ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.

Abstract

היווצרות של קומפלקס eIF4F הוכח להיות צומת במורד הזרם מפתח להתכנסות של מסלולי איתות כי לעתים קרובות לעבור הפעלה oncogenic בבני אדם. eIF4F הוא קומפלקס מחייב כובע מעורב בשלב גיוס mRNA-ריבוזום של ייזום תרגום. במודלים תאיים ופרה-קליניים רבים של סרטן, הסרת הפיקוח על eIF4F מובילה לתרגום מוגבר של תת-קבוצות mRNA ספציפיות המעורבות בהתפשטות סרטן ובהישרדות. eIF4F הוא קומפלקס הטרו-טרימרי שנבנה מתוך eIF4E subunit מחייב כובע, eIF4A הליקאז ואת eIF4G subunit פיגומים. קריטי להרכבה של קומפלקסים פעילים של eIF4F היא אינטראקציית החלבון-חלבון בין חלבוני eIF4E ו- eIF4G. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול למדידת הרכבה eIF4F המפקח על המצב של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים. eIF4e:4G תא מבוסס חלבון חלבון אינטראקציה assay גם מאפשר שינויים המושרה על ידי התרופה בשלמות מורכבת eIF4F להיות מוערך במדויק ואמין. אנו צופים כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת לאימות הפעילות של תרכובות זמינות מסחרית או להקרנה נוספת של תרכובות חדשניות או אופנים כי ביעילות לשבש היווצרות של קומפלקס eIF4F.

Introduction

שליטה בביטוי גנים ממלאת תפקיד מרכזי בביצוע נכון של תוכניות תאיות כגון התפשטות צמיחה ובידול. מנגנון בקרה רגולטורי יכול להיות מופעל או ברמה של שעתוק גנים או ברמה של תרגום mRNA. בעשור האחרון, זה הפך להיות יותר ויותר ברור כי שליטה תרגום על ידי אפנון של תהליך החניכה ולא את הצעדים המאוחרים יותר של התארכות וסיום יכול לווסת דק סינתזה של תת קבוצות ספציפיות של חלבונים לשחק מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות.

תרגום מוגבר של mRNAs המעורבים בהישרדות, תגובות אנטי אוטופגיות ואנטי אפופטוטיות היו מעורבות במספר סוגי סרטן וגם נקשרו באופן סיבתי להפעלה חריגה או לביטוי של גורמי ייזום תרגום¹.

קומפלקס eIF4F הוא וסת ....

Protocol

קו התא HEK293 שימש לפרוטוקול והיה מתורבת בינוני הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין. התאים היו תרבית ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO₂ בסביבה לחה.

1. הערכה כמותית של הפרעה מורכבת eIF4F באמצעות eIF4E:eIF4G^604-646 השלמה

1. תרבות תאים והעברה ארעית של eIF4E:eIF4G^604-646 השלמה
   1. השתמש בתאים מופשרים טריים עם פחות מ -20 קטעים לכל הניסויים. ביום הראשון, קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים רגיל וספור את התאים בני קיימא הכולל באמצעות שיטת אי-הכללה כחולה^{Trypan 13}.
   2. זרעים 6-באר צלחות עם 0.9 - 1.2 x 10⁶ של HEK 29....

Results

על מנת לאמת את הרגישות של מערכת השלמה eIF4E:eIF4G^604-646, עיכוב בתיווך 4EBP1 של הרכבה מורכבת eIF4F הוערך באמצעות מעכבי mTOR. על ידי עיכוב mTORC1 זרחון תלוי קינאז של משפחת החלבון 4EBP, עיכוב mTOR משפר את הקשר 4EBP1 ל- eIF4E, ולכן, פירוק eIF4F¹⁵. נבדקו שני סוגים של מעכבים שונים מבחינה מכנית של mTOR kinases: rapalogs (למשל, Rapamycin) כי הם מעכבי allosteric של mTORC1 אבל לא mTORC2 ו ATP מעכבים מבוססי תחרותי (למשל, PP242) שנועדו במיוחד מעכב הן mTORC1 ו mTORC.......

Discussion

השיטה המתוארת במאמר זה משתמשת בהשלמה מבוססת לוציפראז כדי לפקח כמותית על הרכבה מורכבת של eIF4F באמצעות מדידה ישירה של אינטראקציית eIF4G-eIF4E בתאים חיים. סיפקנו פרטים לשימוש במערכת השלמה eIF4E-eIF4G והראינו גם כי המערכת מדויקת ביותר במדידת ניתוק 4EBP1 בתיווך תרופות של אינטראקציה eIF4E-eIF4G¹⁶. על מנת להקל על התפוקה של מבחנים אלה, ההתקנה הניסיונית המתוארת במאמר זה תוכננה לשימוש בפורמט microplate 96 היטב.

לקבלת תוצאות מיטביות, יש לשקול שני שלבים קריטיים בעת ביצוע הבדיקה. ר.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT תאים	Thermo Fisher Scientific	R70007
מיקרופלייט תרבית תאים 96 באר, F-Bottom	greiner bio-one	655083
טיטר תאים Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	לא ניתן ליישום
Finnpipette F2 פיפטות רב ערוציות 12 ערוצים 30-300 מ"ל	תרמו פישר Scientific	4662070
Finnpipette F2 פיפטות רב ערוציות 12 ערוצים 5-50 מ"ל	תרמו פישר 4662050 מדעי	FUGENE6
	PROMEGA	E2692
ליפופקטמין 3000	תרמו פישר מדעי	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I סרום מופחת מדיון, ללא פנול אדום	תרמו פישר סיינטיפיק	11058021
שייקר אורביטלי	אפנדורף	לא ישים
&גמא;-אמינופניל-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S