור ייעוץ טכני יקר שלו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| AIM (מדיום אינדוקטיבי אוטומטי) | Formedium | AIMLB0210 | אבקה מוצקה |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | אבקה מוצקה |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λ S) |
| קרום | |||
| מסנן DNAseI | |||
| 0.45 ומיקרו; m | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| שרף Ni-NTA | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA חרוזים בתרחיף לתוך 20% אתנול |
| מכשיר | |||
| Pall pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | מחקר | זהה ל-pET24d-mPsaA-WT אך עם מוטציה K32TAG ב גן mPsaA | |
| pET24d-mPsaA-WT | מחקר | pET24d פלסמיד עם הגן Wt mPsaA משובט בין אתרי הגבלה BamHI ו-XhoI עם רצף פרוטאז TEV ואחריו תג His6 בקצה C-terminal של הגן mPsaA ונושא את גן העמידות לקנמיצין | |
| pEVOL פלסמיד | מתנה מאדוארד למקה EMBL (הפניה 19) | פלסמיד עם מקור p15A, שני עותקים של MmPylRS (אחד תחת מקדם GlnS ואחד תחת מקדם pAra), עותק אחד של tRNACUA תחת מקדם ProK, גן העמידות לכלורמפניקול | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
מקורות
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Scienc....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
